AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUIMICA DA PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS

DANIELA DE CARVALHO MARTINS AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUIMICA DA PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS Orientadora: Profª Drª Ana Maria Reis Ferreira Universidade Federal Fluminense NITERÓI 2008

DANIELA DE CARVALHO MARTINS AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Anatomia Patológica Humana e Veterinária. Orientadora: Profª Drª Ana Maria Reis Ferreira NITERÓI 2008

DANIELA DE CARVALHO MARTINS AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS Orientadora: Profª Drª Ana Maria Reis Ferreira Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Anatomia Patológica Humana e Veterinária. Aprovada em 30 de maio de 2008. BANCA EXAMINADORA Profº Drº Geovanni Dantas Cassali Departamento de Patologia Geral - UFMG Profª Drª Maria de Lourdes Gonçalves Ferreira Departamento de Patologia e Clínica Veterinária UFF Profª Drª Marcela Freire Vallim de Mello Departamento de Patologia e Clínica Veterinária UFF Profª Drª Terezinha de Jesus Sirotheau-Corrêa Departamento de Morfologia - UFF Profª Drª Marilene de Farias Brito Queiroz Departamento de Epidemiologia e Saúde Publica - UFRRJ NITERÓI 2008

A toda minha família, em especial, meus pais, meu irmão, meu marido, minha avó (in memorian) e meus animais Bud, Bingo e em especial Teddy (in memorian). Com muito amor e carinho, pois é impossível ser feliz sozinho e sem o AMOR a vida seria insípida. Amo muito vocês!!

AGRADECIMENTOS A Deus, nosso Pai supremo, fonte eterna de Amor, pelas bênçãos de sermos e existirmos, somente Ele tem o poder sobre os homens e será sempre conforme a Sua vontade. A Ana Maria Reis Ferreira, minha amiga pessoal, profissional e orientadora. Por todos esses anos, desde a iniciação científica, pela paciência e profissionalismo, contribuindo enormemente para meu amadurecimento científico. O que sou profissionalmente, devo a você. Muito obrigada pelas inúmeras vezes em que mediante minhas dúvidas, dificuldades, medos e incertezas esteve ao meu lado e me amparado, por ter me mostrado que sempre há um caminho. Além dos ensinamentos, ofereceu-me apoio fraterno. Minha gratidão, admiração e respeito imensuráveis. Muito obrigada por tudo! A Eliene Carvalho da Fonseca, amiga e chefe do Laboratório de Imuno-histoquímica do HUAP-UFF. Pela calorosa acolhida todos esses anos, desde a iniciação científica, por estar sempre de braços abertos, pela enorme competência, sempre oferecendo sugestões e contribuindo com sua experiência. Obrigada pela confiança em mim depositada, amizade e ensinamentos. A Ana Beatriz Soares Monteiro, pela paciência, sempre com muita disposição e boa vontade na realização das análises estatísticas. Obrigada por tudo! A Geovanni Dantas Cassali pela amizade, disponibilidade e colaboração de forma ética e responsável na leitura e revisão deste trabalho. Muito obrigada! A Maria de Lourdes Gonçalves Ferreira, pela amizade, carinho, compreensão, apoio, competência e colaboração na leitura e revisão deste trabalho. Muito obrigada! As meninas, técnicas do Laboratório de Imuno-histoquímica do HUAP-UFF, em especial Rita de Cássia Costa Cunha e Kátia Valéria Ferreira Costa, minhas amigas, pelo apoio, amizade de longa data, companheirismo, ajuda sempre presente,

compartilhando valiosas sugestões para a melhoria de nossas reações imunohistoquímicas. Obrigada por tudo! A Antonio Carlos dos Santos, pela simpatia, dedicação e paciência na realização dos cortes histológicos. Ao curso de Pós-graduação em Patologia da UFF, em especial a Profª Drª Eliane Pedra Dias, coordenadora e Thereza Cristina Fontana de Paiva (Tê), secretária, pelo apoio, ajuda, companheirismo, colaboração e competência. A minha família, em especial minha mãe, Marilza de Carvalho Martins, meu pai, Wilson Martins e meu irmão Walace de Carvalho Martins, extensivo também a Mainha, Dindão, Suzy e Alex, aos quais devo tudo que sou e todas as minhas conquistas, por toda compreensão, por minhas ausências e abandono. Sem vocês nada disso seria possível. A vocês meu amor, meu amor, meu amor!!! A minha avó, Azumitha de Carvalho Grado (in memorian), que nos deixou há tão pouco tempo, o meu amor, meu carinho e saudades eternas. Ao meu amigo e marido, André Luis Tenório e Silva, pelo carinho, amor, pela paciência, e por toda sua compreensão nas horas em que estive ausente. A Elan Cardozo Paes-de-Almeida, minha amiga, exemplo profissional, que nunca mediu esforços para ajudar, pelo carinho, cumplicidade, incentivo constante, sempre com muita disposição e boa vontade. Obrigada por tudo! A Anna Carolina Donato, Juliana Leite, Marcela Freire, minhas amigas, pelo estímulo, pela ajuda sempre constante, convívio extremamente agradável, pelo apoio e palavras encorajadoras. A Universidade Unigranrio, em especial ao Profº Drº Carlos Henrique de Freitas Burity, diretor do Instituto de Biociências, pelo apoio, compreensão, competência, respeito, seriedade, paciência e plena disponibilidade. Muito obrigada!

Aos amigos e companheiros da Unigranrio, em especial, Viviane Moreira de Lima, Ricardo Luis de Azevedo Pereira e João Cossatis, pela amizade, por terem me ouvido quando precisei, pelo apoio sempre constante e incentivo. Obrigada pro tudo! Aos meus animais, Bud, Bingo e em especial Teddy (in memorian), pela amizade sincera e desinteressada, pelo companheirismo, lealdade, fidelidade e amor incondicional. Muitas, muitas saudades! Aos animais, únicos responsáveis pela minha escolha profissional. A todos que direta ou indiretamente colaboraram na elaboração deste trabalho, meus sinceros agradecimentos. Muito obrigada!

