UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO CAMPUS DE BOTUCATU

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1 1 UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO CAMPUS DE BOTUCATU Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências IBB Curso de Nutrição Disciplina de Microbiologia Geral de Alimentos Professores Ary Fernandes Júnior* Eduardo Bagagli João Manuel Grisi Candeias Josias Rodrigues Maria de Lourdes R. S. da Cunha Rodrigo Tavanelli Hernandes* Sandra de Moraes Gimenes Bosco* Vera Lúcia Mores Rall Técnico Acadêmico Luiz Alquati Aluno(a): * Docentes responsáveis pela disciplina

2 2 Índice Cuidados a serem seguidos nas aulas práticas... 3 CICLO DE BACTERIOLOGIA Roteiro 1 Morfologia, coloração e estrutura da célula bacteriana... 3 Roteiro 2 Meios de cultura e condições físicas de cultivo bacteriano... 5 Roteiro 3 Ação de um fator intrínseco de alimento sobre as bactérias... 7 Roteiro 4 Higienização das mãos... 8 Roteiro 5 Efeito dos agentes físicos e químicos sobre as bactérias... 8 Roteiro 6 Escherichia coli e Salmonella spp... 9 Roteiro 7 Bacillus cereus Roteiro 8 Staphylococcus aureus CICLO DE MICOLOGIA Roteiro 9 Aspectos macro e microscópicos de fungos Roteiro 10 Reprodução assexuada e sexuada de fungos Roteiro 11 Fungos deteriorantes em alimentos Roteiro 12 Fermentação Roteiro 13 Detecção de fungos em alimentos... 17

3 3 CUIDADOS A SEREM SEGUIDOS NAS AULAS PRÁTICAS 1. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são realizados. 2. Não fume e não coma no laboratório. Evite levar à boca qualquer objeto (lápis, rótulo, dedo, etc.). 3. Não use frascos do laboratório para tomar água. 4. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a mesa ou assoalho, ferimentos de qualquer espécie, aspirações da cultura na boca, etc.). 5. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado. 6. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório. 7. Antes de iniciar suas atividades e depois de terminá-las, limpe com desinfetante o seu local de trabalho. Nota: É OBRIGATÓRIO o uso de avental durante os trabalhos práticos. Após o término das aulas práticas o avental deve ser guardado em sacola plástica. Evite sair de avental pelo Campus e pelas ruas da cidade. Roteiro 1 - Morfologia, coloração e estruturas da célula bacteriana 1. Método de Coloração de Gram Este método de coloração diferencial permite a separação das bactérias em dois grandes grupos: Bactérias Gram POSITIVAS que se coram de AZUL Bactérias Gram NEGATIVAS que se coram de VERMELHO Técnica: - Com o auxílio de uma alça de níquel-cromo flambada (esterilizada), colocar duas gotas de salina na lâmina limpa; - Flambar novamente a alça e, depois de esfriá-la, transferir uma parte de crescimento bacteriano para uma lâmina e misturar com a salina; - Deixar secar; - Fixar o esfregaço, passando a lâmina 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen; - Deixar a lâmina esfriar e cobrir o esfregaço com a solução de violeta genciana por um minuto; - Escorrer a violeta genciana, cobrir o esfregaço com lugol e esperar mais um minuto; - Escorrer o lugol e descorar o esfregaço pelo álcool. Para isto, deixe a álcool cair gota a gota sobre a lâmina inclinada. Considerar o esfregaço suficientemente descorado quando o álcool não retirar mais corante; - Lavar em água corrente; - Cobrir o esfregaço com a solução de fucsina e esperar 30 segundos; - Lavar a lâmina em água corrente e secar com o auxílio de um papel de filtro. - Observar ao microscópio com a objetiva de imersão e desenhar.

4 4 Exercício 1 Faça esfregaços e core-os pela técnica de Gram. Lâmina A Forma: Gram: Lâmina B Forma: Gram: Lâmina C Forma: Gram: Lâmina D Forma: Gram: Lâmina E Forma: Gram:

5 5 Exercício 2 Observar lâminas em preparações específicas para visualização de cápsulas e esporos de bactérias. Desenhar: Cápsulas Esporos Roteiro 2 - Meios de cultura e condições físicas de cultivo bacteriano A) Meios de Cultura Para o cultivo e identificação das bactérias são utilizadas soluções e substâncias nutritivas, denominadas meios de cultura que podem ser classificados com base na sua composição, quanto ao seu estado físico e quanto à capacidade seletiva e diferencial que apresentam. Quanto à composição: 1. Meios Sintéticos: quando as substâncias que os compõem são quimicamente definidas e a concentração e características de cada ingrediente são conhecidas com exatidão. 2. Meios Simples: quando constituídos somente de substâncias essenciais para o crescimento de algumas bactérias. 3. Meios Complexos: quando se adicionam ao meio simples, substâncias orgânicas complexas. Quanto ao Estado Físico: 1. Meios Líquidos: também denominados caldos.

