Instruções de Uso XGEN MULTI HPV CHIP HS24

Instruções de Uso XGEN MULTI HPV CHIP HS24 Kit MULTIPLEX para detecção e genotipagem do papiloma vírus humano (HPV) através de PCR e hibridização reversa 1. USO PRETENDIDO O Kit XGEN MULTI HPV CHIP é um teste qualitativo in vitro para a detecção e genotipagem de 36 diferentes tipos do papiloma vírus humano, de alto risco (16, 18, 26, 31, 33, 35, 36, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 e 82) e baixo risco (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 69, 70, 71, 72, 81, 84 e 89), em amostras de swabs citológicos, tecidos em parafina e citologia em meio líquido, sem a necessidade da extração de DNA. O kit foi otimizado para uso nos aparelhos HybriSpot 12 (HS12) e HybriSpot 24 (HS24) Vitro Group. PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO. ATENÇÃO: Esta Instrução de Uso é destinada para orientar o uso com o HybriSpot 24. Para utilização do protocolo com o equipamento HybriSpot 12, verificar a Instrução de Uso KIT XGEN MULTI HPV CHIP HS12. 2. INTRODUÇÃO Os vírus papiloma humano, também conhecidos como HPV, é um vírus da família Papillomaviridae que se instalam na pele ou mucosas e afetam tanto homens como mulheres. Atualmente, a infecção o HPV é a infecção sexualmente transmissível (IST) mais frequente, ou seja, é a principal infecção viral transmitida por via sexual. Existem mais de 100 tipos virais de HPV até o momento, classificados em alto e baixo risco e aproximadamente 45 infectam o epitélio do trato anogenital masculino e feminino. Destes, os tipos 13 a 18 são considerados de alto risco oncogênico, principalmente os tipos 16 e 18, associados ao câncer anogenital e do trato aerodigestivo. Os HPVs de baixo risco, principalmente os tipos 6 e 11, causam as lesões benignas (verrugas e lesão intraepitelial escamosa de baixo grau) e na laringe (papilomatose laríngea). Estima-se que pelo menos 50% dos indivíduos sexualmente ativos terão contato com o HPV em algum momento de suas vidas e que 80% das mulheres terão esse contato até os 50 anos de idade. Segundo a Organização Mundial da Saúde, mais de 630 milhões de homens e mulheres estão infectados pelo HPV. No Brasil, estima-se que haja 9 a 10 milhões de infectados por esses vírus e que, a cada ano, 700 mil casos novos surjam, podendo ser considerado, portanto, uma epidemia. Cerca de 105 milhões de pessoas no mundo são positivas para o HPV tipo 16 ou 18. 3. PRINCÍPIO DO TESTE O princípio do ensaio é baseado na amplificação da região L1 do papiloma vírus humano por PCR Multiplex, seguido por hibridização reversa (Dot Blot) com sondas específicas de DNA imobilizadas em um chip composto por membrana de nylon (Tecnologia Flow-Chip). O processo de hibridização permite a ligação dos produtos de PCR biotinilados às sondas complementares presentes no chip e o sinal de hibridização é desenvolvido por uma reação colorimétrica imunoenzimática (estreptavidina-fosfatase alcalina e cromógeno NBT-BCIP). A reação substrato-cromógeno gera um precipitado de coloração roxo escuro na posição em que o fragmento amplificado de PCR hibridiza com a sonda específica e este sinal é automaticamente capturado e analisado pelo software do equipamento. 1