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 17 2 REVISÃO DE LITERATURA 20 2.1 NEOPLASIA MAMÁRIA 20 2.2 PROLIFERAÇÃO CELULAR 26 2.2.1 MARCADORES DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 30 2.2.1.1 Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA) 30 2.2.1.2 Marcador de Proliferação Celular KI-67 34 2.3 MORTE CELULAR POR APOPTOSE 38 2.3.1 MARCADOR DE APOPTOSE CASPASE-3 45 3 HIPÓTESES 48 4 OBJETIVOS 49 4.1 OBJETIVO GERAL 49 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 49 5 MATERIAIS E MÉTODOS 50 5.1 MATERIAL 50 5.2 PROCEDIMENTOS 51 5.2.1 IMUNO-HISTOQUÍMICA 51 5.3 ANÁLISE DO MATERIAL 54 5.3.1 ANÁLISES HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA 54 5.3.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA 55 6 RESULTADOS 56 6.1 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA 57 6.2 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA 63 6.2.1 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO COM O ANTICORPO ANTI-PCNA 63 (ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR) 6.2.2 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO COM O ANTICORPO ANTI-KI-67 68 6.2.3 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO COM O ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 73 CLIVADA 6.2.4 CORRELAÇÃO DAS IMUNOMARCAÇÕES COM OS ANTICORPOS ANTI- 78 PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA 7 DISCUSSÃO 98 8 CONCLUSÕES 110 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 111 10 PRODUÇÃO CIENTÍFICA 126 11 ANEXOS 128 11.1 ANEXO 1 128

LISTA DE FIGURAS Figura 1: CARCINOSSARCOMA MAMÁRIO CANINO COLORAÇÃO HE p.84 Figura 2: TUMOR MISTO MALIGNO MAMÁRIO CANINO COLORAÇÃO HE p.85 Figura 3: ADENOCARCINOMA TUBULAR COMPLEXO MAMÁRIO CANINO COLORAÇÃO HE p.86 Figura 4: ADENOCARCINOMA TUBULAR SIMPLES MAMÁRIO CANINO COLORAÇÃO HE p.87 Figura 5: ADENOCARCINOMA PAPILÍFERO COMPLEXO MAMÁRIO CANINO COLORAÇÃO HE p.88 Figura 6: ADENOCARCINOMA PAPILÍFERO SIMPLES MAMÁRIO CANINO COLORAÇÃO HE p.89 Figura 7: CARCINOMA SÓLIDO SIMPLES MAMÁRIO CANINO COLORAÇÃO HE p.90 Figura 8: ADENOCARCINOMA PAPILÍFERO SIMPLES MAMÁRIO CANINO ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA p.91 Figura 9: ADENOCARCINOMA TUBULAR COMPLEXO MAMÁRIO CANINO ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA p.92 Figura 10: ADENOCARCINOMA PAPILÍFERO COMPLEXO MAMÁRIO CANINO ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA p.93 Figura 11: CARCINOMA SÓLIDO SIMPLES MAMÁRIO CANINO ANTI- PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA p.94 Figura 12: CARCINOSSARCOMA MAMÁRIO CANINO, ÁREA EPITELIAL ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA p.95

Figura 13: TUMOR MISTO MALIGNO MAMÁRIO CANINO, ÁREA EPITELIAL ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA p.96 Figura 14: CARCINOSSARCOMA MAMÁRIO CANINO, ÁREA MESENQUIMAL ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA p.97

LISTA DE TABELAS Tabela 1: FAIXA ETÁRIA DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS p.56 Tabela 2: FREQÜÊNCIA DAS RAÇAS DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS p.57 Tabela 3: FREQÜÊNCIA DOS DIAGNÓSTICOS HISTOPATOLÓGICOS DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS p.58 Tabela 4: FREQÜÊNCIA DOS DIAGNÓSTICOS HISTOPATOLÓGICOS E A FAIXA ETÁRIA DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS p.58 Tabela 5: FREQÜÊNCIA DAS MARGENS DE SEGURANÇA NAS AMOSTRAS DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS p.62 Tabela 6: VALORES DA MÉDIA E MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS DOS DUCTOS, IMUNOPOSITIVAMENTE MARCADOS PELO ANTICORPO ANTI- PCNA, DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO p.65 Tabela 7: VALORES DA MÉDIA E DA MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS IMUNOMARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-PCNA, DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA p.67 Tabela 8: VALORES DA MÉDIA E MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS DOS DUCTOS, IMUNOPOSITIVAMENTE MARCADOS PELO ANTICORPO ANTI- Ki-67, POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO p.70 Tabela 9: VALORES DA MÉDIA E DA MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS IMUNOMARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-KI-67, DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA p.72

Tabela 10: VALORES DA MÉDIA E MEDIANA DO NÚMERO DE CÉLULAS EPITELIAIS DOS DUCTOS, IMUNOPOSITIVAMENTE MARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA, POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO p.75 Tabela 11: VALORES DA MÉDIA E DA MEDIANA DO NÚMERO DE CÉLULAS EPITELIAIS IMUNOMARCADOS PELO ANTICORPO ANTI- CASPASE-3 CLIVADA, DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA p.77

LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS, DAS CÉLULAS EPITELIAIS, MARCADOS IMUNOPOSITIVAMENTE PELO ANTICORPO ANTI- PCNA POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO p.66 Gráfico 2: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS COM O ANTICORPO ANTI-PCNA DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA p.68 Gráfico 3: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS IMUNOPOSITIVAMENTE PELO ANTICORPO ANTI- KI-67 POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO p.71 Gráfico 4: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS COM O ANTICORPO ANTI-KI-67 DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA p.73 Gráfico 5: BOXPLOT DA MÉDIA DE CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS IMUNOPOSITIVAMENTE PELO ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO p.76 Gráfico 6: BOXPLOT DA MÉDIA DE CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS COM O ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA p.78 Gráfico 7: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-KI-67 X ANTI-PCNA DAS CÉLULAS EPITELIAIS DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS p.79 Gráfico 8: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-PCNA X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA DAS CÉLULAS EPITELIAIS DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS p.80 Gráfico 9: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-KI-67 X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA DAS CÉLULAS EPITELIAIS DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS p.80

Gráfico 10: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-Ki-67 X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA NAS ÁREAS EPITELIAIS DOS ADENOCARCINOMAS TUBULARES SIMPLES p.82 Gráfico 11: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-PCNA X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA NAS ÁREAS EPITELIAIS DOS ADENOCARCINOMAS TUBULARES SIMPLES p.83

