O que é espectroscopia?

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1 Espectroscopia por infravermelho próximo (NIRs) e imagens multiespectrais de sementes Aula 14 3 LPV ANÁLISE DE IMAGENS DE SEMENTES E PLÂNTULAS Programa de pós-graduação em Fitotecnia Francisco G Gomes-Junior Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz O que é espectroscopia? Toda técnica de levantamento de dados físico-químicos através da transmissão, absorção ou reflexão da energia radiante incidente em uma amostra 1

2 Experimento de Herschel Demonstração da existência da radiação no Infravermelho Próximo - NIR O astrônomo inglês William Herschel (1800) bulbo de um termômetro em cada uma das regiões coloridas do espectro solar a temperatura do mercúrio aumentava pela incidência da luz, mas essa era mais rápida quanto mais próxima da extremidade vermelha na região não iluminada depois do vermelho, Herschel descobriu que a temperatura subia ainda mais rapidamente. a radiação invisível que provocava este efeito foi então denominada de infravermelho Aparato típico de espectroscopia de infravermelho Fonte: google 2

3 Espectro de emissão Espectrômetro Espectrógrafo Radiação a ser analisada Decompõe a radiação Gera os espectros Espectro de absorção Espectro Eletromagnético energia f, Hz raios X microondas UV visível NIR MID 3

4 Representação de uma onda eletromagnética Número de onda: quantidade de ondas existentes em 1 centímetro, ou seja, 1/ (cm) Espectroscopia por infravermelho próximo (NIRs) Baseia-se na absorção de luz infravermelha pelos compostos orgânicos Cada composto orgânico possui característica de absorção específica, causando vibrações na ligações de hidrogênio induzidas pelo calor Os componentes são quantificados por meio de equações de calibração (baseadas em métodos de referência) 4

5 Infravermelho e Infravermelho Próximo NIR MID FAR nm cm -1 3,8 x ,2 x ,0 x ,0 x Hz Na região do infravermelho ( 780 a 2500nm) radicais como -OH, -NH, -CH e -CO vibram fortemente Tipos de vibrações moleculares estiramento simétrico estiramento assimétrico tesoura (ou dobramento angular) torção (twist) balanço (wag) rotação 5

6 Modos normais de vibração da molécula de água O O O H H H H H H 3652 cm cm cm -1 Frequências de absorção no IV de algumas ligações químicas Estão representadas frequências vibracionais resultantes de estiramentos (azul), dobras ou deformações em tesoura (vermelho) e em balanço (verde) da ligação 6

7 Sumário das absorções em moléculas orgânicas As absorções estão registradas em números de onda (cm -1 ) Transmitância e absorbância do filme de poliestireno Infravermelho médio 7

8 Espectroscopia por infravermelho próximo na análise individual de sementes Técnica não destrutiva Auxílio para os trabalhos de melhoramento Pesquisa sobre o desempenho germinativo das sementes Identificação de injúrias em sementes Identificação de sementes transgênicas Classificação industrial de sementes (uniformidade e pureza física) Evolução NIRs em análise de sementes Karl Norris (década de 1960): pioneirismo da utilização de NIRs em sementes (determinação do grau de umidade) A instrumentação, os métodos estatísticos e os programas tem sido aprimorados e as aplicações NIRs crescido exponencialmente Atualmente: método analítico confiável e reconhecido pela American Association of Cereal Chemists e American Oil Chemist Association 8

9 NIRs em análise de sementes: aspectos gerais NIRs possuem eficiência comparável com outros métodos analíticos, mas com vantagens adicionais: menor tempo para obtenção de resultados menor preparação das amostras não destrutibilidade da amostra A radiação do infravermelho próximo (780 a 2500 nm) é absorvida pela água e compostos orgânicos como proteínas, carboidratos, lipídios e álcoois A aparente energia absorvida pela amostra, calculada pela radiação transmitida ou refletida pode ser relacionada com o conteúdo dos componentes NIRs em análise de sementes: limitações Baixa acurácia na determinação de componentes com baixa concentração (mg/kg ou ppb) componentes que representam, em peso, menos que 0,1% da semente Sementes com anormalidade na concentração de alguns componentes representam problema na calibração (híbridos específicos ou sementes transgênicas) Soja: NIRs não detecta o gene RR ou DNA modificado, mas o efeito que o gene causa no tegumento da semente O tamanho da semente afeta a acurácia da calibração 9