4. COMPONENTES PCR O formato padrão do kit contém reagente e chip para 24 ou 48 testes. COMPONENTES Primers HPV EZ HPV CONTEÚDO Solução de Primers biotinilados. Enzima DNA Polimerase Hot Start ume 24 Testes ume 48 Testes 1.200 µl 2 x 1.200 µl 15 µl 2 x 15 µl UDG HPV Enzima Uracila DNA Glicosilase 28 µl 2 x 28 µl * Cada frasco contém um volume adicional para imprecisão de pipetagem. 5. COMPONENTES DE HIBRIDIZAÇÃO COMPONENTES CONTEÚDO ume 24 Testes ume 48 Testes Reagente A Solução de Hibridização 60 ml 115 ml Reagente B Solução de Parada de Reação 10 ml 18 ml Reagente C Estreptavidina-Fosfatase Alcalina 10 ml 18 ml Reagente D Tampão de Lavagem I 35 ml 70 ml Reagente E1 Substrato 14 ml 20 ml Reagente E2 Cromógeno 14 ml 20 ml Reagente E Frasco vazio para preparo do Reagente E (E1 + E2) - - Reagente F Tampão de Lavagem II 18 ml 30 ml Chip HPV Chip HPV 24 unidades 2 x 24 unidades 6. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE Reagentes de PCR: Os componentes do kit devem ser armazenados na embalagem original. Armazenar a temperatura de -20 C. Descongelar os componentes em gelo antes do uso. Os reagentes são estáveis até a data de vencimento indicada no rótulo. Evitar o congelamento e o descongelamento dos reagentes por mais de cinco vezes, pois pode reduzir a sensibilidade do ensaio. Para evitar o congelamento e descongelamento repetidas vezes é recomendado adicionar o reagente Primers HPV à Enzima DNA Polimerase Hot Start e à UDG - Uracila DNA Glicosilase, e subsequentemente aliquotar as misturas (36 µl/alíquota) em microtubos de PCR 0,2 ml e armazenar a -20 C em período máximo 3 de meses. Reagentes de Hibridização: Os componentes do kit devem ser armazenados entre 2 C a 8 C. Não congelar. Os reagentes e o chip são estáveis até a data de vencimento indicada no rótulo. A solução de desenvolvimento (Reagente E) deve ser preparada somente antes do uso. A Solução de Hibridização (Reagente A) deve ser pré-aquecida a 41 C antes do uso e os outros reagentes devem ser utilizados a temperatura ambiente (20 C a 25 C). 7. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Reagentes para purificação de DNA (se necessário); Kit Master para Processamento de Tecidos em Parafina; Tampão PBS 1X (livre de DNase e RNase); Micropipetas calibradas (0,5 µl < volume < 1000 µl); Microcentrífuga; Banho Maria (41 C); Equipamento para Hibridização HybriSpot 24 e software HybriSoft; Racks para microtubos; Rack termostável (4 C) para tubos/placas de PCR; 2

Ponteiras estéreis com e sem filtro; Microtubos 1,5-2,0 ml livres de nucleases; Strips/Microtubos/Microplacas de PCR HS24; Luvas descartáveis sem talco; Termociclador; Agitador tipo vortex ou similar. 8. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 2. O pessoal técnico deve ser profundamente treinado na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR. 3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfuro-cortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor. 4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora 32. 5. O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar. 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 7. Após o recebimento, armazenar o kit de PCR a -20 C, em um freezer ou câmara fria com temperatura controlada e o kit de hibridização em geladeira a 2 a 8 C. 8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada amostra. 11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as entre o uso de cada uma. 12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa. 13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras de soro humano, sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança 2, como recomendado pela legislação em vigor. 14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e utilizar sala dedicada para o manuseio. 15. Realizar os procedimentos o mais rápido possível, mantendo os componentes de PCR no gelo ou em reservatório refrigerado. 16. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira unidirecional, começando na área de extração (quando aplicável) e passando para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras, equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram realizadas. 17. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada. 3

18. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. 19. Outros resíduos gerados (exemplo: ponteiras usadas para amostras) devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados, de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais. 20. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. 9. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES O ensaio deve ser utilizado com amostras de swab citológico, tecidos em parafina ou citologia em meio líquido de origem humana. OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 10. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS Reagentes de PCR Soluções prontas para uso. Antes de utilizar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. A fim de evitar repetidos descongelamentos, recomenda-se colocar todo o volume das enzimas EZ HPV e UDG HPV dentro do frasco de Primers HPV e depois realizar alíquotas de 36 µl/ e armazenar por no máximo 3 meses. Nota: O descongelamento de todos os componentes deve ser realizado no gelo. Reagentes A, B, C, D e F (Hibridização) Reagentes prontos para uso. Reagente E (Hibridização) A solução é fornecida em dois reagentes (Reagente E1 e E2) que devem ser misturados numa proporção de 1:1. Preparar a solução de acordo com a quantidade de amostras que serão processadas, antes da sua utilização, no frasco E. Após cada uso, limpar o frasco E com água destilada para evitar acúmulo de precipitados em utilizações consecutivas. Seguir a tabela de acordo com o item Reação de Hibridização/ Hibridização tópico 2. Chip (Hibridização) Os chips são de uso único e devem ser manuseados com luvas. Nunca tocar a membrana do chip. Para o manuseio, tocar somente na lateral do chip. 11. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT 1. Micropipetas As micropipetas devem ser calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrarem em contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e uma exatidão de +/- 5%. 2. Termociclador O Kit XGEN MULTI HPV CHIP é direcionado para uso em combinação para qualquer termociclador convencional. 4