6 2. Meios Sólidos: quando se adiciona ao caldo l,5% a 2% de ágar. 3. Meios Semi-sólidos: quando se adiciona ágar ao caldo, na concentração igual ou menor que 0,5%. Quanto à capacidade seletiva e diferencial: 1. Meios Enriquecidos: são meios simples adicionados de certas substâncias como, por exemplo, soro e sangue. Estes meios servem para o cultivo de bactérias que necessitam de substratos complexos. Ex.: meios de ágar sangue, e de ágar chocolate. 2. Meios Seletivos: são meios de cultura contendo substâncias que impedem o crescimento de certas bactérias, sem inibir o crescimento de outras. Ex.: Meios de MacConkey, de Tetrationato, de Verde Brilhante. 3. Meios Diferenciais: são aqueles que contêm substâncias que indicam a expressão de uma característica particular de uma bactéria, permitindo sua diferenciação de outras. Exemplos: a) Ágar sangue. O sangue adicionado ao meio de cultura indica se uma bactéria é hemolítica ou não. Nesse caso, o meio além de enriquecido é também diferencial. b) Ágar MacConkey. A lactose adicionada ao meio, juntamente com um indicador de ph, permite distinguir as bactérias que fermentam esse açúcar das que não o fermentam. 4. Meios de Enriquecimento: são aqueles que inibem o crescimento de certas bactérias e favorecem o crescimento de outras. Ex.: meios de tetrationato e de selenito que permitem maior crescimento de bactérias do gênero Salmonella. 5. Além desses, existem outros meios de cultura, como por exemplo, meios para conservação de bactérias, meios para a contagem do número de bactérias, etc. B) Condições Físicas de Cultivo Além do meio de cultura, outros fatores devem ser levados em consideração para o cultivo de bactérias, tais como: 1. ph do meio de cultura: deve ser geralmente em torno de Temperatura de crescimento: geralmente 37ºC Quando a temperatura ideal de crescimento das bactérias fica entre: 10 a 20ºC, elas são denominadas de psicrófilas; 20 a 40ºC, são denominadas de mesófilas; 50 a 60ºC são denominadas termófilas. Algumas bactérias apresentam temperatura ideal de crescimento superior a 60ºC. Neste caso são denominadas de hipertermofílicas 3. Teor de Oxigênio: a) Bactérias aeróbias estritas: são aquelas que só crescem na presença de oxigênio. b) Bactérias anaeróbias estritas: crescem somente na ausência de oxigênio. c) Bactérias anaeróbias facultativas: crescem tanto na presença como na ausência de oxigênio. d) Bactérias microaerófilas: crescem somente em atmosfera com baixo teor de oxigênio. 6

7 7 EXERCÍCIOS A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias Comparar a intensidade de crescimento de 3 culturas bacterianas distintas (A, B e C) em três meios líquidos com diferentes composições químicas: caldo sintético, caldo comum e caldo glicosado. Anotar o resultado na tabela abaixo Crescimento em caldo Comum Sintético Glicosado Cultura A B C B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano. Observar o ponto de crescimento de três culturas bacterianas em caldo simples e tiogel e, em função da dependência de O2. Culturas Crescimento Local de crescimento no meio de tiogel no caldo simples Superfície Toda extensão do Base do Meio Meio A D F Roteiro 3 - Ação de um fator intrínseco de alimentos sobre as bactérias 1. Com o auxílio da alça de níquel-cromo, passar um pouco de cultura de Escherichia coli para uma solução de salina esterilizada e agitar. 2. Umedecer uma zaragatoa na mistura, retirando o excesso na parede do tubo. Passar a zaragatoa na superfície de uma placa de ágar PCA (Plate Count agar). 3. A seguir, colocar uma fatia de alho no centro da placa e Incubá-la, por uma noite, na estufa. 4. Observar halo de inibição do crescimento ao redor do alho.