10 Esquema para padronização da análise NIRs Conhecimento da quantidade real do componente da amostra: métodos de referência Validação do modelo de calibração: standard error of prediction (SEP) ou cross validation (SECV), systematic errors (bias), coefficient of correlation (R) e determination coeficiente (R 2 ) Desenvolvimento de modelos de calibração Algoritmos de calibração: multiple linear regression (MLR), principal componet regression (PCR) e partial least squares (PLS) Componentes quantitativamente analisados por NIRs em semente individual de soja Atributo SEP R 2 Melhor uso Tecnologia Proteína 0,3-1,57% Controle de qualidade DAR, GMR, GMT, FTR, FTT Umidade 0,32-0,88% Controle de qualidade DAR, FTR, DBT Lipídio 0,2-1,4% Controle de qualidade DAR, FTR, FTT, GMR Massa 10-16mg 77,5-91 Controle de qualidade DAR, GMR, FTT Isoflavonas 0,017% 99,7 Controle de qualidade FTR Adaptado de Agelet e Hurburgh Jr. (2014) SEP: standard error of prediction DAR: diode array reflectance; FTR e FTT: Fourier-Transform reflectance and transmittance; GMR e GMT: gratting monochromator reflectance and transmittance; 10

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14 Imagem multiespectral luz ambiente 660nm (banda específica para água) 14

15 Absorbância Resposta relativa 10/11/2015 Imagem colorida tradicional Utiliza três filtros para as bandas Red, Green e Blue Limite do Infravermelho Comprimento de onda (nm) Imagem RGB Imagem colorida tradicional Espectro de absorção da clorofila Clorofila b Clorofila a Clorofilas a e b apresentam quase o mesmo sinal RGB Comprimento de onda (nm) 15

16 Absorbância 10/11/2015 Imagem multiespectral ultravioleta infravermelho Imagem multiespectral Espectro de absorção da clorofila Clorofila b Clorofila a Comprimento de onda (nm) Em comprimentos de onda específicos as clorofilas a e b apresentam diferentes sinais e podem sem identificadas 16

17 Imagem multiespectral e Imagem hiperespectral Imagem hiperespectral Equipamentos NIR imagens hiperespectrais Associam as funcionalidades do infravermelho próximo (NIR) com a geração de imagens 17

18 Reflectância Reflectância 10/11/2015 Principais diferenças entre imagem multiespectral e hiperespectral Formada relativamente por poucas bandas (normalmente entre 3 e 20) e não são necessariamente bandas contíguas umas às outras É possível obter os valores de intensidade nos comprimentos de onda discretos Normalmente é formada por um maior número de bandas (centenas) e estas são sempre contíguas Obtém o espectro contínuo ou assinatura espectral do objeto de análise MULTIESPECTRAL HIPERESPECTRAL Comprimento de onda (nm) Cada pixel tem uma banda espectral discreta Comprimento de onda (nm) Cada pixel tem espectro contínuo 18

19 Comparação de tecnologias espectrais Diferenças: faixa do espectro e número de bandas 19

20 VideometerLab Imagem multiespectral Liu et al. (2014) Imagens: 19 comprimentos de onda ( nm) 1 imagem em cada comprimento de onda Identifica objetos (ou partes do objeto) com base no seu espectro de reflexão Band Name Wavelength 1 UV UV UB Blue Blue Blue-Green Green Green Yellow Red Red Red Red NIR NIR NIR NIR NIR NIR

21 375 nm 405 nm 435 nm 450 nm 470 nm 505 nm 525 nm 570 nm 590 nm 630 nm 645 nm 660 nm 700 nm 780 nm 850 nm 870 nm 890 nm 940 nm 970 nm 21

22 Intensidade média 10/11/2015 Identificação de fungos em sementes de espinafre Olesen et al. (2011) Alternaria Cladosporium Fusarium Stemphylium Sem infecção Verticilium visível NIR Comprimento de onda (nm) Olesen et al. (2011) 22

23 Número de pixels Número de pixels 10/11/2015 Alternaria spp. Cladosporium spp. Fusarium spp. Verticillium spp. Stemphylium spp. Sem infecção Intensidade do pixel Olesen et al. (2011) Dois tipos de colônia bacterianas (bandas RGB) Identificação das colônias (banda infravermelha) 23

24 RGB Infravermelho trigo Identificação de sementes pesadas (azul) e leves (vermelho/laranja) RGB Infravermelho cevada Identificação de infecção por Fusarium 24

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26 Identificação de espigas de trigo infectadas por Fusarium Cinza escuro/vermelho: infecção pelo fungo Escala de cinzas (HBI) RGB Cinza claro/verde: sem infecção 26

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