AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CICATRIZANTE DA FOLHA DA ESPÉCIE Campomanesia pubescens EM MODELO DE FERIDA INFECTADA POR Staphylococcus aureus

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1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CICATRIZANTE DA FOLHA DA ESPÉCIE Campomanesia pubescens EM MODELO DE FERIDA INFECTADA POR Staphylococcus aureus Larissa Chaves Pradella (Bolsista FUNADESP/UNIDERP) 1, Carlos Henrique Marques dos Santos (Orientador) 2, Doroty Mesquita Dourado (Co-orientadora) 2, e- mail: Maria Helena Fermiano (Bióloga) 3, Rosemary Matias (Colaboradora) 4, 1 Curso de Medicina, Universidade Anhanguera-Uniderp. 2 Professores do Curso de Medicina da Universidade Anhanguera-Uniderp. 3 Bióloga do Laboratório de Pesquisa em Toxinologia e Plantas Medicinais, Universidade Anhanguera-Uniderp. 4 Programa de Pós-Graduação em Meio Ambiente e Desenvolvimento Regional, Universidade Anhanguera-Uniderp. Área: Morfologia Subárea: Histologia. Introdução No Brasil, uma estratégia adequada para se desenvolver produtos naturais é explorar o potencial terapêutico de espécies nativas, dos diferentes biomas brasileiros, em determinadas situações para as quais os medicamentos existentes são insuficientes e quando disponível são de custo elevado e com efeitos colaterais. Devido a isso, e à vasta matéria-prima disponível no Brasil, as oportunidades de pesquisas nessa área são inúmeras e pertinentes para serem usadas como matizes para a descoberta de novos fármacos além de assegurar a qualidade e eficácia terapêutica dos produtos a base de plantas de uso de popular (BRASIL, 2015). No que diz respeito à avaliação de atividade antimicrobiana de extratos brutos de plantas medicinais brasileiras, ensaios têm comprovado que espécies da flora brasileira apresentam constituintes com atividade antimicrobiana, exemplo disso são espécies do gênero Protium (família Burseraceae), em que a resina exsudada demonstrou, além da ação antimicrobiana, eficácia antiinflamatória, analgésica, expectorante, cicatrizante e antinociceptiva (VIOLANTE, 2008). No cenário médico atual, o tratamento de feridas contaminadas é um desafio diário, tendo como maior arma de enfrentamento a antibioticoterapia. No entanto, essa vem perdendo sua força, devido à crescente resistência bacteriana e superinfecções. Despontam então os estudos na área da fitoterapia, na tentativa de auxiliar na cicatrização e de conter infecções em feridas cutâneas (HADDAD; BRUSCHI; MARTINS, 2000; D ACAMPORA et al, 2007). Essa realidade aliada ao fato da já utilização popular de espécies para o tratamento de feridas cutâneas expõe a necessidade de uma melhor exploração do assunto. Logo, o objetivo do presente estudo foi investigar a eficácia farmacológica no processo cicatricial, em rastos Wistar, tratados com o extrato da folha da planta