LISTA DE ABREVIATURAS APAF-1 Fator ativador de protease da apoptose-1 BSA Soro albumina bovina C Grau Celsius CDK Quinase ciclina-dependente cm Centímetros DAB Diaminobenzidina DP Desvio Padrão Fase G0 Fase de repouso Fase G1 Fase de pré-síntese Fase G2 Fase de crescimento pré-mitótico Fase M Mitose Fase S Fase de síntese Fig Figura Graf Gráfico HE Hematoxilina-eosina hs horas IHQ Imuno-Histoquímica kd Kilodaltons µm micrômetros OMS Organização mundial de saúde PC Papilífero complexo PCNA Antígeno nuclear de proliferação celular PEST Prolina-ácido glutâmico-serina-treonina PS Papilífero simples PST Tempo de sobrevivência pós-cirúrgica SRD Sem Raça Definida Tab Tabela TNF-α Fator de necrose tumoral α TNFR Receptor do fator de necrose tumoral TC Tubular complexo TS Tubular simples

RESUMO A neoplasia mamária na espécie canina é a mais comum na cadela e vem sendo muito pesquisada ultimamente, por servir como importante modelo para a carcinogênese mamária nas mulheres. A classificação é a característica essencial para uma avaliação diagnóstica, prognóstica e conseqüentemente no direcionamento de uma conduta clínico-cirúrgica adequada e como às vezes se torna difícil, outras técnicas como um auxílio são utilizadas. A utilização de marcadores de proliferação celular é um método objetivo e quantificável mais sensível e específico para avaliar a atividade mitótica em neoplasias, do que a contagem do número de mitoses na histologia convencional e a identificação da apoptose, é importante pois durante o crescimento tumoral existe um equilíbrio entre a proliferação e morte celular, no qual o processo de morte celular programada está envolvido. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade proliferativa e apoptótica em neoplasias mamárias malignas caninas associando-se os resultados. Neste trabalho foram utilizados 61 casos de neoplasias malignas mamárias de cadelas. As neoplasias foram classificadas de acordo com a Organização Mundial de Saúde e a técnica utilizada foi a imuno-histoquímica, através do método LSAB, sendo utilizados como anticorpos primários o anti-pcna, anti-ki-67, e anti-caspase- 3 clivada. Das 61 amostras através de histopatologia, foram observados cinco carcinossarcomas, nove carcinomas em tumores mistos, seis adenocarcinomas tubulares complexos, doze adenocarcinomas tubulares simples, treze adenocarcinomas papilíferos complexos, quinze adenocarcinomas papilíferos simples e um carcinoma sólido simples. Não houve pré-disposição racial e a maioria dos animais acometidos tinham entre cinco e dez anos de idade. Nas neoplasias mamárias malignas a expressão do PCNA e Ki-67 foi maior que a expressão da Caspase-3 clivada e existiu uma correlação positiva significativa entre as expressões de PCNA e Ki-67. Com relação aos adenocarcinomas tubulares simples o Ki-67 mostrou uma correlação negativa significativa com a Caspase-3 clivada e o PCNA evidenciou uma tendência de correlação negativa com a Caspase-3 clivada. O estudo da proliferação e morte celulares surge de forma a acrescentar mais informações sobre o comportamento neoplásico. A associação destes marcadores prognósticos à outros fatores comumente utilizados na rotina, podem complementar a classificação já existente das neoplasias e auxiliar de maneira bem expressiva na elaboração de um diagnóstico e prognóstico mais precisos das neoplasias mamárias e conseqüentemente contribuir para uma melhor sobrevida do paciente devido a possibilidade de um tratamento clínico mais adequado e individualizado, podendo desta forma também ser utilizado como modelo experimental nos estudos comparado a neoplasia mamária humana. Palavras Chaves: Neoplasia Mamária, Cadela, PCNA, Ki-67, Caspase-3 clivada

ABSTRACT Canine mammary neoplasia is the most common found in the bitch. Researches are being carried out at present as they can be used as an important model for mammary carcinogenesis in women. Classification is the essential characteristic for prognosis and diagnostic evaluation, so that an adequate clinicalsurgical conduct may be carried out, but, as this approach sometimes presents difficulties, other techniques are then used. The use of cell proliferation markers is an objective and quantifiable method, more sensitive and specific to assess the mitotic activity in neoplasia, rather than the mitosis count, as it is done in conventional histology, to identify apoptosis. Therefore, a balance between proliferation and cell death during tumor growth is an important factor, where the process of programmed cell-death is involved. The purpose of this work is to assess the proliferative and apoptic activity in canine malignant mammary neoplasia, associating the results. Sixty-one cases of bitches with malignant mammary neoplasia were used in this work. Neoplasias were classified according to the World Health Organization classification; the immunohistochemical technique was applied by means of the LSAB method; anti-pcna, anti-ki-67 were used as primary antibodies, as well as cleaved anti-caspase-3. Considering 61 samples, by means of the histopathology procedure, five carcinosarcomas, nine carcinomas in mixed tumors, six complex tubular adenocarcinomas, 12 primary tubular adenocarcinomas, 13 complex papilliferous adenocarcinomas, 15 primary papilliferous adenocarcinomas and a primary solid carcinoma were observed. No breed predisposition was found and most of the animals with the disease were between 5 and 10 years old. In the malignant mammary neoplasia, the expression of PCNA and Ki-67 showed to be greater in number than the expression of cleaved Caspase-3 and a positive correlation among the expressions of PCNA and Ki-67 was observed. Regarding primary tubular adenocarcinomas, Ki-67 presented a significant negative correlation with the cleaved Caspase-3 and PCNA showed a negative correlation tendency, which was also significant with the cleaved Caspase-3. The proliferation and cell death study arises to add more information on neoplasic behavior. The association of these prognostic markers to other factors commonly used in routine procedures can complement the already existing classification of neoplasia, providing expressive support in the elaboration of a more precise diagnostic and prognosis of mammary neoplasia, thus contributing to the patient s extra life, facilitating a more adequate and individualized clinical treatment. This may also be used as an experimental model in the studies that compare the human mammary neoplasia. Key words: Mammary Neoplasia, Bitches, PCNA, Ki-67, Cleaved Caspase-3

