Pasteurella multocida ISOLADA DE ARTRITE EM Cuniculus paca: RELATO DE CASO Aline de Jesus da SILVA 1 *; Helen Cristina Gomes de LIMA 1 ; Janaina Marcela Assunção ROSA 2 ; Gabriella Accardi IGLESIAS 3 ; Tânia Luísa Cabral da COSTA 3 ; Valéria DUTRA 4. 1 Graduanda em Medicina Veterinária, UFMT, Cuiabá, MT; * aline_med.vet@hotmail.com 2 Residente do laboratório de Microbiologia Veterinária, UFMT, Cuiabá, MT; 3 Residente Clínica médica de animais selvagens, UFMT, Cuiabá, MT; 4 Professor, UFMT, CLIMEV, Cuiabá, MT. Resumo O relato descreve o isolamento da Pasteurella sp. e detecção da Pasteurella multocida (P. multocida) sorotipo capsular A por PCR em artrite na articulação rádio-carpiana esquerda em Cuniculus paca (C. paca). Deu entrada no hospital veterinário da UFMT um filhote da espécie C. paca com lacerações no membro pélvico direito e posteriormente passou a apresentar aumento de volume com secreção purulenta na região da articulação rádio-carpiana esquerda. A secreção presente na articulação foi coletada e enviada ao laboratório de microbiologia e Biologia molecular veterinária, onde foram realizados os exames de cultura, antibiograma e PCR. As colônias crescidas em ágar sangue foram classificadas como Pasteurella sp. O PCR mostrou resultado positivo para P. multocida e para o sorotipo A. Casos de artrites por P. multocida já foram relatados em diversas espécies, sendo descritas lesões com acentuada secreção e sensibilidade local, assim como o animal analisado nesse caso. Este é o primeiro relato de infecção da C. paca pela P. multocida no Brasil, a qual foi caracterizada bioquímica e molecularmente, produzindo os mesmos resultados obtidos por vários autores. A determinação genotípica possui uma variabilidade que extrapola os limites da caracterização fenotípica por métodos tradicionais e por isso foi eficientemente empregada por vários autores, elucidando os mesmos resultados encontrados neste estudo. Sendo assim, os resultados dos PCR foram determinantes para detecção da P. multocida sorotipo A no isolado da secreção articular oriunda da C. paca. Palavras - chave: Artrite, Cuniculus paca, Pasteurella multocida. Keywords: Arthritis, Cuniculus paca, Pasteurella multocida. ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0029
Revisão de literatura A Pasteurella multocida (P. multocida) causa doenças em diversas espécies animais e em humanos, tendo importância econômica no mundo todo (BOROWSKI et al., 2002; EWERS et al., 2006). É uma bactéria gram negativa, imóvel e não formadora de esporos que acomete o homem, espécies domésticas e selvagens (QUINN et al., 2005). A maior parte dos isolados da P. multocida possui cápsula de polissacarídeo e são distribuídos em cinco sorotipos capsulares, A, B, D, E e F (TEIXEIRA, 2010; MORAES et al., 2014), sendo o sorotipo A o mais isolado no mundo e no Brasil (EWERS et al., 2006; HERES, 2009). Embora a P. multocida já tenha sido relatada em animais domésticos no Brasil, os estudos em animais selvagens são ainda escassos. Na literatura brasileira ainda não há relatos de isolamento da P. multocida em Cuniculus paca (C. paca). Desse modo o objetivo desse trabalho foi descrever o relato de isolamento da Pasteurella sp. e detecção por PCR da P. multocida sorotipo capsular A em artrite na articulação rádio-carpiana em C. paca. Relato do caso Um filhote da espécie C. paca foi recolhido na natureza pela polícia ambiental por apresentar ferimentos no membro pélvico direito e posteriormente foi encaminhado ao setor de clínica médica de animais selvagens do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT). O mesmo apresentava lacerações no membro pélvico direito e após uma semana de tratamento tópico com rifampicina, passou a manifestar aumento de volume com secreção purulenta na região da articulação rádio-carpiana esquerda. A secreção presente na articulação foi coletada e enviada ao laboratório de microbiologia e Biologia molecular veterinária para cultura e antibiograma. O material foi cultivado nos meios de ágar sangue ovino 8%, ágar MacConkey e ágar Sabourad, levados a estufa a 37ºC durante 72 horas. As colônias isoladas foram analisadas quanto a características morfológicas, tintoriais e comportamento bioquímico (QUINN et al., 2005). As leituras microbianas foram realizadas em 24, 48 e 72 horas após o cultivo, não sendo observado crescimento de microrganismos nas placas de ágar MacConkey e ágar Sabourad. As colônias crescidas em ágar sangue apresentaram aspecto de coloração cinza, não hemolíticas, brilhantes e na forma de coco-bacilo gram negativo mediante a ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0030
