AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE Miconia prasina (Sw) DC

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE Miconia prasina (Sw) DC Leite, T.C.C. (1) ; Santos, R.H.S. (2) ; Borba, E.F.O. (1) ; Nerys, L. L. A. (1) ; Chagas, E.C.O. (3) ; Sena, A.R. (2) ; Silva, T.G. (1) toycly@gmail.com (1) Laboratório de Bioensaios para Pesquisa de Fármacos, Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco UFPE, Recife PE, Brasil; (2) Laboratório de Microbiologia, Instituto Federal de Pernambuco - IFPE, Campus Barreiros PE, Brasil; (3) Instituto do Meio Ambiente do Estado de Alagoas - IMA, Maceió - AL, Brasil; RESUMO Miconia é o maior gênero da família Melastomataceae com mais de 1000 espécies, sendo que aproximadamente 300 são encontradas no Brasil. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de Miconia prasina a partir de extratos com diferentes polaridades. Os métodos escolhidos para esta avaliação foi a difusão em ágar com disco de papel segundo o CLSI e microdiluição em caldo segundo o NCCLS. Neste trabalho foram utilizados os extratos em hexano (Hex), acetato de etila (AcOEt) e metanólico (MeOH) de M. prasina frente a nove microrganismos. Os extratos foram testados na concentração de 300 mg/ml. Os resultados demonstraram que os extratos metanólicos e acetato de etila apresentaram atividade antimicrobiana para maioria dos microrganismos avaliados para o método de difusão. No entanto, o extrato acetato de etila apresentou atividade frente a um maior espectro de microrganismos e também maior diâmetro nos halos de inibição. Os extratos de M. prasina apresentaram atividade antimicrobiana e que esta pode estar relacionada à polaridade dos compostos presentes nos extratos. Palavras-chave: Efeito Inibitório, Extrato Acetato de Etila, Melastomataceae. INTRODUÇÃO

Historicamente as plantas medicinais foram utilizadas como um importante recurso terapêutico e após um período de desvalorização, resultante dentre outros motivos ao avanço da química sintética e o consequente surgimento de diversas drogas provenientes deste método, sua utilização voltou a ganhar relevância nas últimas décadas principalmente devido aos elevados números de casos ocorrentes de efeitos adversos provenientes dos medicamentos alopáticos bem como a busca por parte da população em cultivar hábitos saudáveis e que pode se relacionar indiretamente no consumo de produtos de origem natural (MACIEL et al., 2002; VEIGA JÚNIOR et al., 2005). Um outro fator que está diretamente relacionado ao incentivo no uso dos produtos naturais na terapêutica antimicrobiana, além da demanda, é a busca por novos agentes antimicrobianos visto que a disseminação exacerbada dos casos de resistência aliada à baixa disponibilidade de novos agentes com esta função, tem levado os especialistas a conceber um prognóstico preocupante relacionado a esta terapêutica (GUIMARÃES et al., 2010). Esta busca se reflete também no aumento das pesquisas relacionadas à descoberta de novos agentes antimicrobianos derivados de produtos naturais. Com relação a isto, Melastomataceae é uma família botânica promissora uma vez que possui, aproximadamente, 180 gêneros e 4500 espécies e ainda é pouco estudada sob os aspectos biológicos e químicos (GOLDENBERG, 2000). Entre os diversos gêneros, encontra-se o Miconia que figura com o maior número de espécies, mais de mil, sendo que no Brasil ocorrem aproximadamente 300 espécies presentes nos mais diversos biomas como Mata-Atlântica, Cerrado, Caatinga e Amazônia e ainda muito pouco estudado do ponto de vista biológico e químico (FORZZA et al., 2010). Nativa das Antilhas, México, Trinidad, América-central e zonas tropicais da América do sul, Miconia prasina é conhecida popularmente como Mandapuçá-branco ou ainda como mundurú-branco e lacre-branco. Esta espécie tem hábito arbustivo a arbóreo e seu fruto tem importância alimentícia para a população da Amazônia brasileira e como fonte de polinização, visto que é o alimento preferido de importantes espécies de morcegos

