Graduação em Biotecnologia Disciplina de Proteômica Caroline Rizzi Doutoranda em Biotecnologia -UFPel
Ligação peptídica Aminoácido 1 Aminoácido 2 um dipeptídeo A ligação peptídica é uma amida. O -C NH 2 Não são reações espontâneas A ligação peptídica ocorre entre o grupo -carboxila de um aminoácido e o grupo -amino de outro aminoácido.
Ligação peptídica O O C C NH N H Ressonância eletrônica: nuvem de elétrons oscilando entre o C e o N. Híbrido de duas estruturas contribuintes: Elétrons distribuídos nos átomos da ligação Caráter de dupla ligação
Ressonância: Distância de 1,32 A Os quatro átomos da ligação peptídica e os dois carbonos α ficam no plano com ângulos de 120 entre o C e N A ligação peptídica é plana e rígida!!! Ligação estável Quebra a altas temperaturas ph ácido ou base Proteases Não há rotação Não tem carga elétrica Permite duas configurações espaciais: cis e trans
Ligação cis e trans Trans: os grupamentos dos carbonos α estão em lados opostos da ligação peptídica Prolina: configurações cis e trans choques estéricos em ambas as formas
O A ponta amídica é considerada sendo o início da cadeia peptídica Espinha dorsal - formada pela união dos aminoácidos - presença da ligação peptídica - formação de pontes de hidrogênio Grupamento N-terminal (NH 3+ livre) C- terminal (COO - livre) Resíduos de aminoácidos Possui polaridade Radicais dos aminoácidos - ligados a espinha dorsal - radicais são responsáveis pelas propriedades dos peptídios Peso molecular de 1 aa: 110 Da A perda da carga dos NH e COOH, a interação com outros grupos R do peptídeo podem afetar os valores de pk.
Flexibilidade da Cadeia Peptídica α Embora a ligação peptídica seja plana, há rotação ao redor das ligações ao carbono α de cada resíduo de aminoácido, permitindo o enovelamento da proteína Dois ângulos de rotação: (fi) ângulo de rotação entre o C e N - (psi ) ângulo de rotação entre o C e o C Determinam o trajeto da ligação peptídica No caso da prolina, a rotação entre o C e N não é possível. Conformação espacial da Cadeia peptídica
Diagrama / Ramachandran: teoria sobre os ângulos possíveis de torção da ligação peptídica. Valores permitidos e não permitidos são revelados no gráfico A B C Área verde: enovelamento estável das proteínas Rosa: combinações proibidas Amarela: energeticamente menos favorável, mas possível D A B C E Folha paralela Folha antiparalela D E Colágeno tripla hélice -hélice (esquerda) -hélice (direita)
Oligopeptídeos, peptídeos, proteínas Oligopeptídeos: di, tri, tetra: até 30 aas Polipeptídeos: 30 a 50 aas Proteínas: 50 a 2000 aas Classificação das proteínas de acordo com a conformação - globulares - fibrosas de acordo com os produtos de hidrólise - simples - conjugadas
Conformação Fibrosas Formadas aas hidrofóbicos; Fibras resistentes e elásticas; Função estrutural e contração; Repetição de estruturas secundárias; Proteínas longas no formato de cordas; Elastina, queratina. Globulares Regulação, catálise, proteção.. Altamente hidrofílicas; Não formam agregados; Grande variedade de proteínas; Enzimas, hormônios, transportadores, receptores...