1 INTRODUÇÃO O câncer na espécie humana e em animais domésticos é uma das patologias que mais levam ao óbito, sendo o de mama um dos mais importantes. A importância dos tumores de mama em cadelas tem aumentado, devido à freqüência com que casos desse tipo surgem na clínica dos animais de companhia, e devido às semelhanças que tem com os tumores de mama em humanos, oferecendo deste modo um relevante modelo para o câncer de mama em mulheres (RUTTEMAN ET AL, 1988, NERURKAR ET AL, 1989, JUBB ET AL, 1993 e FONSECA & DALECK, 2000). Devido a isso, pode-se entender por que o câncer de mama tem recebido uma grande publicidade e se tornado o centro de muitos estudos acerca de sua origem, métodos de diagnósticos e tratamento (ZUCCARI ET AL, 2001, FERRI, 2003, KARAYANNOPOULOU, ET AL, 2005, LESTER, 2006 e KING, 2007). A classificação das neoplasias mamárias em cães tem sido uma controvérsia por causa de sua vasta complexidade, além disso, nenhuma das classificações propostas para as neoplasias mamárias caninas é universalmente aceita por todos

os patologistas veterinários, com isso numerosos esquemas de classificação têm sido realizados, mas cada um possui uma certa limitação (JONES ET AL, 2000). A classificação é a característica essencial para a avaliação prognóstica, tendo uma grande importância para determinar métodos de tratamento e como às vezes se torna difícil, outras técnicas como um auxílio são utilizadas (KURZMAN & GILBERTSON, 1986, HELLMÉN ET AL, 1993, YAMAGAMI ET AL, 1996, CASSALI ET AL, 2000 e PIRES ET AL, 2004). Atualmente, novos fatores prognósticos em tumores mamários caninos estão sendo estudados (PÉREZ ALENZA ET AL, 1997, GERALDES ET AL, 2000, CASSALI, 2000, KARAYANNOPOULOU, ET AL, 2005, TERZIAN ET AL, 2007). Técnicas especializadas como a imuno-histoquímica, para identificação e avaliação de marcadores prognósticos, podem servir como base para o diagnóstico e prognóstico na ausência de uma característica morfológica apropriada (KURZMAN & GILBERTSON, 1986, MALUF & KOERNER, 1994, CASSALI ET AL, 2000, PIRES ET AL, 2004, BRASILEIRO FILHO ET AL, 2006, TERZIAN ET AL, 2007 e KING, 2007). A utilização de marcadores como o Ki-67 e PCNA é um método objetivo e quantificável mais sensível e específico para avaliar a proliferação celular em neoplasias, do que a contagem do número de mitoses na histologia convencional (ESPOSITO ET AL, 2000 e RIBEIRO JUNIOR ET AL, 2000) e a identificação da apoptose, através da caspase-3 clivada se faz importante pois durante o crescimento tumoral existe um equilíbrio entre a proliferação e morte celular, no qual

o processo de morte celular programada está envolvido. Este balanço entre proliferação, diferenciação e morte celulares determina o número de células numa população, bem como o seu tamanho ou mais precisamente o estágio de um tumor (SHEN ET AL, 1998, SIMÃO ET AL, 1999, GONZÁLEZ-CÁMPORA ET AL, 2000 e LIU ET AL, 2001). A mensuração da proliferação celular e da apoptose podem melhorar a confiabilidade do prognóstico do comportamento tumoral, auxiliando na caracterização biológica do tumor (DE JONG ET AL, 2000). Isso justifica o grande interesse, atualmente, na identificação de marcadores com valor prognóstico e em parâmetros biológicos não subjetivos de mensuração como a proliferação celular e apoptose, para proporcionar uma informação diagnóstica e prognóstica mais precisa. Desta maneira, este trabalho, através da associação entre técnicas de imuno-histoquímica para a avaliação da atividade de proliferação celular e apoptótica, poderá contribuir para futuros estudos relacionados à conduta clínico-cirúrgica, o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas, imunoprofilaxia do câncer e proporcionar uma análise comparativa com o câncer de mama na mulher.

2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 NEOPLASIA MAMÁRIA O câncer é uma das maiores causas de mortalidade entre os seres humanos e os animais domésticos. As neoplasias das glândulas mamárias ocorrem freqüentemente em cães, gatos, ratos e camundongos. Em outras espécies de animais domésticos e de laboratório, essas neoplasias não são freqüentes. As neoplasias mamárias em cadelas são as neoplasias mais comumente encontradas. (BRODEY ET AL, 1983, BIRCHARD & SHERDING, 1994, ROSTAMI ET AL, 1994, WITHROW & MACEWEN, 1996, COELHO, 2002, CASSALI, 2003 e KARAYANNOPOULOU ET AL, 2005), no entanto, alguns pesquisadores apontam que essas neoplasias constituem a segunda forma mais comum em cães, sendo somente ultrapassado pelos tumores de pele, os tumores mamários representam de 25 a 50% de todas as neoplasias das cadelas (JONES ET AL, 2000, FONSECA & DALECK, 2000, SOUZA ET AL, 2001 e CUSTÓDIO, 2003).

As neoplasias mamárias são raras nos animais jovens (MIALOT, 1988). O risco para o desenvolvimento da neoplasia mamária em cadelas aumenta significativamente com a idade (JONES ET AL, 2000). A população de risco, no que se refere aos tumores mamários, é constituída por cadelas entre os cinco e doze anos de idade, sendo a idade de maior susceptibilidade entre os nove e os onze anos, não existindo predisposição racial (ETTINGER, 1992, BOLDIZSÁR ET AL, 1992, OLIVEIRA ET AL, 2003, CASSALI, 2003, ROSCIANI ET AL, 2003, MARIANO ET AL, 2006 e TROMPOWSKY, 2007). A ovariohisterectomia nas cadelas jovens exerce um nítido efeito profilático (MIALOT, 1988 e SOARES E SILVA, 1998). Quando realizada antes do 1º cio reduz a incidência de neoplasia de mama para 0,5%; após o 1º cio diminui para 8% e após o 2º cio, para 26% (DALECK, 1996). Cadelas submetidas à ovariohisterectomia após os dois anos e meio de idade, ou concomitantemente à mastectomia, não são beneficiadas pelos efeitos profiláticos desse procedimento, nem tem efeito sobre o prognóstico, porque nessa idade, as glândulas mamárias já se desenvolveram plenamente (MOULTON, 1990, YAMAGAMI ET AL, 1996, MORRIS ET AL, 1998 e FONSECA & DALECK, 2000). O desenvolvimento de neoplasias malignas antes dos cinco anos de idade é raro, normalmente são neoplasias de caráter benigno (PEREZ ALENZA, 2000). As neoplasias de mama possuem uma incidência três vezes mais alta nas cadelas do que na mulher e de forma semelhante à espécie humana, ocorre quase que exclusivamente em fêmeas (QUEIROGA E LOPES, 2002, CASSALI, 2003,