sul-americanos. Este fruto tem diâmetro aproximado de 4 mm, é globoso com coloração variada (MBG, 2002; PAPAVERO, 2002). Diante do exposto, o objetivo do trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos de diferentes polaridades de Miconia prasina. MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal Foram coletadas 2000 g das partes aéreas de Miconia prasina nos municípios de Maceió e Satuba e posteriormente foram identificadas pelo botânico MSc. Earl Celestino de Oliveira Chagas e depositadas no herbário do Instituto de Meio Ambiente do Estado de Alagoas (IMA-MAC) sob o número da exsicata 50398. Obtenção dos extratos As partes aéreas da espécie coletada foram secas por 4 dias, em estufa com temperatura controlada e renovação constante de ar. A mesma foi moída em moinho de facas e extraída por maceração por um período de 7 dias em temperatura ambiente e protegida da luz. Os solventes utilizados foram hexano, acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH) e produziram os extratos: Hexânico (Hex, 2 g), acetato de etila (AcOEt, 3 g) e metanólico (MeOH, 10 g). Micro-organismos As linhagens de bactérias e fungos leveduriformes utilizados foram obtidas a partir da Coleção de Microrganismos do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPEDA). Para este ensaio foram utilizadas quatro bactérias grampositivas: Staphylococcus aureus (UFPEDA 02), Micrococcus luteus (UFPEDA 100), Bacillus subtilis (UFPEDA 86) e Enterococcus faecalis (UFPEDA 138); três bactérias gram-negativas: Escherichia coli (UFPEDA 224), Serratia marcescens (UFPEDA 352) e Pseudomonas aeruginosa (UFPEDA 416); uma álcool-ácido-resistente: Mycobacterium smegmatis (UFPEDA 71) e a levedura Candida albicans (UFPEDA 1007). Atividade antimicrobiana - Método de difusão em disco

A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela metodologia de difusão em ágar, utilizando-se discos de papel de filtro com diâmetro de 6 mm, conforme Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012) para conhecer o perfil de atividade dos extratos. Para este ensaio utilizou-se alíquotas de 10 µl dos extratos na concentração de 300 mg/ml para impregnar os discos de papel. Anteriormente, os extratos hexânico e acetato de etila foram solubilizados em DMSO e o metanólico em água destilada estéril e então esterilizados por filtração em membrana de 0,22 µm (TPP). Uma suspensão do microrganismo-teste (1,5 x 10 8 UFC/mL para bactérias e 1,5 x 10 5 UFC/mL para leveduras) foi determinada através de comparação visual com um padrão na concentração de 0,5 na escala de Mc Farland e espalhada (0,1 ml) sobre a superfície de meio sólido AMH (Ágar Müeller Hinton) em placa de Petri de (15 x 90 mm). Posteriormente foram adicionados sobre as placas inoculadas os discos impregnados com os extratos. As placas foram incubadas a 37 C por 24 h (bactérias) e a 28 C por 48 h (leveduras). Após este período foi realizada a leitura visual observando-se o halo de inibição de crescimento microbiano quantificado em mm com o auxílio de um halômetro. Como controle positivo impregnou-se 10 µl dos padrões nos discos na concentração de 10 mg/ml de eritromicina para bactérias e 20 mg/ml de nistatina para fungos leveduriformes e como controle negativo utilizou-se os discos impregnados com os solventes utilizados. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e os mesmos repetidos duas vezes. Concentração Mínima Inibitória (CIM) e Concentração Mínima Microbicida (CMM) Após conhecer o perfil de inibição dos extratos, foi realizado o ensaio de susceptibilidade pela metodologia da microdiluição em caldo para determinação da Concentração Mínima inibitória (CIM) e Concentração Mínima Bactericida segundo o NCCLS (2002; 2003). A determinação da concentração inibitória mínima foi realizada utilizando placas com 96 poços estéreis, próprias para microdiluição. Os extratos hexânico e acetato foram solubilizados em DMSO e o metanólico em água destilada estéril e então estéreis por filtração em membrana de 0,22 µm (TPP).