3. HybriSpot 24 O Kit XGEN MULTI HPV CHIP foi otimizado para uso nos aparelhos HybriSpot 12 (HS12) e Hybrispot 24 (HS24) Vitro Group. ATENÇÃO: Esta Instrução de Uso é destinada para orientar o uso com o HybriSpot 24. Para utilização do protocolo com o equipamento HybriSpot 12, verificar a Instrução de Uso Kit XGEN MULTI HPV CHIP HS12. 12. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa. 2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Observar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ligar os equipamentos (termociclador ou HybriSpot) e verificar as configurações. Ter cuidado para usar o protocolo de ensaio correto. 4. Seguir estritamente o manual de equipamentos fornecidos pelo fabricante para a correta configuração dos termocicladores e HybriSpot. 5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao supervisor. 13. PROTOCOLO PARA O EQUIPAMENTO HS24 PREPARO DA AMOSTRA O Kit XGEN MULTI HPV CHIP foi otimizado para o uso com amostras clínicas, sem a necessidade de extração prévia de DNA. Entretanto, pode ser utilizado DNA purificado. O sistema foi validado com DNA purificado de amostras com os seguintes Kits: Kit Maxwell 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification (Promega): para purificação de DNA em amostras frescas ou parafinadas; MagNa Pure (Roche): para purificação de DNA de amostras frescas. Tecidos em Parafina Importante: Apesar de o sistema funcionar em a necessidade de extração de DNA do tecido em parafina, às vezes, é difícil garantir um manuseio correto do bloco de parafina, portanto, é recomendado iniciar com a purificação de DNA para evitar qualquer contaminação. Para realizar a extração de DNA da amostra de parafina seguir os passos iniciais deste item (13). Utilizar 4 µl da amostra de DNA purificado; Para a PCR com amostras direta, parafinadas, é recomendado o protocolo seguinte, utilizando o kit Master para Processamento de Tecidos em Parafina: 1. Coletar de 1 a 3 secções do bloco de parafina (a quantidade de secções irá depender do tamanho do tecido) de 10 µm de espessura e colocar em um microtubo de 0,5 ml utilizando uma agulha ou pinça dissecção de parafina; Observação: Retirar o máximo de restos de parafina possível. 2. Adicionar 400 µl de óleo mineral; 3. Aquecer por 2 minutos a 95 C; 5

4. Centrifugar a 2.000 rpm por 1 minuto. Remover o óleo mineral remanescente; 5. Adicionar 60 µl de Tampão de Extração e 1,5 µl de DNA Release no microtubo; 6. Aquecer a amostra por 30 minutos a 60 C e depois por 10 minutos a 98 C (este procedimento pode ser realizado em um termociclador ou bloco de aquecimento). 7. Centrifugar a 2.000 rpm por 1 minuto; 8. A parte superior do líquido irá conter a sobra de parafina e óleo mineral que restaram da amostra. O tecido estará em um pellet no fundo do tubo e o DNA estará em suspensão abaixo da camada de parafina. Utilizar 4 µl deste líquido em suspensão para realizar o teste. O restante desta amostra poderá ser armazenado por uma semana a 4 C ou por 2 meses a -20 C. Nota 2: Se após a incubação o tecido não estiver completamente digerido, recomenda-se adicionar um volume extra de Tampão de Extração e DNA Release. Repetir a incubação durante 30 minutos. Nota 3: A PCR direta não foi testada com outros tipos de amostras clínicas (amostras coradas ou extensões citológicas). Para esses casos, é recomendado fazer a purificação do DNA. Swab citológico 1. Adicionar 400 µl de tampão PBS 1X em um microtubo 1,5-2,0 ml. Mergulhar a ponta do swab cervical na solução de PBS e pressionar a ponta do swab gentilmente contra a parede do microtubo para separar as células; 2. Centrifugar o microtubo por 1 minuto a 2.000 rpm; 3. Remover o sobrenadante cuidadosamente; 4. Ressuspender o pellet de células em 25-50 µl de PBS 1X (o volume de PBS utilizado irá depender do tamanho do pellet. Quanto maior o pellet, maior será o volume de PBS utilizado); 5. Utilizar 4 µl dessa suspensão de células para a reação de PCR. O volume restante pode ser armazenado por uma semana a 4 C ou por 2 meses a -20 C. Nota 1: Para secções de parafinas maiores de 1 cm 2 é recomendado aumentar proporcionalmente o volume de Tampão de Extração e de DNA Release para assegurar a completa imersão do tecido nestes reagentes. Citologia em meio líquido 1. Deixar as células assentarem no fundo do recipiente de coleta. 2. Pipetar 150-200 µl dessa suspensão de células em microtubo de 1,5 2,0 ml; 3. Centrifugar por 1 minuto a 2000 rpm; 4. Remover o sobrenadante cuidadosamente; 6