Produtos de Hidrólise Simples Formadas apenas por aas Conjugadas Possuem em sua estrutura aminoácidos e compostos de origem não protéica Glicoproteínas Fosfoproteínas Lipoproteínas Metaloproteínas Cromoproteínas Nucleoproteínas
Proteínas Conjugadas
Proteínas Conjugadas Glicoproteínas Imunoglobulinas: 4% de glicídios Glicoproteínas de membrana: 20% de glicídios Mucinas: podem conter 60% de glicídios Colágeno: glicose ou galactose Fosfoproteínas Serina, treonina ou tirosina Caseína, vitelina Nucleoproteínas Histonas Telomerases
Proteínas Conjugadas Lipoproteínas Metaloproteínas Metal diretamente ligado à proteína
Cromoproteína Proteínas Conjugadas
Níveis organizacionais das estruturas das proteínas aminoácido Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica; mantida por ligações peptídicas É o esqueleto covalente (fio do colar), formado pela seqüência dos átomos (-N- C-Cα-)n na proteína. x 4 Estrutura secundária: Enovelamento de partes da cadeia Formada somente pelos átomos da ligação peptídica Estrutura terciária: Enovelamento de uma cadeia como um todo. Ligações entre os átomos dos radicais R de todos os aminoácidos da molécula Estrutura quaternária: Associação de mais de uma cadeia polipeptídica
Conformação protéica Arranjo espacial dos átomos: conformação Mudanças na conformação: sem quebra de ligações covalentes Conformação mais estável Proteínas que estão em uma conformação as quais apresentam-se funcionais: Proteínas Nativas
Características da conformação de uma proteína Função protéica: depende da sua estrutura; Proteínas isoladas: existem em uma ou pequeno número de formas de estruturas estáveis; Forças mais fortes de estabilização proteíca: interações não covalentes; Estrutura tridimensional: Determinada pela seqüência de aas; Deve exibir condições de flexibilidade e rigidez adequados a sua função; Superfície externa apropriada para o ambiente; Conformação estável que pode se redobrar sem perder função ou precipitar no interior celular; Facilmente degradada quando for danificada ou não é mais necessária. Padrões estruturais comuns: facilitam a compreensão da arquitetura das proteínas.
Estrutura Secundária Características Conformação local de uma porção da proteína; Padrão regular de enovelamento estáveis e amplamente distribuídas; Mais comuns: alfa hélices e conformações beta
Alfa hélices Estudos da estrutura 3D de proteínas: 1930: William Astbury, raios-x para analisar cristais de queratina (proteína da lã de carneiro) estrutura regular repetida a cada 5.2 Å. 1951: Pauling e Corey prováveis conformações das proteínas Representadas como fitas retorcidas ou bastões Presente em proteínas globulares, domínios de proteínas transmembrana e proteínas ligantes de DNA.
Alfa hélices Alfa-hélice: padrão de pontes de hidrogênio; Espiral da hélice: horário (D ou destro) ou antihorário (E ou sinistro); 3,6 aas por volta; 13 átomos; 4 pontes de hidrogênio por volta estabilidade C=O é ligada ao hidrogênio do N-H do quarto aminoácido adiante; Pontes de hidrogênio: paralelos ao eixo; Radicais: fora da hélice; 5,4Å Comprimento médio: 12 resíduos (~18 Aº menos de 45 A );
Alfa hélices Seqüências de resíduos com valores repetidos de e ; Interações entre as cadeias laterais: estabilizar ou desestabilizar; Cadeias carregadas com glutamato, aspartato ou arginina: não formam alfa hélice repulsão das cargas; Tamanho e formato de Asn, Ser, Thr e Cys: desestabilizam a hélice se estiverem próximos; Espaçamento de grupos carregados e volumosos de 3 a 4 resíduos; Entrelaçamento de alfa hélices: super-hélices. Regiões hidrofóbicas e função mecânica
Alfa hélices queratina Ferritina
Alfa hélices Colágeno: glicina, prolina, hidroxiprolina
Folhas beta União de dois ou mais filamentos beta unidos por pontes de hidrogênio grupos R alternados, Primeiro abaixo e depois acima do plano Grupos NH e CO perpendiculares ao eixo da folha Presentes em proteínas ligadoras de ácidos graxos
Folhas beta N antiparalela C C Paralela, torção à esquerda C
Elementos de conexão: Beta turns 4 aminoácidos (glicina e prolina); Estabiliza mudanças de sentido da cadeia peptídica Maioria das voltas: curtas e localizadas em regiões próximas à superfície Podem estar presentes no sítio catalítico de enzimas
Motivos ou estruturas supersecundárias Arranjos estáveis de vários elementos de estrutura secundária e suas conexões; Padrão comum de interação; Interação das cadeias laterais de duas ou mais estruturas secundárias; Um único e grande motivo: proteína inteira; Proteínas globulares não relacionadas; Significância tanto estrutural quanto funcional;
