POTENCIAL ANTIOXIDANTE E TOXICIDADE DO EXTRATO AQUOSO DE SYZYGIUM CUMINI (L.) SKEELS E SPONDIAS MOMBIN L. FRENTE À ARTEMIA SALINA LEACH.

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1 POTENCIAL ANTIOXIDANTE E TOXICIDADE DO EXTRATO AQUOSO DE SYZYGIUM CUMINI (L.) SKEELS E SPONDIAS MOMBIN L. FRENTE À ARTEMIA SALINA LEACH. M. M. Sousa 1, L. M. V. Galvão 2, A. C. P. Sousa 3, A. Lima 4, N. N. Nogueira 5 1 Departamento de Nutrição Universidade Federal do Piauí CEP: Teresina PI - Brasil, Telefone: (86) mariana_msousa@yahoo.coom.br. 2 Departamento de Farmácia Universidade Federal do Piauí. 3 Idem ao 1. 4 Departamento de Hospitalidade, lazer e produção alimentícia. Instituto Federal do Piauí. 5 Idem ao 1. RESUMO Os frutos da região nordeste, possuem conteúdo elevado de compostos bioativos com ação antioxidante, devido às condições edafoclimáticas. Dentre os frutos dessa região, destacam-se a cajá (Spondias mombin L.) e o jamelão (Syzygium cumini (L.) Skeels), ricos em fitoquímicos. Essa pesquisa visou avaliar o potencial antioxidante e a toxicidade do extrato aquoso de Syzygium cumini (L.) Skeels e Spondias mombin L. frente à Artemia Salina Leach. Os polifenois totais foram analisados por Folin Ciocalteu em meio alcalino. Os flavonoides totais foram quantificados pelo método do tricloreto de alumínio (AlCl 3 ). A atividade antioxidante foi determinada pelos ensaios DPPH, ABTS e FRAP. O bioensaio de toxicidade foi realizado com A. salina. Os extratos aquosos do jamelão e da cajá são atóxicos e são fontes promissoras de polifenois com ação antioxidante, podendo ser utilizado no desenvolvimento de novos produtos alimentícios ou fitoterápicos. ABSTRACT The fruits of the Northeast region, have high content of bioactive compounds with antioxidant activity due to soil and climate conditions. Among the fruits of this region, we highlight caja (Spondias mombin L.) and jambolan (Syzygium cumini (L.) Skeels), rich in phytochemicals. This research aimed to evaluate antioxidant potential and toxicity of the aqueous extract of Syzygium cumini (L.) Skeels and Spondias mombin L. front of Artemia Salina Leach. Total polyphenols were analyzed by Folin Ciocalteu reagent in alkaline medium. Total flavonoids were quantified by method of aluminum trichloride (AlCl 3 ). Antioxidant activity was determined by testing DPPH, ABTS and FRAP. Toxicity bioassay was performed with A. salina. Aqueous extracts of jambolan and caja are nontoxic and are promising sources of polyphenols with antioxidant and can be used in the development of new food products or herbal medicines. PALAVRAS-CHAVE: jamelão; caja; ação antioxidante. KEY WORDS: jambolan; caja; antioxidant action. 1. INTRODUÇÃO Os antioxidantes naturais possuem foco crescente entre os consumidores e a comunidade científica, devido estudos epidemiológicos indicarem que o consumo freqüente

2 dessas substâncias está associado ao menor risco de doenças crônicas degenerativas. Compostos fitoquímicos, como polifenois e flavonoides, são os responsáveis por esse efeito à saúde (ZHANG; TSAO, 2016). Frutos da região nordeste, possuem conteúdo elevado de compostos bioativos com ação antioxidante, devido às condições edafoclimáticas. Dentre os frutos dessa região, destacam-se a cajá (Spondias mombin L.) e o jamelão (Syzygium cumini (L.) Skeels), ricos em fitoquímicos, que podem ser empregados na elaboração de alimentos, fármacos ou fitoterápicos. Na perspectiva de desenvolvimento de novos produtos, é fundamental a realização de ensaios de toxicidade para verificar a segurança desses frutos. O bioensaio com Artemia salina Leach, microcrustáceo cosmopolita de água salgada, indica possíveis ações biológicas como cancerígena, inseticida, moluscida e antifúngica (ROSA et al., 2016). Essa pesquisa visou avaliar o potencial antioxidante e a toxicidade do extrato aquoso de Syzygium cumini (L.) Skeels e Spondias mombin L. frente à Artemia Salina Leach. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material Os frutos, jamelão e cajá, foram adquiridos no comércio local de Teresina-PI, em novembro de 2015 e abril de 2016, respectivamente. Os frutos foram higienizados com hipoclorito de sódio (100 ppm.10min -1 ) e separados manualmente dos caroços. A polpa dos frutos foi liofilizada, triturada em moinho analítico e acondicionada em embalagem plástica de polietileno e poliamida, termoselada e armazenada a -18 ºC até as análises. 2.2 Métodos Obtenção do extrato: A extração foi realizada na proporção de 1:100 (amostra:solvente, m.v -1 ), utilizando água deionizada. As amostras foram homogeneizadas em agitador magnético, a temperatura ambiente (25 ºC) por 1 hora, seguida de sonicação a 80%, por 20 minutos. Foram centrifugadas (1200g.s -1 /15 minutos) e filtradas à vácuo em funil Büchner. O sobrenadante obtido foi ressuspendido em água deionizada a 50 ml e armazenado em vidro âmbar a - 18 ºC até o momento das análises. Determinação do conteúdo total de polifenois: Os polifenois totais foram analisados por Folin Ciocalteu em meio alcalino, mensurados a 720 nm e expressos em mg de ácido gálico.100 g -1 de amostra (SWAIN; HILLS, 1959). O cálculo do teor total de fenólicos foi feito a partir da equação de regressão linear da curva padrão de ácido gálico (y = 0,0047x - 0,004; r = 0,9998), preparada nas concentrações de 5 a 180 μg.ml -1 em função da densidade óptica para essas concentrações. Determinação do conteúdo total de flavonoides: Os flavonoides totais foram quantificados pelo método do tricloreto de alumínio (AlCl 3 ), mensurados a 510 nm e expressos em mg de catequina.100 g -1 de amostra (ZHISHEN et al., 1999). O cálculo do conteúdo total de flavonoides foi feito a partir da equação de regressão linear da curva padrão de catequina (y = 3,575x 0,0079; r = 0,9983), preparada nas concentrações de 0,02 a 0,12 mg.ml -1 em função da densidade óptica para essas concentrações. Atividade scavanger do radical DPPH : A capacidade antioxidante pelo método de sequestro do radical DPPH foi realizada segundo Kim et al. (2002), mensurada a 517 nm, após 30 minutos do início da reação. O cálculo da atividade antioxidante foi feito a partir da equação de regressão linear da curva padrão de trolox (y = 0,0007x - 0,0031; r=0,9999), preparada nas concentrações de 40 a 800 μmol.l -1, em função da densidade óptica para essas concentrações. Os resultados foram expressos em TEAC, em μmol de Trolox.100 g -1 de amostra. Atividade scavanger do radical ABTS + : A atividade antioxidante dos licores foi realizada pelo método de sequestro do radical ABTS + de acordo com Re et al. (1999), mensurada a 734 nm, após 6 minutos do início da reação. O cálculo da atividade antioxidante

3 foi feito a partir da equação de regressão linear da curva padrão de trolox (y = 0,0009x - 0,0722; r=0,9985), preparada nas concentrações de 25 a 700 μmol.l -1, em função da densidade óptica para essas concentrações. Os resultados foram expressos em TEAC, em μmol de Trolox.100 g -1 de amostra. Potencial de redução do ferro (FRAP): A avaliação da capacidade redutora do ferro foi avaliada segundo Arnous et al. (2002). As amostras reagiram por 30 minutos com solução de cloreto de ferro (3 mm), em banho-maria a 37 ºC. Adicionadas à solução ácida de TPTZ, após 10 minutos, mensuradas a 620 nm. O cálculo do potencial redutor foi feito a partir da equação de regressão linear da curva padrão de trolox (y = 0,0023x + 0,1699; r=0,9999), preparada nas concentrações de 30 a 625 μmol.l -1, em função da densidade óptica para essas concentrações. Os resultados foram expressos em TEAC, em μmol de Trolox.100 g -1 de amostra. Ensaio toxicológico frente à Artemia Salina Leach: O bioensaio de toxicidade foi realizado conforme Meyer et al. (1982). Após eclosão dos ovos e tempo para as larvas alcançarem o estádio de metanáuplio (48 h), 10 larvas foram transferidas para tubos de ensaio. O teste foi feito em