5. Ressuspender o pellet em 400 µl de PBS 1X; 6. Centrifugar a 2000 rpm por 1 minuto; 7. Remover o sobrenadante cuidadosamente; 8. Utilizar 4 µl dessa suspensão de células para a reação de PCR. O volume restante pode ser armazenado por uma semana a 4 C ou por 2 meses a -20 C. Nota: O Kit foi validado para PCR direta com os seguintes Kits de coleta: Thinprep (Hologic); Surepath (Becton Dickinson); Novaprep (Novacyt); Cellprep (Biodyne). Citologia em meio líquido com meio de transporte da Digene (STM) 1. Pipetar 500 1.000 µl da suspensão de células em um microtubo 1,5 2,0 ml; 2. Centrifugar por 1 minuto a 2000 rpm; 3. Remover o sobrenadante cuidadosamente; 4. Ressuspender o pellet em 400 µl de PBS 1X; 5. Centrifugar por 1 minuto a 2000 rpm; 6. Remover o sobrenadante cuidadosamente; 7. Ressuspender o pellet em 25-50 µl de PBS 1X; Utilizar 4 µl dessa suspensão de células para a reação de PCR. O volume restante pode ser armazenado por uma semana a 4 C ou por 2 meses a -20 C. OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras em outros kits de extração, deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. REAÇÃO PCR MULTIPLEX O preparo da Mix de PCR pode ser realizado uma única vez ao abrir o kit ou em cada uso do produto. Preparo da Mix no Primeiro Uso 1. Descongelar no gelo os reagentes Primers HPV, EZ HPV e UDG HPV; 2. Homogeneizar bem os fracos por inversão; 3. Adicionar todo o volume de EZ HPV e UDG HPV no frasco de Primers HPV. Misturar bem por inversão e centrifugar por alguns segundos; 4. Dispensar alíquotas de 45 µl em 24 microtubos/strips de 0,2 ml e armazenar a -20 C. Utilização de Mix aliquotada 1. Descongelar um microtubo 0,2 ml da alíquota por amostra; 2. Adicionar 5 µl da amostra preparada a partir dos protocolos descritos em Preparo da Amostra. Para preparo da Mix no momento do uso 1. Caso o Mix seja preparado apenas para uso imediato, realizar o preparo de acordo com a tabela abaixo. Componente ume por Reação Primers HPV 43,5 µl EZ 0,5 µl UDG 1 µl 7