2 Campomanesia pubescens (guavira), incorporada em veículo e utilizada por via tópica em modelo de ferida infectada por Staphylococcus aureus. Material e Métodos O presente estudo foi do tipo experimental clínico randomizado. A coleta das folhas da Campomanesia pubescens foi realizada em áreas com vegetação nativa de Mato Grosso do Sul (MS), em sequência foram estabilizadas e secas em estufa circuladora de ar 40 o C, trituradas em moinho de facas de aço inoxidável e armazenadas em frascos hermeticamente fechados protegidos da luz e do calor e rotulados. Para a preparação do extrato etanólico foram utilizadas essas folhas com extração em banho de ultra-som por 60 minutos seguido por maceração, à temperatura ambiente, repetindo-se até esgotamento da droga. O solvente foi evaporado sob vácuo em evaporador rotativo, obtendo-se o extrato. O extrato bruto etanólico foi incorporado no veículo, à base de Gel Carbopol (70%) preparado pela Dra. Beatriz Ferez da Empresa Drogaderma. Quanto aos animais utilizou-se 45 ratos Wistar, adultos, machos ( g), provenientes de colônias do Biotério Central da Universidade Anhanguera UNIDERP. Os procedimentos foram realizados no Laboratório de Toxinologia e Plantas Medicinais da Universidade Anhanguera-Uniderp sob orientação da pesquisadora Dra. Doroty M. Dourado. Os animais foram mantidos sob fotoperíodo controlado (12hs claro/ 12hs escuro), com temperatura entre 20 C e 24 C, acondicionados em gaiolas coletivas por doze dias para um período de adaptação e depois alocados em gaiolas individuais, com fornecimento de ração e água ad libitum e troca da maravalha em dias alternados. A Pesquisa foi autorizada pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Anhanguera Educacional Ltda. CEUA/AESA - parecer: Após período de adaptação, os ratos foram organizados aleatoriamente em cinco grupos (n=9) e os períodos avaliados de 3, 7 e 14 dias, sendo os grupos: G1- Grupo controle negativo sem contaminação (GSC-SF) tratados com Solução Fisiológica 0,9%. G2- Grupo controle com contaminação (GCC-SF) tratados com Solução Fisiológica 0,9%. G3- Grupo negativo com contaminação (GCC-Car) tratados com Carbopol em gel a 0,5%. G4- Grupo controle positivo (GCC+CC) com contaminação tratados com Colagenase a 0,6 U/g + Cloranfenicol a 0,01g. G5- Grupo teste positivo (GT+HI) com contaminação tratados com Campomanesia pubescens a 3%, cujo veículo foi o Carbopol a 0,5%. Antes da indução da ferida cutânea os animais foram pesados e anestesiados (Cloridrato de quetamina e Cloridrato de xilazina a 2%, 50mg/kg, via intraperitoneal). Para indução da ferida foi utilizado um punch metálico de 8 mm de diâmetro, sendo retirado um fragmento cutâneo (do dorso dos animais) de forma circular no centro das áreas delimitadas (1 cm²), já depiladas. Foi realizada a hemóstase por digitocompressão com gaze esterilizada por um período de dois minutos. Para a infecção das feridas realizou-se, previamente, o cultivo da bactéria em Agar com posterior diluição. Uma linha de sutura estéril foi imersa nesse conteúdo e o recipiente posto em um homogeneizador durante 10s com posterior sedimentação no período de 30min. Posteriormente, foi sobreposta em duas extremidades opostas da ferida (com os animais imobilizados em prancha de parafina) a linha de sutura contaminada nos grupos estabelecidos como contaminados, e o grupo estabelecido como não contaminado foi exposto à fixação da linha livre de S. aureus. Logo após o procedimento, e depois com frequência diária, todos os animais receberam o tratamento por aplicação tópica sobre a ferida, de acordo com o grupo de inclusão.

3 Conforme os períodos de avaliação, foi realizada a eutanásia dos animais (3 de cada grupo no 3º, 7º e 14º dias) por meio da administração de dose letal de anestésico (100mg/kg). Após a eutanásia, amostras de pele contendo o centro e os bordos da lesão (com a distância de 1 cm de pele além da lesão e sem atingir a musculatura), foram retiradas através de secção com bisturi frio lâmina nº 15. As amostras de pele retiradas foram identificadas e fixadas em formol tamponado 10% e após, o material foi processado em concentrações crescentes de álcool, diafanizados em xilol e incluídos em parafina histológica. Das amostras de pele foram confeccionadas secções transversais de 5 μm de espessura com o auxílio de micrótomo rotativo. As secções obtidas foram coradas pela técnica de Hematoxilina- Eosina (HE) e Picrosirius Red. A captura das imagens das lâminas coradas com HE foi realizada em fotomicroscópio Carl Zeiss acoplado a uma microcâmera Samsung conectada a um computador com placa de captura de imagens. Resultados e Discussão A crosta fibrinoleucocitária esteve presente em todos os animais dos grupos de 3, 7 e 14 dias (Figura 1). A contração da ferida também foi avaliada e todos os grupos apresentaram baixa porcentagem de regressão na ferida no tratamento de 3 dias e com 14 dias apresentaram alta porcentagem de regressão. Tazima (2008) traz que as fases da cicatrização ocorrem de forma harmônica e dependentes, à medida que se uma não obtiver sucesso as demais também não o farão. Além disso, diz que tal processo é dinâmico, influenciado por inúmeros fatores, sendo que o foco do presente estudo foi sobre a influência de diferentes tratamentos sobre as feridas, sendo estas contaminadas. Figura 1: Grupos 14 dias. G5 (Grupo teste positivo com contaminação (GT+HI) tratado com o extrato bruto etanólico da folha de Campomanesia pubescens a 3%, em veículo Carbopol 0,5%): 14 dias epitélio formado com todas as camadas e acima queratina espessa. HE. 10x. G1 G2 G3 G4 G5 O gênero Campomanesia da família Myrtaceae de nome popular guavira, é originária do Brasil, e de grande abundância na região do cerrado. Suas folhas e frutos possuem algumas propriedades medicinais como antiinflamatória, antidiarréica e antisséptica das vias urinárias e as folhas são utilizadas também no tratamento da gripe. Tais ações, devem-se à presença de flavonoides (estudos químicos com as folhas da espécie relataram a presença de miricetina, miricitrina, rutina e quercitrina em C. pubescens), componentes que podemos relacionar com várias das atividades medicinais descritas para a planta, pois apresentam comprovadas ações antioxidantes e anti-inflamatórias, fatores relacionados às suas