Inicialmente colocou-se em cada poço 90 µl do meio Caldo Muller Hinton (CMH) e posteriormente adicionou-se a partir da terceira coluna (A3) 90 µl do extrato na concentração de 16 mg/ml esta alíquota foi homogeneizada e transferida para a quarta coluna (A4) e assim por diante até a décima segunda coluna (A12) que recebeu o extrato na concentração de 0,03 mg/ml, nesta última a alíquota (90 µl) depois de homogeneizada é descartada. Os extratos foram testados em triplicatas. Por último foi adicionada uma alíquota de 10 µl da suspensão do microrganismo preparada conforme o método anterior. Logo, cada poço recebeu como volume final uma alíquota de 100 µl (90 µl de meio e extrato e 10 µl do microrganismo). Posteriormente as placas foram incubadas por 24 horas (37 ºC) para bactérias e 48 horas (28 ºC) para leveduras. Após este período de incubação foram adicionados 30 µl de Rezasurina na concentração final de 0,01 % para análise quantitativa do crescimento microbiano nos poços de ensaio e determinação da atividade antimicrobiana relativa de cada diluição das amostras. Neste ensaio foram realizados os controles: de viabilidade dos microorganismos testados, da esterilidade do meio de cultura, do extrato e do potencial de inibição do DMSO sobre os microrganismos testados. Também foram utilizados como controle positivo os antimicrobianos eritromicina (15 mg) e nistatina (20 mg) e suas diluições. Para a determinação da Concentração Mínima Microbicida (CMM) repicou-se uma alíquota de 5 µl, das concentrações que apresentaram atividade na placa do CIM, em placas de Petri contendo Ágar Mueller Hinton (AMH). Estas placas foram incubadas a 37 ºC por 24 horas para bactérias e 28 ºC por 48 horas para leveduras. A CMM foi considerada a menor concentração do extrato onde não houve crescimento celular sobre a superfície do AMH. Análise estatística Após obtenção dos resultados, os mesmos foram analisados através do programa SISVAR Sistema de Análise de Variância (FERREIRA, 2000), realizando-se a análise de comparação de médias pelo Teste de Skott-Knott ao nível de 5 % de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO No teste de difusão em disco, os diferentes extratos foram testados na concentração de 300 mg/ml frente a nove microrganismos, entre os quais quatro Gram-positivos, três Gram-negativos, um álcool-ácido-resistente e uma levedura e os resultados estão expressos na Tabela 1. Na metodologia da difusão em disco os extratos tiveram perfil de inibição diferente visto que o extrato hexânico não foi ativo frente a nenhum microrganismo e isto se deve a limitações do método, pois já é bem documentado na literatura que substancias apolares não se difundem bem em meio sólido (RIOS et al., 1988). Já o extrato acetato demonstrou ter um perfil de inibição mais amplo comparado ao metanólico uma vez que este inibiu o crescimento de três bactérias gram-positivas, uma gram-negativa, uma álcool-ácido resistente e uma levedura. O extrato metanólico foi ativo contra apenas as três bactérias gram-positivas e uma bactéria gram-negativa. Tabela 1. Média dos diâmetros dos halos de inibição em mm do crescimento microbiano pelo método de difusão em disco dos extratos de Miconia prasina. M. prasina Gram-positivas Gram-negativas AAR* Levedura 02 100 86 138 224 352 416 71 1007 300 mg/ml hexano ND ND ND ND ND ND ND ND ND AcOEt 13,3 b 20,0 b 12,3 b ND ND ND 11,0 a 12,7 b 22,0 b MeOH 7,3 c 14,7 c 8,7 c ND ND ND 8,0 b ND ND C+ Eritromicina/ nistatina 28,0 a 33,0 a 30,0 a - - - - 23,0 a 25,0 a *Bactéria Álcool Ácido Resistente, ND Não detectado. 02: S.aureus; 100: M. luteus; 86: B. subtilis; 352: S. marcescens; 138: E. faecalis; 416: P. aeruginosa; 224: E. coli; 71: M. smegmatis; 1007: C. albicans. C+: Controle positivo. Médias seguidas por letras distintas na vertical diferem entre si ao nível de 5 % de probabilidade pelo Teste de Skott-Knott. Vale destacar que os halos de inibição apresentado pelo extrato acetato foram estatisticamente superiores em diâmetro quando comparados aos halos do extrato metanólico o que pode estar relacionado à maior concentração dos compostos responsáveis pela ação antimicrobiana.