Amostra 5 µl IMPORTANTE: Todo o processo deve ser realizado em gelo ou rack termostável para evitar a degradação das enzimas. 2. Distribuir 45 µl do Mix em microplaca PCR ou strips/microtubos de PCR 0,2mL, por amostra que for ser testada. 3. Adicionar 5 µl da amostra preparada a partir dos protocolos descritos em Preparo da Amostra. 3. Colocar todos os microtubos/microplaca PCR em um termociclador para a reação de amplificação. O termociclador deve ser programado conforme o programa abaixo: 1 ciclo 25 C 10 min. 1 ciclo 94 C 3 min. 15 ciclos 35 ciclos 94 C 30 s 42 C 30 s 72 C 30 s 94 C 30 s 60 C 30 s 72 C 30 s 1 ciclo 72 C 5 min. 8 armazenadas em um freezer de Pós-PCR entre 8 C e 10 C por 1 ou 2 dias. Caso tenha necessidade de armazenar as amostras por um período de tempo maior, armazená-las em temperatura de -20 C. REAÇÃO DE HIBRIDIZAÇÃO Nota: todo processo de hibridização, captura de imagens e relatório dos resultados ocorrerá no equipamento HS24 e software HybriSpot. Hibridização 1. Desnaturar o produto de PCR em termocicador a 95 C por 10 minutos; 2. Preparar o Reagente E misturando os Reagentes E1 e E2 de acordo com a tabela abaixo: (µl)/1 teste (µl)/4 testes (µl)/8 testes (µl)/12 testes (µl)/16 testes (µl)/20 testes (µl)/24 testes E1 1.200 1.800 2.300 3.000 3.800 4.200 5.000 E2 1.200 1.800 2.300 3.000 3.800 4.200 5.000 3. Posicionar os chips no HS24. Nota: utilizar um chip por amostra e posicioná-los de maneira que a primeira fileira inicialmente seja preenchida; só após estar completa, preencher a segunda fileira e posteriormente a terceira; dessa forma, otimiza-se a utilização dos canais de vácuo. 4. Após a desnaturação no termociclador, deixar as amostras no gelo/rack termostável ou no termociclador a 4 C por, pelo menos, 2 minutos; Nota: manter os produtos de PCR entre 8 a 10 C assim que a reação estiver finalizada. As amostras poderão ser hibridizadas imediatamente ou 8

5. Programar o equipamento seguindo as instruções incluídas no manual do usuário fornecido com o equipamento; O chip do Kit XGEN MULTI HPV CHIP possui diversos controles para monitorar os resultados e todas as sondas são duplicadas para garantir a confiabilidade nos resultados. O controle de hibridização (B) possui cinco repetições em ordem que permite a orientação adequada para interpretação do software. CONTROLES O chip do Kit XGEN MULTI HPV possui diversos controles para monitorar os resultados e todas as sondas são duplicadas para garantir a confiabilidade nos resultados. O controle de hibridização (B) possui cinco repetições em ordem que permite a orientação adequada para interpretação do software. Posição no Chip (Resultado positivo, verificar genotipagem pelas sondas específicas) Resultados Negativos Branco/ Incompatível/Material insuficiente B C U* 1A - 8A - 1B 5E 2I 1C- 5F 1D 5G 1A 1B 2K 6F 10A 1A -1B 2K 6F 10A 1C- 5F -- -- -- Falha de Hibridização -- -- -- *A sensibilidade da sonda U é diferente da sonda de HPV Genotipagem, por esta razão, é comum, em alguns casos, observar um sinal fraco para U quando o resultado for positivo para alguma genotipagem. Este resultado não invalida a análise. Quantidades de Sondas Controle Sinal Positivo 5 x B Controle de Hibridização Indica que o processo de funcionou corretamente. hibridização 2 x C 2 x U Controle de Amplificação Exógeno Controle de Amplificação Interno (β-globina) Indica que a reação de PCR funcionou corretamente. Caso um dos sinais de CI seja negativo, pode indicar a presença de inibidores de PCR. Neste caso, verificar a qualidade do processo e das amostras utilizadas. Indica que a amplificação funcionou corretamente e a amostra clínica contém DNA humano. 9

Sonda HPV Genotipagem HPV 16 HPV 18 HPV 26 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 73 HPV 82 HPV 6 HPV 11 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 HPV 54 Posição no Chip 1E 6A 1F 6B 1G 6C 1H 6D 2A 6E 2B 6F 2C 6G 2D 6H 2E 6I 2F 7A 2G 7B 2H 7C 3A 7D 3B 7E 3C 7F 3D 7G 3E 7H 3F 7I 3G 8B 3H 8C 3I 8D 4A 5H 4B 5I 4C 8E 4D 8F HPV 61 HPV 62/81 HPV 67 HPV 69 4E 8G 4F 8H 4G 8I 4H 9B HPV 70 4I -9C HPV 71 HPV 72 HPV 89 HPV 84 14. SENSIBILIDADE ANALÍTICA 5A 9D 5B 9E 5C 9F 5D 9G O limite de detecção para cada genótipo de HPV foi calculado utilizando diluições em série de DNA sintético de cada genótipo incluído no painel contendo 10 ng de DNA genômico humano. Cada amostra foi repetida 10 vezes para calcular sensibilidade, especificidade e intervalos de confiança. Todos os produtos de PCR foram hibridizados na plataforma hybrispot e foram analisados com o software hybrisoft. Um valor de cut-off de 10 (intensidade cinza) foi estabelecido para positividade. Genótipo GE/ reação Positivo/ Testado Sensibili dade% Intervalo de confiança 95% Especifici dade % Intervalo de confiança 16 5 10/10 100 72.3-100 100 97.1-99.8 18 5 10/10 100 72.3-100 100 96.1-99.4 95% 10