triplicata, contendo solução salina e respectiva amostra nas concentrações de 10, 100, 500, 1000, 1500 e 2000 μg,ml -1. O controle positivo foi realizado com dicromato de potássio a 10 μg.ml -1 e o controle negativo com solução salina. Após 24h de contato dos nauplios, contou-se os animais mortos. Análise estatística: Para análise dos compostos bioativos e poder antioxidante in vitro dos licores foram construídas curvas de calibração para obtenção de equações, correlações e regressões lineares. Os resultados médios encontrados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e aplicação do teste de Tukey. Os dados obtidos do bioensaio toxicológico frente à Artemia saliina Leach foram submetidos a análise de probitos e determinados os valores da concentração letal (CL 50 ). Para todos os testes realizados considerou-se como diferença significativa p<0, RESULTADOS E DISCUSSÃO O conteúdo total de polifenois e flavonoides para o extrato aquoso da polpa de jamelão e cajá está expresso na Tabela 1. Tabela 1 Polifenois totais (mg EAG.100 g -1 ) e flavonoides totais (mg ECE.100 g -1 ) no extrato aquoso de Syzygium cumini (L.) Skeels e Spondias mombin L. Polifenois totais (mg EAG.100 g -1 ) Flavonoides totais (mg ECE.100 g -1 ) Syzygium cumini (L.) Skeels 595,43 ± 0,34 b 157,67 ± 1,31 b Spondias mombin L. 1135,11 ± 8,62 a 220,13 ± 0,00 a *Letras minúsculas diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente entre si (p<0,05). Conforme observado na Tabela 1, a cajá apresenta elevado conteúdo dos compostos bioativos analisados, diferindo estatisticamente (p<0,05) do jamelão. Esse resultado demonstra que a maior parte dos compostos fenólicos dessa fruta são hidrossolúveis. Vasco et al. (2008), ao analisarem o teor de fenólicos totais de dezessete frutos provenientes do equador, classificaram seus frutos em três categorias: baixo (<100 mg EAG.100 g -1, médio (100 a 500 mg EAG.100 g -1 ) e alto (>500 mg EAG.100 g -1 ) conteúdo de compostos fenólicos para amostras frescas. Dessa forma, o extrato aquoso de ambos os frutos é considerado fonte alta desses antioxidantes naturais. Esse resultado para o extrato aquoso de jamelão e cajá é bastante promissor, pois a forma de consumo dessas frutas é in natura ou na forma de sucos, o que proporciona maior ingestão de fitoquímicos, que previnem reações oxidativas e formação de radicais livres, protegendo o DNA celular (EFRAIM et al., 2011).

4 A capacidade antioxidante é definida pela habilidade que alguns compostos redutores, presentes em alimentos e/ou sistemas biológicos, possuem para sequestrar os radicais livres, reduzindo o estresse oxidativo e o desenvolvimento de algumas doenças (FLOEGEL et al., 2011). Atualmente, não existe um método oficial para determinar essa capacidade antioxidante em alimentos de origem vegetal e seus subprodutos, tendo em vista os vários mecanismos antioxidantes que podem ocorrer, bem como a diversidade de compostos bioativos. Entre os ensaios espectrofotométricos mais utilizados, se destacam os que utilizam os radicais livres sintéticos DPPH e ABTS +, pela facilidade de execução e pela boa correlação com as demais metodologias para avaliar a atividade antioxidante, e o ensaio FRAP que mensura o potencial redutor do ferro (SOUSA et al., 2011). Os resultados da atividade antioxidante dos extratos aquoso do jamelão e da cajá encontram-se dispostos na Tabela 2. Tabela 2 Atividade antioxidante do extrato aquoso de Syzygium cumini (L.) Skeels e Spondias mombin L. DPPH ABTS FRAP Syzygium cumini (L.) Skeels 5,67 ± 0,20 bb 43,67 ±0,23 ba 5,70 ± 0,21 bb Spondias mombin L. 14,65 ± 0,35 ac 37,15 ± 0,54 aa 32,70 ± 0,85 ab *Letras minúsculas diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente entre si (p<0,05); Letras maiúsculas diferentes na mesma linha diferem estatisticamente entre si (p<0,05). Conforme observado na Tabela 2, a cajá apresentou maior atividade antioxidante que o jamelão (p<0,05) nos ensaios DPPH e