LESTER, 2006, CAVALCANTI & CASSALI, 2006, SILVA ET AL, 2007 e MONTAG & KUMAR, 2008). As neoplasias mamárias em cadelas possuem uma estreita semelhança com a neoplasia humana (NERURKAR ET AL, 1989). Por isso, oferecem um importante modelo experimental para o estudo do câncer de mama em mulheres (RUTTEMAN ET AL, 1988, JUBB ET AL, 1993, PELETEIRO, 1994 e MOTTOLESE ET AL, 1994). Devido a isso, pode-se entender por que o câncer de mama tem recebido uma notória atenção e se tornado o centro de muitos estudos acerca de sua origem, métodos de diagnósticos e tratamento (ZUCCARI ET AL, 2001, FERRI, 2003, KARAYANNOPOULOU ET AL, 2005, LESTER, 2006 e KING, 2007). Nos caninos, os mais comuns são os tumores mistos (NELSON ET AL, 1972 e BRODEY ET AL, 1983). De acordo com MIALOT (1988), HELLMÉN e colaboradores (1993), DALECK e colaboradores (1998), OLIVEIRA e colaboradores (2003), CASSALI (2003) e MARIANO e colaboradores (2006), dentre os tumores malignos, os adenocarcinomas são os mais freqüentes. Os sarcomas de glândula mamária em cadelas são raros, inferior a 10% (ETTINGER, 1992). Num estudo realizado por NERURKAR e colaboradores (1989), de 52 neoplasias mamárias caninas, 14 eram benignas e 38 malignas, sendo que destas apenas 3 foram classificadas como carcinossarcoma e 30 eram adenocarcinomas complexo. Resultados semelhantes também foram encontrados por HELLMÉN e colaboradores (1993), ZANINOVIC & SIMCIC (1994) e DALECK e colaboradores

(1998). Já num levantamento de 342 tumores mamários, 178 (52,05%) foram benignos e 164 (47,95%) foram malignos (CASSALI, 2000). Na maioria dos casos, o tratamento da neoplasia primária é conseguido com êxito, mas complicações freqüentemente ocorrem e é devido ao alto poder invasivo e metastático de certos tipos de câncer. O comportamento clínico varia de nódulos bem circunscritos com um crescimento estacionário a amplo e algumas vezes nódulos ulcerados, os quais crescem rapidamente e se tornam bem aderidos aos tecidos adjacentes. A presença de ulceração na pele tem sido associada com malignidade e é considerada um fator independente fortemente ligado a um prognóstico desfavorável (PEREZ ALENZA, 2000). A etiologia exata das neoplasias mamárias é desconhecida (OGILVIE, 1983 e HAHN & ADAMS, 1997). Em mulheres é aceitável a relação da doença com fatores próprios do hospedeiro, como a duração da atividade ovariana; a hereditariedade e com fatores ambientais, tais como a alimentação e a utilização de determinados medicamentos, não sendo estabelecida também nenhuma ligação direta entre vírus e o câncer de mama (LOPES ET AL, 1996, ROSEN, 1997 e CASSALI, 2003). Clinicamente é impossível a distinção de certas displasias e uma neoplasia mamária, esta sendo encontrada em cerca de 10% dos casos. Por outro lado, é muito freqüente no exame histológico se evidenciar as displasias associadas a uma neoplasia (MIALOT, 1988). Da mesma forma, uma neoplasia mamária maligna pode muitas vezes apresentar um quadro clínico de uma neoplasia mamária benigna e a aparência clínica de um tumor mamário é extremamente diversa, não podendo

assim ser considerado como única ferramenta para elaboração de um prognóstico (MENDES ET AL, 2005). Vários sistemas de classificação existem para neoplasias mamárias (MOULTON ET AL, 1970; MISDORP ET AL, 1971; MISDORP ET AL, 1972; MISDORP ET AL, 1973; FOWLER ET AL, 1974, MONLUX ET AL, 1977 e MOULTON, 1990), entretanto um dos mais adotados é o de MISDORP e colaboradores (1999), mas a classificação destas neoplasias em cães tem sido uma controvérsia por causa de sua vasta complexidade, pois nenhuma das classificações propostas para as neoplasias mamárias caninas é universalmente aceita por todos os patologistas veterinários, com isso há ausência de critérios uniformes para diferenciar os tipos neoplásicos. Numerosos esquemas de classificação têm sido realizados, mas cada um possui certa limitação (KURZMAN & GILBERTSON, 1986, JONES ET AL, 2000, CASSALI, 2003 e KARAYANNOPOULOU ET AL, 2005). Segundo GILBERTSON e colaboradores (1983), é difícil e muitas vezes impossível se comparar resultados de estudos realizados por pesquisadores de diferentes instituições e chegar a conclusões válidas sobre as características biológicas de diferentes tipos de neoplasias mamárias. A avaliação histopatológica é realizada de uma forma subjetiva e nem sempre apresenta um resultado satisfatório em relação às neoplasias mamárias (PREZIOSI ET AL, 1995). Isso vem a justificar o grande interesse de investigação, através da imuno-histoquímica, de marcadores com valor prognóstico (SIRVENT ET AL, 1995, BODIS ET AL, 1996, SHEN ET AL, 1998, POPOVSKA ET AL, 1999, CASSALI,