8 Roteiro 4 - Higienização das mãos 8 1. Umedeça uma zaragatoa em um tubo contendo salina. Após retirar o excesso de salina, pressionando a zaragatoa contra a parede do tubo, esfregue-a vigorosamente no dorso de uma das mãos; 2. Passe a zaragatoa em área correspondente à metade de uma placa com ágar nutriente; 3. Umedeça uma segunda zaragatoa em álcool iodado a 0,1% e esfregue no dorso da outra mão; 4. Aguarde 2 minutos para que haja ação do anti-séptico; 5. Passe então, nessa área, uma terceira zaragatoa umedecida, tomando cuidado para não ultrapassar a área higienizada. Inocule, passando a zaragatoa na superfície da outra metade da placa com ágar nutriente; 6. Incube a placa na estufa, durante uma noite. 7. Observe a intensidade de crescimento anotando com sinal + na tabela abaixo. Sem álcool-iodado 0,1% Com álcool-iodado 0,1% Roteiro 5 - Efeito dos agentes físicos e químicos sobre as bactérias A) Ação da temperatura sobre culturas bacterianas, de acordo com o tempo. MATERIAL NECESSÁRIO - Cultura A em ágar inclinado. - Tubo contendo 1 ml de solução salina esterilizada. - Placa de Petri contendo ágar nutriente. - Banho-maria a 60ºC TÉCNICA 1. Transfira, com a alça de níquel-cromo, um pouco do crescimento da cultura A para um tubo contendo 1 ml de solução salina. 2. Agite o tubo brevemente e semeie uma alçada da suspensão no quadrante correspondente ao tempo zero, da placa de ágar nutriente. 3. Coloque o tubo em banho-maria a 60ºC e, aos 10, 20 e 30, retire amostras da suspensão, semeando nos respectivos quadrantes da placa de Petri. 4. Incubar a placa na estufa a 37ºC até o dia seguinte. 5. Observe as variações no crescimento da cultura em cada quadrante da placa, registrando os resultados com sinais positivos (+ a ++++), na tabela abaixo. Intensidade de crescimento em

9 9 B) Ação de um produto químico, disponível comercialmente, sobre culturas bacterianas, de acordo com o tempo. MATERIAL NECESSÁRIO: - Tubo contendo o produto químico, em condições de uso, segundo recomendações do fabricante. - Cultura A e B não esporuladas. - Cultura C, esporulada TÉCNICA: 1. Adicione,1,0 ml de cultura a 10 ml do produto químico e misture bem. 2. Imediatamente e, após 10, 20 e 30, retire amostras da mistura e inocule em quadrantes de placas de ágar nutriente. 3. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte. 4. Observe as placas, registrando as variações na intensidade do crescimento. Cultura A B C Intensidade do crescimento em Roteiro 6 - Escherichia coli e Salmonella Observar os meios de Cultura Ágar MacConkey, EPM, Mili e Citrato de Simmons, semeados com as bactérias A e B. Após a leitura das provas bioquímicas, relacionar os resultados e, por comparação com a tabela, identificar qual corresponde a E. coli e a Salmonella: Bactéria Provas Citrato Glicose Gás Urease H 2 S FDA 1 Mov. 2 LDC 3 Indol Lactose E. coli ou ou - + ou Salmonella + ou FDA: Fenil-alanina desaminase 2 Mov.: Movimento 3 LDC: Lisina descarboxilase

10 Roteiro 7 - Bacillus cereus Observar placas de ágar Mossel semeadas com a cultura de Bacillus cereus e descrever as características das colônias. 2. Corar, pelo método de Gram, esfregaços das culturas C, D e E, observar ao microscópio e desenhar 3. Prova da catalase. Com a alça, pegar pequena quantidade do crescimento e colocar numa lâmina de vidro. Pingar algumas gotas de água oxigenada. Verificar a reação e anotar o resultado. Roteiro 8 - Staphylococcus aureus Observar algumas características de diferenciação do gênero Staphylococcus e da espécie S. aureus Observar placas de ágar sangue semeadas com Streptococcus e Staphylococcus Fazer a prova da catalase Observar um testes positivo e um negativo para a prova da coagulase Roteiro 9 Aspectos macro e microscópicos de fungos A cultura de um microrganismo refere-se à capacidade que este tem de crescer em meios nutritivos artificiais. Esse crescimento é evidenciado macroscopicamente pela formação de uma unidade estrutural, denominada colônia. As colônias de determinados fungos geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através dos seus aspectos macroestruturais de uma colônia, é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Sendo assim, o conhecimento do aspecto macro-morfológico das colônias é de extrema utilidade para a sugestão da identificação preliminar de determinada espécie fúngica. Na observação das características culturais de determinado fungo, pode-se considerar alguns aspectos, resumidos abaixo, os quais podem também ser encontrados no livro de SIDRIM, JJC, BRILHANTE, RSN, ROCHA, MFG. (Cap. 8 - Aspectos Gerais de fungos filamentosos e dimórficos na apresentação filamentosa. In: SIDRIM, JJC, ROCHA, MFG. Micologia Médica a luz de autores contemporâneos. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004, p ). São estes:

