Preparação de Amostras Biológicas para Microscopia Eletrônica

Transcrição

1 Preparação de Amostras Biológicas para Microscopia Eletrônica Patricia Massara Martinelli Coordenadora Laboratório de Preparação de Amostras Biológicas CM-UFMG

2 Amostras Biológicas Keith Porter, Albert Claude, and Ernest Fullam "A Study of Tissue Culture Cells by Electron Microscopy. Journal of Experimental Medicin. Robertson, JD Estrutura trilaminar da membrana plasmática

3 Amostras Biológicas Tipos Para MET: amostras de órgãos/tecidos, células em cultivo, microorganismos, vesículas (lipossomas, micelas, etc) Amostras finas Análise de detalhes na secção da amostra Para MEV: amostras de tecidos, células em cultivo, microorganismos, vesículas (lipossomas, micelas, etc), organismos de pequena dimensão (insetos, conchas, sementes, etc), órgãos e fragmentos de órgãos Amostras espessas Análise de superfície

4 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão Preservação ~80% de H 2 O; enzimas; elementos orgânicos Exposição ao ar

5 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão Resistência ao vácuo ~80% de H 2 O vácuo H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O

6 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão Espessura da amostra Permitir passagem do feixe eletrônico Promover resolução 50nm

7 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão Contraste na amostra Elementos orgânicos Baixa densidade de elétrons H C Baixo contraste N O

8 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão PREPARAÇÃO Manutenção próxima da organização in vivo» Preservação da arquitetura e composição celular» Manter relação espacial na célula» Impedir a liberação e ação de enzimas líticas (autólise)» Impedir ação de microorganismos (putrefação) Permitir produção de secções ultrafinas Conferir resistência ao vácuo Conferir contraste FIXAÇÃO, DESIDRATAÇÃO, INCLUSÃO, ULTRAMICROTOMIA, CONTRASTAÇÃO Efeitos sobre a amostra: Endurecimento Retração Perda discreta da estrutura

9 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão FIXAÇÃO Estabilização da estrutura molecular Não desnaturante Permite etapas seguintes Fixação química Aldeídos (pontes intra e interprotéicas) Tetróxido de ósmio (lipídeos) Mais usada Aldeído Tetróxido de ósmio Máximo 2mm

10 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão DESIDRATAÇÃO Resistência ao vácuo Permite inclusão em resina Etanol 50% 1x 10' Etanol 70% 2x 15 Etanol 95% 2x 15 Etanol 100% 3x 15' Acetona 100% 2x 15' INCLUSÃO EM RESINA Permite ultramicrotomia Resitência ao feixe de elétrons

11 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão ULTRAMICROTOMIA Cortes ultrafinos (50-60nm) Telas de cobre, níquel ou ouro

12 AMOSTRAS BIOLÓGICAS CONTRASTAÇÃO ME Transmissão Deposição de metais pesados (tetróxido de ósmio, acetato de uranila, citrato de chumbo) Positiva: detalhes internos Negativa: contorno da amostra (vírus, bactérias, vesículas, liposomas, macromoléculas) Negativa Positiva 4/04/influenza.html Nakajima et al 2010

13 DIAFRAGMA DE CAMUNDONGO

14 MASTÓCITO EM COLON HUMANO

15 LIPOSOMA

16 ME de transmissão Tomografia Subramaniam et al., 2003

17 EDS (Espectroscopia de X-ray por energia dispersiva) icleid=3701 a) Electron micrograph showing the microstructure of a wheat seed aleurone cell. EDS maps of (b) Os Mα, (b) P Kα and (d) N Kα. (e) Layered image combining all 3 maps.

18 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Varredura PREPARAÇÃO Manutenção próxima da organização in vivo» Preservação da estrutura molecular da superfície a ser analisada» Manter relações espaciais das estruturas» Impedir a liberação e ação de enzimas líticas (autólise)» Impedir ação de microorganismos (putrefação)» Conferir resistência ao vácuo» Aumentar condutividade e dar estabilidade FIXAÇÃO, DESIDRATAÇÃO, (CRIOFRATURA), MONTAGEM, E METALIZAÇÃO AMOSTRAS: dimensões maiores

19 FIXAÇÃO AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Varredura Desnecessária em caso de superfícies secas (esqueletos de quitina, conchas, sementes secas, etc) Secagem comum ao ar Fixação química: aldéidos Fixação por congelamento ou narcotização (vermes, insetos aquáticos, zooplancton) stress ao entrar em contato com fixador mudança ou perda de ultraestrutura Material sobre a amostra, como muco, pode impedir visualização da superfície Lavagem com salina (com leve agitação) Centrifugação leve Álcool, glicerol ou enzimas

20 AMOSTRAS BIOLÓGICAS DESIDRATAÇÃO ME Varredura Desnecessária no caso de amostras secas Amostras úmidas: secagem sem deformação da superfície mais extensa. Forças de tensão superficial da água durante sua passagem para estado líquido para gasoso Secagem em ponto crítico

21 AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Varredura MONTAGEM METALIZAÇÃO: Amostras devem tornar-se condutoras (interação com feixe elétrons)

22 CABEÇA ARANHA

23 CABEÇA MARIPOSA

24 MICROSCÓPIO DE FEIXE DUPLO: ELÉTRONS + ÍONS (FIB focused ion beam) Através de lentes eletrostáticas é possível mover o feixe de íons em uma área determinada e fazer cortes com resolução nanométrica. Briggman & Bock, 2012 Karreman et al., 2016

25 CRIOTÉCNICAS

26 CRIOFIXAÇÃO Congelamento ultrarrápido das células com passagem da água intracelular e pericelular do estado líquido para o sólido (vitrificação) sem formação de cristais. SEM CONGELAMENTO CONGELAMENTO NORMAL CONGELAMENTO ULTRARRÁPIDO Mantem estado natural da amostra (evita difusão de solutos, deformações osmóticas e morfológicas, alterações bioquímicas) Dispensa fixadores químicos CryoEM de amostras hidratadas

27 CRIOFIXAÇÃO CRIOFIXAÇÃO FIB CRIO ULTRAMICROTOMIA CRIO FRATURA CRIO SUBSTITUIÇÃO TEMPERATURA AMBIENTE RÉPLICA FIXAÇÃO QUÍMICA IMUNO MARCAÇÃO INCLUSÃO IMUNO MARCAÇÃO ME TRANSMISSÃO ME VARREDURA

28 CRIOFIXAÇÃO High-Pressure Freezing Congelamento ultrarrápido (-1000ºC/s) com nitrogênio líquido sob alta pressão (2100 bars); Única técnica capaz de congelar amostras > 30 µm Melhor preservação da arquitetura celular e molecular (menos artefatos); Porta-amostra Amostra Fluido extracelular Porta-amostra

29 CRIO-ULTRAMICROTOMIA Neurofisiona em terminais axônicos (

30 CRIO-FRATURA

31 Microscopia Correlativa Correlação entre imagens de microscopia óptica e eletrônica de transmissão; Identificar moléculas e/ou estruturas imunomarcadas em organelas ou regiões subcelulares; Market et al., 2016

32

33 Microscopia eletrônica ambiental Amostra em meio líquido ou gasoso

34 OBRIGADA! The original image is the upper epiderml cells of petal in Mazus fauriei and gotten with cryo SEM. Courtesy of Dr. Wann-neng Jane, Institute of Plant and Microbial Biology, Academia Sinica (