Os microrganismos que foram inibidos no ensaio anterior foram submetidos à microdiluição em caldo para determinação da Concentração Mínima Inibitória (CIM) e Concentração Mínima Microbicida (CMM) e os resultados estão resumidos na Tabela 2. Tabela 2. Concentração Mínima Inibitória (CIM) e Concentração Mínima Microbicida (CMM) em mg/ml dos extratos de Miconia prasina. *Bactéria Álcool Ácido Resistente Neste ensaio todos os extratos mostraram atividade frente aos microrganismos o que contrasta com os resultados da difusão em que somente os extratos com determinada polaridade foram ativos e isto pode ser atribuído a uma limitação do método visto que o extrato hexânico na concentração de 300mg/mL não apresentou atividade antimicrobiana pelo método de difusão contudo o mesmo foi ativo pelo método da microdiluição em caldo, em concentrações até 1000 vezes inferior. Uma das explicações para este comportamento pode ser a baixa capacidade de substâncias apolares se difundirem através de um meio sólido. Analisando os dados sob o ponto de vista químico pode-se inferir que em ambos os métodos o extrato acetato é considerado, de acordo a inibição microbiana, o melhor e esta conclusão é alicerçada tanto nos maiores halos presentes na difusão como também nos menores valores da Concentração Mínima Inibitória e Concentração Mínima Microbicida para todos os microrganismos testados. Comparando os resultados obtidos com outras espécies de Miconia pode-se perceber uma atividade superior de M. prasina, espécie vegetal utilizada neste estudo, com CIM sempre inferior a 1 mg/ml, uma vez que M. Cabucu, M. stenotachya e M. rubiginosa apresentaram CIM com valores superiores a 1 mg/ml frente às bactérias grampositivas, gram-negativas e leveduras (QUEIROZ et al., 2011; RODRIGUEZ et al., 2008). Vale ressaltar que não foram relatados na literatura trabalhos de atividade antimicrobiana com a espécie vegetal analisada neste estudo.

CONCLUSÃO Os extratos metanólico e acetato de etila de M. prasina apresentaram atividade contra a maioria dos microrganismos testados e esta atividade pode estar associada aos compostos polares presentes nos mesmos, pois o extrato acetato de etila apresentou maior efeito inibitório sendo comprovado por todos os métodos utilizados neste estudo. AGRADECIMENTOS A Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE), pelas bolsas concedidas e ao CNPq pelo suporte financeiro. REFERÊNCIAS CLSI. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests - M02-A11. 11. ed. Wayne: CLSI, Wayne: USA 2012. FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do SISVAR para Windows versão 4.0. In: Reunião Anual da Região Brasileira da Sociedade Internacional de Biometria, 45. 2000. São Carlos, Anais... São Carlos: UFSCar, 2000, p. 255 258. FORZZA, R. C.; et al. 2010. Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro, 2010. Disponível em: <http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2010>. Acesso em: 21 ago. 2013. GOLDENBERG, R. O Gênero Miconia Ruiz & Pav. (Melastomataceae): I Listagens Analíticas, II Revisão Taxonômica da Seção Hypoxanthus (Rich. Ex DC.) Hook. 259p. Tese (Doutorado em Biologia Vegetal)-UNICAMP, Campinas, 2000. GUIMARAES, D. O.; MOMESSO, L. S.; PUPO, M. T. Antibióticos: importância terapêutica e perspectivas para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes. Química Nova, v. 33, n. 3, p. 667-679, 2010. MACIEL, M. A. M.; et al. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Química Nova, v. 25, n. 3, p. 429-438, 2002. MBG. 2002. Flora of Costa Rica: Miconia prasina. Disponível em: <http://www.mobot.org/manual.plantas/023023/s024494.html>. Acesso em: 20 set. 2013. NCCLS. Método de referência para testes de diluição em caldo para a determinação da sensibilidade a terapia antifúngica das leveduras - M27-A2. 2. ed. NCCLS, Wayne: USA, 2002. NCCLS. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically M7-A6. 6. ed. NCCLS, Wayne: USA, 2003. PAPAVERO, N.; et al. Landi: fauna e flora da Amazônia brasileira. Belém: Museu Paraense Emílio Goeldi. 2002. 260 p. QUEIROZ, G. M. Absence of the antibacterial activity of the crude extracts and compounds isolated from M. rubiginosa against extended-spectrum β-lactamase producing enterobacteria. Journal of Pharmaceutical negatives results, v. 2, n. 1, p. 1-7, 2011.

RODRIGUES, J.; et al. Antimicrobial activity of Miconia species (Melastomataceae). Journal of medicinal foods, v. 11, n. 1, p. 120-126, 2008. VEIGA JUNIOR, V. F.; PINTO, A. C.; MACIEL, M. A. M. Plantas medicinais: cura segura?. Química Nova, v. 28, n. 3, p. 519-528, 2005.