2000, MACIOROWSKI ET AL, 2001, LIU ET AL, 2001, RUBIO, 2002, ZHAN ET AL, 2002, PIRES ET AL, 2004 e KING, 2007). O diagnóstico tardio tem sido associado a uma diminuição no tempo de sobrevivência livre da doença e no tempo de sobrevivência total do animal após a excisão cirúrgica, este é um fator independente e fortemente relacionado a um diagnóstico desfavorável para cães com neoplasias mamárias (PEREZ ALENZA, 2000). Determinar o prognóstico para o paciente canino com neoplasia mamária é difícil, pois o comportamento biológico dessas neoplasias varia muito. A considerável heterogeneidade das características histológicas e o comportamento desses tumores têm levado a conturbadas conclusões em relação ao critério prognóstico e administração terapêutica (GILBERTSON ET AL, 1983, KURZMAN & GILBERTSON, 1986 e KARAYANNOPOULOU ET AL, 2005). O prognóstico para o tratamento depende de vários fatores, como o tipo histológico neoplásico, tamanho do tumor, grau de invasividade, grau de diferenciação nuclear, estado dos linfonodos, o tempo de demora em se fazer o diagnóstico, presença ou não de ulceração e estado dos receptores hormonais. A ovariectomia ou ovariohisterectomia realizada juntamente com a mastectomia não apresenta efeito sobre o prognóstico, em cães com neoplasias de glândulas mamárias já estabelecidas, assim como a localização da neoplasia e o número de nódulos presentes (YAMAGAMI ET AL, 1996 e WITHROW & MACEWEN, 1996).

No câncer de mama hoje em dia, não são somente estudados índices patológicos convencionais tal como, tamanho do tumor, grau histológico e estado de linfonodos, mas em especial técnicas de imuno-histoquímica, para a detecção de receptores hormonais, fração de proliferação celular, morte celular e amplificação de certos oncogenes. Esses dados são de suma importância na tentativa de prever o comportamento biológico dos tumores e por permitir a seleção de uma melhor conduta terapêutica pelo clínico (SIRVENT ET AL, 1995, CASSALI ET AL, 2000 e SILVA ET AL, 2002). Da mesma forma, o estudo da expressão de marcadores biomoleculares em tumores malignos de glândulas mamárias auxilia na detecção de pacientes com alto risco de novas recidivas (SILVA ET AL, 2002 e KUSHLINSKII ET AL, 2004). 2.2 PROLIFERAÇÃO CELULAR Os processos-chave na proliferação das células são a replicação do DNA e a mitose. A seqüência de eventos que controla estes dois processos é conhecida como ciclo celular (KUMAR ET AL, 2008). Durante o ciclo celular, as células têm três caminhos possíveis a percorrer: permanecer no ciclo e, portanto seguir para uma próxima divisão; permanecer viva sem divisões adicionais, ou seja, seguindo para fase G0; ou morrer por apoptose. As decisões sobre qual caminho a ser seguido acontecem em dois pontos cardinais, chamados checkpoints, o ponto onde há comprometimento com a replicação do DNA, chamado ponto de restrição, e aquele onde há comprometimento com a

divisão mitótica no final de G2 (ALVES ET AL, 1999). Estes pontos de controle permitem que quaisquer defeitos sejam editados e reparados, assegurando, assim, que as células-filhas recebam o complemento total da informação genética, idêntico ao da célula parental (CAUDELL, 2004 e RIBEIRO-SILVA ET AL, 2006). As células na fase G1 (pré-síntese), estão se preparando para replicação do DNA e sofrem muitas alterações na expressão de genes, incluindo a síntese de proteínas ciclinas que são essenciais para iniciar a replicação normal do DNA. Múltiplas moléculas sensoras/efetoras também estão ativas durante essa fase do ciclo celular e podem detectar e reparar danos do DNA. A detecção de dano ao DNA desencadeia várias proteínas sensoras nucleares que sinalizam para bloquear a iniciação da síntese de DNA (fase S) ou iniciar apoptose para remover a célula danificada do reservatório em proliferação, este ponto de checagem é o chamado ponto de restrição, e como exemplo pode-se citar a proteína p53. Ao parar o ciclo celular em G1 a proteína p53 permite que os mecanismos de reparação atuem sobre os erros espontâneos ou induzidos no DNA. Se estes mecanismos falharem a p53 pode acionar eventos apoptóticos levando à destruição da célula danificada, através da estimulação de membros da família Bcl-2, encontrados na mitocôndria (CARROLL, 2004, RIBEIRO-SILVA ET AL, 2006, RUBIN ET AL, 2006 e KING, 2007). Se a fase G1 progredir sem detecção de mutações, dá-se início a replicação do DNA. Uma vez iniciada a fase S, as ciclinas formam complexos com enzimas chamadas de quinases ciclina-dependentes (CDKs) e estas trabalham pela promoção da replicação do DNA e vários aspectos do processo mitótico e são

necessárias para a progressão do ciclo celular. A fase G2 (crescimento pré-mitótico), é uma fase de repouso na qual as células se preparam para divisão e separação cromossômica. Inibidores específicos da progressão do ciclo celular em G2/M (mitose) também podem ser desencadeados por vários estímulos internos e externos. Os bloqueios na progressão do ciclo celular em G1 e G2 freqüentemente provocam apoptose como uma via de correção (CARROLL, 2004, RIBEIRO-SILVA ET AL, 2006, RUBIN ET AL, 2006, KING, 2007 e KUMAR ET AL, 2008). Uma característica crítica da maioria das neoplasias, principalmente, as malignas é a proliferação celular anormal, freqüentemente as células neoplásicas exibem uma perda do controle do ponto de restrição, ou seja, a gênese neoplásica é um processo complexo fundamentalmente relacionado a distúrbios no controle da proliferação celular, no qual uma célula normal sofre alteração na expressão gênica, o que lhe confere vantagens de crescimento sobre as demais células, sendo esta alteração herdada pelas células filhas (CUSTÓDIO, 2003, URRUTICOECHEA ET AL, 2005, RUBIN ET AL, 2006 e KING, 2007). Quanto maior a atividade proliferativa de uma neoplasia, pior será seu comportamento biológico. Como conseqüência, muitos esforços têm sido feitos no desenvolvimento de métodos objetivos para avaliar a proliferação celular e estudar o significado desses métodos no estudo das neoplasias, sendo úteis como um auxílio à terapêutica e ao prognóstico de pacientes de maneira individual (BRUNO & DARZYNKIEWICZ, 1992). De acordo com SCHMITT & GOBBI (2006) e RODASKI & DE NARDI (2006), o índice proliferativo tem uma boa correlação com a sobrevida e período livre de doença, além de ser um bom indicador de resposta à quimioterapia.