26 50 5/10 50 29.9-70.1 100 98.5-100 500 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 66 50 4/10 40 16.8-68.8 100 98.5-100 500 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 31 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 68 50 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 33 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 73 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 35 50 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 82 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 39 50 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 6 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 45 50 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 11 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 51 50 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 40 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 52 50 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 42 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 53 50 0/10 0 0-27.8 100 98.5-100 500 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 43 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 44/55 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 50 5/10 50 29.9-70.1 100 98.5-100 56 500 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 58 50 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 54 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 50 5/10 50 29.9-70.1 100 98.5-100 61 500 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 59 50 10/10 100 72.3-100 100 98.5-100 62/81 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 11

67 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 69 NT poços. validade e condições de armazenamento dos reagentes e do Chip, e repetir o ensaio. 70 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 3-Caso a descontaminação da 71 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 72 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 89 50 0/10 0 0-27.8 100 98.5-100 500 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 área de trabalho tenha sido realizada com água sanitária, o DNA pode ter sido degradado. Limpar a bancada com água destilada e repetir o ensaio. 84 50 10/10 100 72.3-100 100 98.6-100 Detecção de Sinal em Controles Negativos Contaminação na fase de pré-pcr ou pós-pcr. Limpar as áreas de trabalho e repetir o ensaio. 15. SOLUÇÕES DE PROBLEMAS PROBLEMA CAUSA SOLUÇÃO Ausência de Sinal no Controle de Hibridização 1-Falha no protocolo de hibridização; 2-Reagentes fora do prazo de validade ou que não foram devidamente armazenados; 3- Sondas no Chip, destruídas por restos de reagentes contaminantes nos 1-Verificar se todos os reagentes foram adicionados corretamente durante o processo de hibridização. Verificar a performance do equipamento HybriSpot 12 e repetir o ensaio. 2-Verificar a data de Ausência de Sinal do Controle Interno Presença de precipitados cromogênicos no Chip após o protocolo de hibridização 1-Problemas na amplificação de PCR; 2-Presença de inibidores de PCR na amostra. 1- O Reagente E (E1 + E2) não ter sido preparado próximo de sua utilização; 2-O frasco do reagente 1-Verificar se o termociclador está programado corretamente. Verificar se a reação de PCR foi preparada corretamente e repetir o ensaio; 1-Preparar o Reagente E pouco antes de seu uso e repetir o ensaio. 2-Limpar o frasco do Reagente E após cada 12

Sinal fraco de Hibridização E pode conter resíduos de protocolos anteriores. 1-Reagentes de PCR e/ou Hibridização fora do prazo de validade ou que não foram devidamente armazenados. Repetir o ensaio; 2-O produto de PCR não foi devidamente desnaturado antes da hibridização; 3-Baixa concentração uso com água destilada para evitar o acúmulo de reagente. Repetir o ensaio. 1- Verificar se todos os reagentes foram adicionados corretamente durante o processo de hibridização e repetir o ensaio; 2-Verificar o processo de hibridização e a performance do equipamento HybriSoft 12. Repetir o ensaio; EXCEÇÕES NA GARANTIA Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. EXTINÇÃO DA GARANTIA Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 17. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, 866 Pinhais PR - CEP: 83.324-221 Telefone: (41) 2108-5296 E-MAIL: info@mobiuslife.com.br WEBSITE: www.mobiuslife.com.br CNPJ: 04.645.160/0001-49 18. REGISTRO ANVISA ou qualidade do DNA da amostra. 3-Aumentar a quantidade de amostra ou DNA para a PCR. 80502070051 19. RESPONSÁVEL TÉCNICA 16. GARANTIA DA QUALIDADE A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos termos abaixo. Flávia Rosenstein Schiel CRBio-07 34.360/07-D GARANTIA O produto Kit XGEN MULTI HPV CHIP é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. 13