coloração de Gram. Os resultados das provas bioquímicas foram ácido/ácido no Tríplice açúcar ferro (TSI), ágar citrato de Simmons negativo, fermentativa na prova de fermentação de glicose, no meio SIM foi negativo para sulfeto e motilidade e positivo para indol, oxidase positiva, sendo classificada como Pasteurella sp. Foi realizado o teste de antibiograma de difusão de disco, foram testados antibióticos das seguintes classes penicilina, cefalosporina de 1º e 3º geração, anfenicóis, tetraciclina, aminoglicosídeos, sulfonamidas, macrolídeos, glicopeptídeo, lincosaminas e nitroimidazólicos e a bactéria mostrou-se sensível às quatro primeiras classes. O DNA do isolado foi extraído com fenol e clorofórmio (SAMBROOK e RUSSEL, 2004) e submetido à Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para o gene kmt de P. multocida e para os sorotipos capsulares em termociclador ProFlex TM PCR System (Life Technologies). Nas reações foram utilizados oligonucleotídeos baseados no gene kmt da P. multocida e nos sorotipos. A reação foi realizada em volume final de 20µl, contendo 10ng de DNA, 1,2 µl de MgCl 2, tampão 10x PCR Buffer, 5µl DNTPs (1mM), 20pmol de cada oligonucleotídeo e 1U de Taq DNA polimerase (Sigma). As condições da reação foram: desnaturação inicial 95 C por 5min para ambas as reações, seguida por 30 ciclos de 95 C por 30s, 50 C e 54 C por 30s para anelamento, 72ºC por 30s e 1 min para extensão, adicionados de uma etapa de extensão final de 72ºC por 5 min. O controle positivo foi DNA de P. multocida e o negativo água ultra-pura. Os produtos de amplificação foram analisados em eletroforese em gel agarose 1,0%, corados com Gel Red (Biotium ), a 10 V por cm, e observado em ChemiDoc XRS utilizando o software ImageLab. Como marcador de massa molecular utilizou-se o padrão 100 pb DNA Ladder (Fermentas ). O PCR mostrou resultado positivo para P. multocida e para o sorotipo A com amplificação de dois fragmentos de 460pb e 1044pb, respectivamente. Discussão A pasteurelose é uma das doenças mais comuns em suínos em crescimento e terminação do mundo (TEIXEIRA, 2010; MORAES et al., 2014), enquanto que estudos em animais de companhia e espécies selvagens ainda são escassos (FERREIRA, 2011). Casos de artrites por P. multocida já foram relatados em diversas espécies, sendo descritas lesões com acentuada secreção e sensibilidade local (HEYDEMANN et al., 2010; PETRIDOU et al., 2011), assim como o animal ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0031
analisado nesse caso. Em alguns casos os pacientes tiveram exposição a mordidas de animais como cães e gatos, sendo esta, uma importante via de infecção (HEYDEMANN et al., 2010; FERREIRA, 2011). Este é o primeiro relato de infecção da C. paca pela P. multocida no Brasil, a qual foi caracterizada bioquímica e molecularmente, produzindo os mesmos resultados obtidos por vários autores (BOROWSKI et al., 2002; QUINN et al., 2005; EWERS et al., 2006; HERES, 2009). A determinação genotípica possui uma variabilidade que extrapola os limites da caracterização fenotípica por métodos tradicionais (TEIXEIRA, 2010) e por isso foi eficientemente empregada por vários autores, elucidando os mesmos resultados encontrados neste estudo (BOROWSKI et al., 2002; HERES, 2009; TEIXEIRA, 2010; MORAES et al., 2014, FERREIRA, 2011). Conclusão Os resultados dos PCR foram determinantes para detecção da P. multocida sorotipo A no isolado da secreção articular oriunda da C. paca. Referências BOROWSKI, S. M.; IKUTA, N.; LUNGE, V.; FONSECA, A.; MARQUES, E.; CARDOSO, M. Caracterização antigênica e fenotípica de cepas de Pasteurella multocida isoladas de pulmões de suínos com pneumonia e/ou pleurite. Pesquisa Veterinária Brasileira, v 27, n. 3, 9. p. 97-103, 2002. EWERS, C.; LUBKE-BECKER, A.; BETHE, A.; KIEBLING, S.; FILTER, M.; WIELER, L. H. Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status. Veterinary Microbiology, v 114, p. 304-317, 2006. FERREIRA, T. S. P. Isolamento e caracterização de Pasteurella multocida provenientes de animais de companhia. 2011. São Paulo. 63p. Tese (Doutorado em epidemiologia experimental aplicada às zoonoses) Universidade de São Paulo. HERES, T. S. Caracterização de amostras de Pasteurella multocida isoladas de lesões pneumônicas associadas ou não com circovirose em suínos. 2009. Porto Alegre. 64p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária Preventiva) Universidade Federal do Rio Grande do Sul. ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0032
HEYDEMANN, J.; HEYDEMANN, J. S.; ANTONY, S. Acute infection of a total knee arthroplasty caused by Pasteurella multocida: a case report and a comprehensive review of the literature in the last 10 years. International Journal of Infectious Diseases, v 14, p. 242-245, 2010. MORAES, D. F. S. D.; BRANDÃO, L. N. S.; PITCHENIN, L. C.; FILHO, J. X. O.; MORÉS, N.; NAKAZATO, L.; DUTRA, V. Ocorrência de genes tad associados à formação de biofilme em isolados de Pasteurella multocida de pulmões de suínos com pneumonia. Pesquisa Veterinária Brasileira, v 34, p.1147-1152, 2014. PETRIDOU, E. J.; GIANNIKI, Z.; GIADINIS, N. D.; FILIOUSSIS, G.; DOVAS, C. I.; PSYCHAS, V. Outbreak of polyarthritis in lambs attributed to Pasteurella multocida. Veterinay Record, v 168, p.50, 2011. QUINN, P.J.; MARKEY, B.K.; CARTER, M.E.; DONNELLY, W. J.; LEONARD, F.C. Microbiologia veterinária e doenças infecciosas. Porto Alegre: Artmed, 2005. 512p. SAMBROOK, J.; RUSSEL, D.W. Molecular cloning. In: A laboratory manual. 3. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004. p.565-567. TEIXEIRA, S. M. N. Caracterização genotípica de cepas de Pasteurella multocida proveniente de suínos. 2010. São Paulo. 41p. Dissertação (Mestrado em epidemiologia experimental aplicada às zoonoses) Universidade de São Paulo. ANAIS 37ºANCLIVEPA p.0033