Na verdade, estudar a dinâmica celular é vital para a compreensão de uma grande variedade de processos fisiológicos e patológicos. Os métodos imunohistoquímicos, já se encontram entre os mais úteis e mais comumente utilizados para avaliação da proliferação celular, podendo servir como base para o diagnóstico e prognóstico na ausência de uma característica morfológica apropriada (KURZMAN & GILBERTSON, 1986; BAUER, 1990 e MALUF & KOERNER, 1994, KUSHLINSKII ET AL, 2004 e TERZIAN ET AL, 2007). Os métodos imuno-histoquímicos que utilizam marcadores de proliferação celular baseiam-se na detecção de antígenos cuja expressão tenha relação qualitativa ou quantitativa com uma ou mais fases do ciclo celular. HOLFSTÄDTER e colaboradores (1995) propõem o agrupamento destes antígenos em duas categorias: enzimas e cofatores que estão envolvidos na síntese de DNA durante a fase S do ciclo celular, onde se enquadra o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA Proliferation Cell Nuclear Antigen), mas também outros como a DNA polimerase alfa e a topoisomerase II alfa, e outras proteínas como Ki-67 (ALVES ET AL, 1999, KUSHLINSKII ET AL, 2004). A proliferação celular tem sido por muitos anos, mensurada através da contagem de figuras mitóticas, pela coloração de rotina hematoxilina e eosina, em cortes de tecidos. No entanto, isso proporciona menos informação do que os métodos mais recentes, devido ao período medido (fase M), ser considerado a menor porção do ciclo celular (PREZIOSI ET AL, 1995). Na maioria dos tecidos existem células que são encontradas no ciclo celular e fora dele, e a fração de

crescimento é a relação entre as células em divisão e o número total de células presentes no tecido (SCOTT ET AL, 1991). Um balanço entre proliferação, diferenciação e morte celulares determina o número de células numa população, bem como o seu tamanho ou mais precisamente o estágio de um tumor (SHEN ET AL, 1998). Muitos pesquisadores acreditam que a mensuração da proliferação celular e da apoptose podem melhorar a confiabilidade do prognóstico do comportamento tumoral, caracterizando biologicamente o tumor (DE JONG ET AL, 2000). 2.2.1 MARCADORES DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 2.2.1.1 Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA) Nos últimos anos o número de trabalhos que descrevem a aplicação dos anticorpos que reconhecem o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA Proliferation Cell Nuclear Antigen), como um marcador de proliferação celular em materiais histológicos tem sido grande, tanto Medicina humana quanto na Medicina Veterinária (HALL ET AL, 1990, MC CORMICK & HALL, 1992, PREZIOSI ET AL, 1995, ESPOSITO ET AL, 2000, FUNAKOSHI ET AL, 2000 e KUSHLINSKII ET AL, 2004). A disponibilidade de anticorpos monoclonais produzidos contra antígenos nucleares do ciclo celular se faz possível, por meio das técnicas de imuno-

histoquímica, um método rápido e fácil de avaliar a atividade cinética da neoplasia, juntamente com outros métodos como a medição do índice mitótico (SARLI ET AL, 1994 e SARLI ET AL, 1998). Esse interesse é uma conseqüência da ampla crença em considerar que cada marcador pode demonstrar ser útil como um indicador objetivo do comportamento biológico de pelo menos algumas formas de tumores, juntamente com a resistência de alguns epítopos de PCNA na fixação e no processamento convencional (HALL ET AL, 1990 e MC CORMICK & HALL, 1992). O PCNA é uma proteína altamente conservada, com homologia na seqüência de aminoácidos entre os mamíferos (ALMENDRAL ET AL, 1987). O gene para PCNA está presente não somente em mamíferos, mas também nas células de vegetais superiores (SUZUKA ET AL, 1989). Em 1978 MIYACHI e colaboradores, descreveram um soro autoimune de pacientes com Lupus Eritematoso Sistêmico, o qual reconheceu um antígeno nuclear distribuído nas células em proliferação, e foi conseqüentemente chamado de antígeno nuclear de proliferação celular (MC CORMICK & HALL, 1992), ou seja, o PCNA foi descrito como um auto-anticorpo (ALVES ET AL, 1999). Em 3% dos pacientes que sofrem de Lupus Eritematoso Sistêmico são encontrados anticorpos contra PCNA e foi através do uso do soro desses pacientes que a proteína foi primeiramente definida. Esses anticorpos policlonais têm sido usados para estudos in vivo e in vitro do PCNA (WASEEM & LANE, 1990).

O PCNA é uma proteína de 36 kd, reguladora do ciclo celular, detectada através da imunofluorescência (WASEEM & LANE, 1990). O PCNA é um auxiliar da DNA-polimerase-delta que atua na replicação celular (XIONG ET AL, 1992). A concentração de PCNA aumenta rapidamente no meio da fase G1 do ciclo celular, permanece elevado por toda fase S, então rapidamente diminui de G2/M para G1 (SARLI ET AL, 1994). Alguns aspectos biológicos complicam a interpretação de reações para o PCNA, pois há uma superexpressão em alguns tipos de neoplasias malignas, não relacionada às fases do ciclo celular, células normais adjacentes a neoplasias e fora do ciclo celular, podem também apresentar expressão do antígeno (HALL ET AL, 1990). Além disso, um outro fator bem conhecido é a sua meia vida relativamente longa, cerca de 20 horas, que permite que células que há muito já deixaram o ciclo celular ainda persistam apresentando o antígeno (BRAVO & BRAVO, 1987 e SCOTT ET AL, 1991). Algumas proteínas não degradadas podem ainda restar nas células (SARLI ET AL, 1994 e PREZIOSI ET AL, 1995), resultando numa proporção de positividade imuno-histoquímica maior do que a esperada quando avaliamos outros marcadores de proliferação celular (ALVES ET AL, 1999). O PCNA na imuno-histoquímica, mostra dois principais grupos de núcleos, fortemente marcados e menos intensamente marcados; quando o tecido é fixado em formol, somente a contagem dos núcleos fortemente marcados é sugerido por alguns autores para o uso, porque as células nas quais eles ocorrem estão incontestavelmente nas fases G1/S do ciclo celular (PREZIOSI ET AL, 1995). Desta forma, na avaliação do índice PCNA, alguns autores têm sugerido somente a

