Pré-processamento e Normalização de Microarrays

Transcrição

1 Pré-processamento e Normalização de Microarrays Ivan G. Costa Filho igcf@cin.ufpe.br Centro de Informática Universidade Federal de Pernambuco

2 Tópicos Microarrays e Ruídos Aquisição dos dados de microarray análise da imagem medição da expressão Pré-processamento e normalização normalização dos dados inter e intra arrays filtros

3 Aquisição e Processamento de Dados A B C Cond A Gene 1 Gene 2 Gene 3... Cond B -1,1 3,1-2,2... Cond C 0,1 3,4-1,9 Extração dos valores de expressão identificação do spot calcular intensidade do sinal normalizar valores entre arrays 1,5 detecção de ruídos 2,1-3...

4 Fontes de Variabilidade (1) Sistemáticos quantidade total de RNA transcriptase reversa etiquetagem (label) processo de escaneamento da imagem Efeitos similares em muitos dados Técnicas de normalização

5 Fontes de Variabilidade (2) Estocásticos defeito em sondas deficiência do processo de detecção de spots cross-hibridização ou hibridização não específica Efeitos específico de cada sonda requerer modelos ruído

6 Fontes de Variabilidade (3)

7 Conceitos Basicos Ruido Pouco Ruido Víes Ausencia de Víes

8 Processamento de Imagem

9 Processamento de Imagem Arquivo GAL identifica o posicionamento das sondas especifico da plataforma Processamento Posicionamento dos grids

10 Processamento de Imagem Arquivo GAL identifica o posicionamento das sondas especifico da plataforma Processamento Posicionamento dos grids

11 Processamento de Imagem Arquivo GAL identifica o posicionamento das sondas especifico da plataforma Processamento Posicionamento dos grids Identificação dos spots Valor do background

12 Identificação Spots Identificar bordas Custoso, boa detecção do sinal Centralizar círculos Simples, baixa qualidade no sinal

13 Valor do Spot

14 Valor do Spot Saturação Calibragem do scanner pode levar muitos pixels a ter valores máximos 16bits 65,535 Mediana resolve com poucos pontos saturados Usar NA no caso de vários valores

15 cdna Leitura - Exemplo verde (cy5) Imagem é dividida em 2 canais (verde e vermelho) Mediana da intensidade de vermelho cada circulo (cy3) Expressão final é dada por cy3mediana/cy5mediana

16 Detecção de Background Problemas: falha na lavagem do array, luminosidade, hibridização não específica Uso de intensidade local como sinal de background

17 cdna Leitura - Exemplo verde (cy5) Imagem é dividida em 2 canais (verde e vermelho) Inclusão de background na vermelho medida (cy3) Expressão final é dada por (cy3sinal-cy3background)/ (cy5sinal -cy5background)

18 Leitura Affymetrix Exemplo PM Grid quadrado é usado para marcar sondas Expressão absoluta MM do gene PM1 = 300 PM1 = 0 PM2 = 2000 PM2 = 100

19 Leitura Affymetrix Exemplo PM Expressão absoluta do gene Formula original pode gerar valores MM negativos PM1 = 300 PM1 = 0 PM2 = 2000 PM2 = 100 w j PM j MM j j A Avg. diff = A w j j A w j= 1if PM j MM j 0 0 if PM j MM j 0

20 u Qualidade de Leitura Fontes de ruído Defeito de fabricação, distribuição, erro no processo de identificação do spot, bolha de ar, poeira, cabelo, buracos negros Qualidade do spot: Luminosidade: razão do sinal/background Uniformidade: variação da intensidade do pixel Morfologia: área, perímetro, forma circular Tamanho do spot: numero de pixels

21 u Qualidade de Leitura Ações: Definir valores como NA (missing values) i.e. (cy3sinal-cy3background) < c normalização locais para reduzir problemas como poeira usar indicadores de qualidade em estágios posteriores da análise.

22 Normalização

23 Preliminares

24 Preliminares

25 Normalização

26 expressão Normalização microarrays

27 Normalização Problemas Intensidade dos canais, calibragem do scanner,... Princípios básicos a maioria dos genes medidos mantem mesma expressão a quantidade total de RNA apresentado é igual

28 Normalização Localização Corrigir viés espacial Escala igualar variabilidade Os microarrays devem ter mesma escala e localização {

29 Normalização Escalonamento Rescalonamento enorm=e norm medianaarray Mediana é usada por ser mais robusto Todos arrays tem a mesma localização

30 Normalização Escalonamento (2) Como medir o fator de escalonamento? todos os genes genes house-keeping controles spike-in Correção do Background global - Usar 5% percentile Local -???

31 Controle de Qualidade Swirl data log(red)/log(gre en)

32 Controle de Qualidade

33 Escalonamento Local Aplicar escalonamento para cada subgrid

34 Escalonamento Local

35 Escalonamento Problemas Scatter Plot MA Plot Normalização global não leva efeitos de intensidade em consideração

36 Normalização Loess Existe um viés dependente da intensidade Viés = f(x) emed= f(x) + ereal Encontra f e calcular emed-f Calcular f com regressão local

37 Normalização Loess Exemplo

38 Normalizacao Metodo de Quantil Todos os histogramas devem ser identicos

39 Normalizacao Metodo de Quantil Normalizacao Metodo de Quantil

40 Normalizacao Metodo de Quantil Normalizacao Metodo de Quantil

41 Normalizacao Metodo de Quantil Normalizacao Metodo de Quantil

42 Normalizacao Metodo de Quantil Normalizacao Metodo de Quantil

43 Normalizacao Estabilizacao de Variancia Usa transformacao arcsin ao invez do log Usa metodos de maxima verossimilhanca para calcular valores de escalonamento e normalizacao Ussume um erro aditivo e multiplicativo

44 Normalizacao Estabilizacao de Variancia

45 Normalizacao Estabilizacao de Variancia

46 Normalizacoes A principio todas as normalizacoes retornam bom resultados Escalonamento local Loess Quantil Estabilizacao de variancia

47 Filtros

48 Filtros Problema no desing da sonda

49 Filtros Alguns genes nao hidridizam com suas sondas Problemas de confeccao da sonda Solucoes Usar sondas multiplas Filtrar genes com baixa expressao Ex. Em affymetrix genes com emed > 200

50 Conclusoes Pre-processamento Obtenco dos dados Requer varios niveis de checagem de qualidade Sonda, array, gene Exercicio importante na analise de dados!

51 Software Bioconductor Implementa maioria dos metodos: vsn, limma, affy, Affymetrix, Agilent tem software proprio implementando metodos.

52 Agradecimentos Slides foram retirados de apresentacoes de Christine Steinhof e Tim Beissbarth