FRAP. No ensaio ABTS o potencial scavanger dos frutos foram semelhantes estatisticamente (p>0,05). A capacidade de sequestro dos radicais livres é diferenciada entre frutos e entre extratos do mesmo fruto devido à diversidade dos compostos bioativos extraídos. Wu et al. (2004), avaliando a ação antioxidante de frutas disponíveis no mercado dos Estados Unidos, evidenciaram que a fração hidrofílica é responsável por mais de 90% da capacidade antioxidante total das frutas estudadas. Esses resultados corroboram com o encontrado nesse estudo, uma vez que os polifenois hidrofílicos da cajá proporcionaram maior capacidade antioxidante. No ensaio de toxicidade ao microcrustáceo Artemia salina Leach (Tabela 3), os extratos aquoso de cajá e jamelão obtiveram DL 50 superior a 1000 μg.ml -1. De acordo com Nguta et al. (2011) amostras com valores de DL 50 inferiores a 100 μg.ml -1 são considerados altamente tóxicas, valores entre 100 e 500 μg.ml -1 são moderadamente tóxicas, entre 500 e 1000 μg.ml -1 são suavemente tóxicas e acima de 1000 μg.ml -1 são atóxicas. Tabela 3 CL 50 do extrato aquoso de Syzygium cumini (L.) Skeels e Spondias mombin L. frente à Artemia salina Leach. *CL50 (μg.ml -1 ) Limite inferior **IC (μg.ml -1 ) Limite superior **IC (μg.ml -1 ) Syzygium cumini (L.) Skeels Spondias mombin L *CL - Concentração letal média para 50% dos nauplios; **IC Intervalo de confiança a 95%.

5 4. CONCLUSÕES Os extratos aquosos do jamelão e da cajá são atóxicos e são fontes promissoras de polifenois com ação antioxidante, podendo ser utilizado no desenvolvimento de novos produtos alimentícios ou fitoterápicos. 5. AGRADECIMENTOS À Capes e a FAPEPI pelo auxílio financeiro. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARNOUS, A.; MAKRIS, D. P.; KEFALAS, P. Correlation of Pigment and Flavanol Content with Antioxidant Properties in Selected Aged Regional Wines from Greece. Journal of food composition and analysis, v. 15, p , EFRAIM, P.; ALVES, A. B.; JARDIM, D. C. P. Polifenóis em cacau e derivados: teores, fatores de variação e efeitos na saúde. Brazilian Journal of Food Technology, v. 14, n. 3. p , FLOEGEL, A.; KIM, D.; CHUNG, S.; KOO, S. I.; CHUN, O. K. Comparison of ABTS/DPPH assays to measure antioxidant capacity in popular antioxidant-rich US foods. Journal of Food Composition and Analysis, v. 24, p , KIM, D.-O.; LEE, K. W.; LEE, H. J.; LEE, C. Y. Vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of phenolics phytochemicals. Journal of Agricultural Food and chemistry, v. 50, p , MEYER, B. N.; FERRIGINI, N. R.; PUTNAM, J. E.; JACOBSEN, L. B.; NICHOLS, D. E.; McLAUGHLIN, J. L. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Médica, v. 45, n. 5, p , NGUTA, J.; MBARIA, J..; GAKUYA, D.; KIAMA, S. Biological screeing of Kenya medicinal plants using Artemia salina L. (Artemiidae). Pharmacologyonline, v. 2, p , RE, R.; PELLEGRINI, N.; PROTEGGENTE, A.; PANNALA, A.; YANG, M.; RICE-EVANS, C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation descolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, v. 26, p , ROSA, C. S.; VERAS, K. S.; SILVA, P. R.; LOPES NETO, J. J.; CARDOSO, H. L. M.; MAIA, J. G. S.; MONTEIRO, O. S.; MORAES, D. F. C. Composição química e toxicidade frente Aedes aegypti L. e Artemia salina Leach do óleo essencial das folhas de Myrcia sylvatica (G. Mey) DC. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 18, n. 1, p. 1-9, SOUSA, M. S. B.; VIEIRA, L. M.; LIMA, A. Fenólicos totais e capacidade antioxidante in vitro de resíduos de polpas de frutas tropicais. Brazilian Journal of Food Technology, v. 14, n. 3, p. 1-9, SWAIN, T.; HILLS, W. E. The phenolic constituints of Punnus domestica. I- quantitative analysis of phenolics constituintes. Journal of the science of food and agriculture, v. 19, p.63-68, 1959 VASCO, C.; RUALES, J.; KAMAL-ELDIN, A. Total phenolic compounds and antioxidant capacities of major fruits from Ecuador. Food Chemistry, v. 111, p , 2008.