11 11 a) tamanho da colônia: pode ser bastante variável na dependência da quantidade e qualidade de substrato ofertado e da espécie fúngica. Por exemplo, os fungos zigomicetos apresentam velocidade de crescimento rápido e suas colônias tendem a ocupar toda a superfície da placa. O mesmo ocorre com as espécies do gênero Aspergillus quando cultivadas a 35 o C. Já o fungo Piedraia hortae apresenta crescimento muito lento, sendo sua colônia restrita ao centro da placa de Petri. b) bordas: na periferia das colônias fúngicas podem ser observados muitos desenhos que vão desde morfologias bem delimitadas até achados de projeções irregulares que lembram franjas. Além disso, também pode ser observada, nas bordas das colônias uma variação da coloração em relação ao centro. Esse achado é peça-chave para indicar o possível patógeno implicado, como por exemplo, nas colônias de Sporothrix schenckii, onde se observa que as bordas tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura. c) textura: é, talvez, o mais importante achado utilizado na caracterização de uma colônia fúngica. A textura descreve a altura das hifas aéreas. As colônias podem ser classificadas quanto à textura em diversos tipos: colônias algodonosas: aquelas que se assemelham com algodão, colônias furfuráceas: aquelas que lembram um punhado de substância farinácea espalhada em uma superfície, colônias penugentas: aquelas nas quais se evidenciam estruturas que lembram penas de aves dispersas na superfície do meio, colônias arenosas ou pulverulentas: aquelas que lembram areia de praia, colônias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido aveludado, colônias membranosas: aquelas que são bem aderidas à superfície do meio de cultura, recobrindo-o como uma película, colônias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriáceo, podendo ter superfície lisa ou irregular e sempre com ausência de filamento, ou seja, não algodonosa, colônias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual cremoso, sendo comumente observados no grupo das leveduras e da maioria das colônias bacterianas. d) relevo: diz respeito à topografia da colônia e pode ser: colônias cerebriformes: apresentam topografia de altos e baixos, fazendo circunvoluções que lembram as observadas no cérebro, colônias rugosas: nada mais são do que variações da cerebriforme, porém as pregas topográficas são menos evidentes, sendo as vezes radiais partindo do centro da colônia, colônias apiculadas: caracterizam-se pela presença de uma saliência na parte central lembrando um pequeno cume, colônias crateriformes: são aquelas que se aprofundam no meio de cultura, assumindo o aspecto de cratera. e) pigmentação: quando se fala em pigmentação de uma colônia fúngica deve-se levar em consideração alguns aspectos primários: - se o pigmento é encontrado na superfície da colônia ou no reverso,

12 - se o pigmento é encontrado tanto na superfície quanto no reverso da colônia, - se o pigmento é ou não difusível no meio de cultura, - se o pigmento está presaente apenas nos esporos e ausente nas hifas, como observado na maioria das espécies de Aspergillus e Penicillium, ou em ambos (hifa e esporos), como observado nas espécies de fungos causadores de cromoblastomicose (Ex. Fonsecae pedrosoi). Observa-se uma grande variedade de cores na pigmentação fúngica que passam pelos tons de verde, amarelo, vermelho e castanho até ao preto. Importante ressaltar que esta caracterização fenotípica da colônia visando a auxiliar na identificação de determinada espécie fúngica apresenta algumas limitações, principalmente devido à ocorrência de variações destas características dentro de uma mesma espécie, devido tanto a efeito ambiental, como também da subjetividade do observador. Dessa forma, deve-se sempre ter em mente que, embora a colônia fúngica possa sugerir, indicar e muitas vezes até acertar o caminho da identificação, não se deve, contudo, considera-la como única ou principal forma de identificação fúngica. Quando empregada como único critério pode levar a diagnósticos pouco precisos ou errôneos. Os aspectos microscópicos são observados em materiais fúngicos (fragmentos de cultura, esfregaços, raspados, etc) sobre lâmina, com ou sem lamínula e coloração. As lâminas são inicialmente observadas no menor aumento e a seguir nos aumentos maiores, sem necessariamente empregar a objetiva de imersão. 12 ASPECTOS MACROSCÓPICOS DAS CULTURAS DE FUNGOS a) finalidade: auxiliar na identificação das colônias fúngicas b) fundamento: Os estudos macroscópicos devem ser baseados nas seguintes características: tamanho, bordas, textura, relevo (na frente e verso da colônia) e pigmentação Exemplo: Frente: colônia de fungo (Filamentoso ou Leveduriforme eveduriforme),, de textura (algodonosa,, aveludada,, pulverulenta,, glabra,, cremosa,, etc), de relevo (cerebriforme, e, rugoso, crateriforme, apiculado,, liso) de coloração (...),, com bordos (regulares ou irregulares). Verso: (presença ou ausências) de fendas ou dobras, e (ausência ou presença) de pigmento difusível no meio de cultura. Exercício 1 - Descrever as características coloniais das culturas de Aspergillus sp. e Sacharomyces sp., conforme o modelo que segue, e desenhar as características microscópicas dos mesmos fungos no espaço abaixo.