Motivos Beta-alfa-beta Só beta Só alfa Barril beta Barril alfa-beta
Motivos dedos de zinco ziper de leucina dobramento estrutural estável de pequenas porções da proteína Super hélice de alfa hélice
Estrutura Terciária Estrutura terciária: Dobramento das estruturas secundárias Especifica as posições de cada átomo na proteína, inclusive os de cadeia lateral A complexidade da estrutura terciária é diminuída considerando subestruturas: Domínios
Forças que mantém a 3D Proteína Proteína NH CH 2 OH... O C CH 2 CH 2 Ponte de Hidrogênio CH + 2 CH 2 NH 3 O Ligação Iônica C CH 2 CH 2 O CH 2 CH CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH CH 2 CH CH 3 H 3 C CH CH 3 CH 3 Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals 2 Forças não covalentes Pontes de H -Aminoácidos polares Ligações iônicas - Aminoácidos carregados Interações hidrofóbicas -Aminoácidos apolares Forças de Van der Waals -Qualquer aminoácido
Forças que mantém a 3D Pontes dissulfeto: covalentes e só podem ser rompidas por agentes redutores RE: Proteínas secretadas B A Insulina
Forças que mantém a 3D Tipo de ligação Energia * (Kcal/mol) Tipo de ligação Energia * (Kcal/mol) LIGAÇÃO SIMPLES LIGAÇÃO DUPLA O H 110 C O 170 H O 104 C N 147 P O 100 C C 146 C H 99 P O 120 N H 93 LIGAÇÃO TRIPLA C C 195 C O 84 C C 83 S H 81 PONTE DE HIDROGÊNIO C N 70 NH...O C S 62 OH... N 4-5 N O 53 NH... N S S 51 OH... O * O valor indicado para cada ligação refere- se à quantidade de energia necessária para rompê-la. A ligação peptídica é muito forte e só se rompe em condições químicas drásticas, como 6N HCl a 100ºC. A ponte dissulfeto (-S-S-) é relativamente rara entre as proteínas. Por ser um laço covalente, não se rompe quando uma proteína desnatura em meio ácido ou por calor. Proteínas são moléculas frágeis e podem ser desnaturadas, com perda de suas propriedades biológicas, por pequenas variações do ph ou da temperatura do meio. A ponte de H é uma das principais forças envolvidas na estabilidade da conformação nativa.
Domínios Unidades compactas dentro do padrão de enovelamento de uma única cadeia que parece ter estabilidade independente Enovelamento estáveis com funções específicas e essenciais Regiões compactas semi-independentes com núcleo hidrofóbico e porção externa polar Contêm tipicamente de 100 a 150 aa Domínios estruturais da troponina C
canal de H + meio externo Perfil hidropático A bacteriorhodopsina é formada por 7 segmentos de -hélices apolares, que delimitam um canal interno de citoplasma natureza polar. Soma dos índices hidropáticos a cada 9 resíduos de aminoácidos Permite prever regiões da proteína que interagem com a membrana plasmática ou com os meios interno/externo. O perfil hidropático da bacteriorhodopsina prevê 7 regiões hidrofóbicas e 3 regiões hidrofílicas.
Estrutura quaternária Subunidades ou protômeros Mais de uma cadeia polipeptídica: Multímeros Homo ou hetero Monômero, dímero, trímero, oligômero Regulação Funções diferentes Subunidade (uma cadeia polipeptídica) Proteína (biológicamente ativa; dímero não covalente )
Mioglobina de Cavalo
Folding de proteínas Tendência da manutenção da conformação nativa; Proteínas Nativas: marginalmente estáveis; O que induz ao folding? Empacotamento de regiões hidrofóbicas: Aumento da entropia da água; Estabilização da estrutura protéica; Área de solvatação em porções polares: quando estas moléculas deixam de interagir com água e interagem entre si entropia que direciona o folding; Cadeia primária; Importância do estudo do folding: Misfolding protéico: agregação e fibrinogênese patologias; Superexpressão de proteínas de interesse industrial ou de pesquisa; Estudo da atividade enzimática para a síntese química;
Chaperonas Interagem com proteínas não dobradas ou mal dobradas HSP70: ligam-se em regiões ricas em aas hidrofóbicos não dobradas, impedindo a agregação: Proteção da desnaturação pelo calor Naturação de peptídeos que estão sendo sintetizados Impede o folding de proteínas secretadas Chaperoninas: GroEL/GroES
Folding e expressão de proteínas recombinantes Proteínas Nativas: maior solubilidade que as maldobradas Atividade Biológica: estrutura nativa
Folding e expressão de proteínas recombinantes Formação de corpos de inclusão Alta densidade; Podem conter partículas da membrana externa; Altos níveis de expressão, mesmo de proteínas endógenas; Não relacionada com hidrofobicidade, peso molecular; Só relacionada com ausência de formação de pontes S-S. Limitar a velocidade da formação de proteínas recombinantes