4 utilizações como antidiarréico, antisséptica das vias urinárias e cicatrizante (RAMOS; CARDOSO; YAMAMOTO, 2007; BARBOSA, 2009). Nas imagens capturadas pode-se observar que dos 5 grupos, o único que apresentou franca epitelização, apesar da contaminação, foi o que recebeu tratamento com Campomanesia pubescens a 3% e veículo Carbopol 0,5%. Nesse grupo (G5), o epitélio apresentou todas as camadas epiteliais formadas, além de espessa camada de queratina, principal diferença das demais (Figura 1). Tais propriedades da guavira aliadas à eficácia do veículo utilizado (maior penetração tecidual), provavelmente, favoreceram um processo cicatricial mais efetivo, tornando a cicatrização um evento mais harmônico dentro de toda sua complexidade. Conclusão A análise histológica das lâminas dos respectivos grupos de animais mostrou a eficácia da formulação a base do extrato etanólico a 3% da planta no processo cicatricial nos animais contaminados com S. aureus. Agradecimentos À FUNADESP pelo auxílio da bolsa de pesquisa, à UNIDERP, CNPQ e a FUNDEC pelo auxílio financeiro para a execução deste trabalho. Referências BARBOSA, J. Campomanesia lineatifolia Ruiz e Pav.: Estudo Fitoquímico e Avaliação da Atividade Antioxidante fls. Dissertação (Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de Atenção Básica. Política nacional de práticas integrativas e complementares no SUS: atitude de ampliação de acesso. 2. ed. Brasília: Ministério da Saúde, D ACAMPORA, A. J.; TRAMONTE, R.; BURGER, D.; BURGER, P. J. Efeitos da quercetina na cicatrização de ferida cirúrgica contaminada em ratos Wistar. Revista Online da Associação Catarinense de Medicina, Santa Catarina, v.36, n.1, p.69-75, HADDAD, M.C.L.; BRUSCHI, L. C.; MARTINS, E. A. P. Influência do açúcar no processo de cicatrização de incisões cirúrgicas infectadas. Revista Latino- Americana de Enfermagem, São Paulo, v.8, n.1, p.57-65, RAMOS, D.D.; CARDOSO, C. A. L.; YAMAMOTO, N. T. Avaliação do potencial citotóxico e atividade antioxidante em Campomanesia adamantium (Cambess.) O.Berg (Myrtaceae). Revista Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 5, supl. 2, p , TAZIMA, M.F.G.S.; VICENTE, Y.A.M.V.A.; MORIYA, T. Biologia da ferida e cicatrização. Medicina (Ribeirão Preto. Online), Ribeirão Preto, v. 41, n. 3, p , sep

5 VIOLANTE, I.M.P. Avaliação do potencial antimicrobiano e citotóxico de espécies vegetais do Cerrado da região Centro-Oeste fls. Dissertação (Mestrado em Saúde e Desenvolvimento na Região Centro-Oeste) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, 2008.