13 13 Aspergillus sp. Saccharomyces cereviseae Roteiro 10 Reprodução assexuada e sexuada de fungos 1) Em relação aos fungos zigomicetos apresentados a seguir solicita-se: - tipo de reprodução apresentada: assexuada ou sexuada - nome das estruturas apontadas - observar a lâmina no microscópio e desenhar as estruturas observadas

14 14 Mucor spp. reprodução: ( ) assexuada ( ) sexuada estrutura 1: estrutura 2: Rhizopus spp. reprodução: ( ) assexuada ( ) sexuada estrutura 1: estrutura 2: estrutura 3:

15 15 Pilobollus crystallinus nas fezes de cavalo reprodução: ( ) assexuada ( ) sexuada estrutura 1: estrutura 2: estrutura 3: Qual a relação deste fungo com a luz? Como esse fungo elimina seus esporos no ambiente? 2) Preparar lâmina das lamelas de cogumelos para observação de basídios e basidiósporos. Desenhe no local abaixo as estruturas observadas.

16 Roteiro 11 Fungos deteriorantes em alimentos 16 FINALIDADE: - observar as características macroscópicas dos fungos que estão deteriorando os alimentos, - observar o efeito dessa deterioração provocado no alimento, - observar as estruturas microscópicas dos fungos envolvidos no processo de deterioração. Procedimento: Com auxílio de fita adesiva (Durex ), encostar levemente na superfície da cultura fúngica sobre o alimento e depois transferir essa fita para uma lâmina contendo uma gota de lactofenol azul-algodão. Observar as características microscópicas dos fungos. Desenhar as estruturas observadas. Roteiro 12 Fermentação FINALIDADE: - observar a produção de CO 2 a partir da fermentação da glicose realizada por Saccharomyces cereviseae. Procedimento: Em uma garrafa PET adicionar caldo de cana e a levedura S. cereviseae. Fechar a garrafa com uma bexiga. Observar a produção de CO 2 pelo enchimento da bexiga.

17 Roteiro 13 - Detecção de fungos em alimentos 17 FINALIDADE: avaliar a carga fúngica presente nos diferentes tipos de alimentos. Alimentos avaliados: granola, paçoca, farinha de milho, farinha de mandioca e leite Procedimento: - pesar 10 gramas do alimento (leite= pipetar volume de 10 ml) e colocar em frasco contendo 90 ml de solução salina estéril (diluição 1: ). A partir da diluição 1:10, coletar, com auxílio de pipeta sorológica estéril, um volume de 1,0 ml e transferir para tubo de ensaio contendo 9,0 ml de solução salina estéril (diluição 1: ). A partir da diluição 1:100, coletar um volume de 1,0 ml e transferir para outro tubo contendo 9,0 ml de solução salina estéril (diluição 1: ). Homogeneizar bem em cada diluição e desprezar os 1,0 ml restantes, conforme esquema ilustrado a seguir: Transferir 1,0 ml de cada diluição e cultivar pour-plate com agar Sabouraud, Mycosel e DRBC fundidos. Para a amostra de leite utilizar também o meio CHROMagar Candida. Homogeneizar bem, esperar solidificar, identificar as placas e incubar a 25 o C. Observar o comportamento do crescimento fúngico nos diferentes meios de cultura. A interpretação dos resultados será realizada na próxima aula prática.

18 18 Interpretação dos resultados Proceder a contagem das colônias de fungos e anote nos quadros abaixo. Fazer a estimativa do número de UFC (Unidades Formadoras de Colônias) por grama e/ou ml de alimento. Grupo 1: granola Agar SAB Agar Mycosel Agar DRBC Grupo 2: paçoca Agar SAB Agar Mycosel Agar DRBC

19 19 Grupo 3: farinha de milho Agar SAB Agar Mycosel Agar DRBC Grupo 4: farinha de mandioca Agar SAB Agar Mycosel Agar DRBC

20 20 Grupo 5: leite Agar SAB Agar Mycosel Agar DRBC Chromagar Candida Você já agradeceu a um fungo hoje?!