contagem desses núcleos para evitar a inclusão de células que não estão ciclando (SARLI ET AL, 1995). Uma ampla variedade de anticorpos que reconhecem o PCNA estão disponíveis. Comercialmente os reagentes disponíveis incluem os anticorpos monoclonais 19A2, 19F4 e PC10 (MC CORMICK & HALL, 1992). Dois anticorpos monoclonais designados 19A2 e 19F4 têm sido produzidos contra PCNA de coelho. Por Western blotting eles reconhecem PCNA de diferentes espécies de mamíferos. Seus epítopos têm sido localizados na região central da molécula de PCNA (WASEEM & LANE, 1990). É aparente que os epítopos reconhecidos por esses anticorpos são diferentes e existem diferenças nos efeitos de fixação e processamento sobre a detectabilidade desses epítopos. Além disso, parece existir diferenças entre o comportamento imuno-histoquímico desses anticorpos em comparação com os autoanticorpos humanos. Isso talvez seja uma explicação parcial para discrepância entre informações sobre a relação entre a imunoreatividade do PCNA e outros marcadores do ciclo celular (MC CORMICK & HALL, 1992). O clone PC10 reconhece epítopos de proteínas resistentes à parafina e ao formol, facilitando o uso de material reservado, que tem sido processado rotineiramente. Apesar de poder ser usado com recuperação de epítopos pelo calor (microondas, panela de pressão ou banho Maria), o PC10 é mais comumente usado sem este procedimento. O padrão de reação então parece ser fortemente influenciado pela fixação do tecido longos períodos de fixação em formol diminuem significativamente o percentual de células marcadas (ROWLANDS ET AL,

1991). Alguns autores têm sugerido que a fixação não deve ser maior que 48 horas (SARLI ET AL, 1995). 2.2.1.2 Marcador de Proliferação Celular Ki-67 Em 1983, GERDES e colaboradores descreveram a preparação de um anticorpo monoclonal de camundongo, dirigido a um antígeno presente em células em proliferação, que foi chamado de Ki-67. Ele reconhece um epítopo sobre um antígeno nuclear o qual é expressado nas células que estão no ciclo celular (YU & FILIPE, 1993). Essa proteína é considerada um componente da matriz nuclear (SARLI ET AL, 1994), e é um marcador que tem uma maior consistência biológica (ALVES ET AL, 1999 e URRUTICOECHEA ET AL, 2005). Estudos sugerem que a distribuição do Ki-67 não é dependente da presença de DNA ou de histonas, o que indica que o antígeno é associado com uma estrutura não protéica, não histônica conhecida como scaffold cromossômico ou é parte integral dela (FONATSCH ET AL, 1991 e ALVES ET AL, 1999), é uma proteína nuclear altamente protease sensitiva, ou seja, possui alta suscetibilidade ao tratamento com proteases, reunida por cadeia polipeptídica, é um complexo bimolecular com um peso molecular evidente de 345 e 395 kd (CASTAGNARO ET AL, 1998). O gene responsável pela expressão do antígeno Ki-67 está localizado no

braço longo do cromossomo humano 10 (locus 10q25) (SCHONK ET AL, 1989 e FONATSCH ET AL, 1991). A utilização do anticorpo Ki-67 tem sido proposta para determinar a fração de crescimento em neoplasias e em tecidos (GERDES ET AL, 1984 e KAMEL ET AL, 1989) e existem evidências que a imunomarcação deste anticorpo tem uma boa correlação com outros marcadores de proliferação celular (HALL & LEVISON, 1990 e URRUTICOECHEA ET AL, 2005). De acordo com ESPOSITO e colaboradores (2000), em carcinomas epidermóides do trato aerodigestivo superior em humanos, a expressão imuno-histoquímica do Ki-67 apresentou uma correlação positiva com a expressão do PCNA. Segundo SIRVENT e colaboradores (1995), o Ki-67 é um seguro, rápido e objetivo indicador do grau de agressividade tumoral, ao mesmo tempo, dependendo do grau de diferenciação da neoplasia, tem sido mostrado ser de valor prognóstico para sobrevivência e recorrência do câncer de mama. Em 1984, GERDES e colaboradores publicaram um estudo detalhado da expressão do Ki-67 nas diferentes fases do ciclo celular. A imunomarcação é expressada por todas as fases G1, S, G2 e M, do ciclo celular, com um pico de concentração na fase G2/M (SARLI ET AL, 1994 e SARLI ET AL, 1998). A expressão do Ki-67 é mínima no final da fase G1 e início da fase S e a sua taxa aumenta durante a segunda metade da fase S, e este antígeno desaparece rapidamente após a mitose (BRUNO & DARZYKIEWICZ, 1992). Este antígeno está localizado no nucléolo em G1, com uma distribuição, mais tarde, nucleoplásmica no

ciclo, aumentando sua intensidade durante as fases S e G2, atingindo um máximo na mitose. Com a progressão de S para G2, o antígeno Ki-67 está estreitamente associado com a cromatina e na mitose, toda imunoreatividade do Ki-67 está colocalizada com as cromátides (YU & FILIPE, 1993). Células que não estão no ciclo celular, ou seja, as que se encontram na fase G0, não mostram nenhuma reatividade para o anticorpo (SARLI ET AL, 1994). Também não foi encontrado nas células que estão entrando no ciclo celular, vindas de G0 para a parte inicial de G1 (CASTAGNARO ET AL, 1998). A vida média deste antígeno detectável é muito curta, o que é uma vantagem, sendo degradado em 1 hora ou menos após a mitose (BRUNO & DARZYKIEWICZ, 1992), isso provavelmente é devido à presença de numerosos PEST (prolina-ac. glutâmico-serina-treonina) os quais facilitam um rápido catabolismo (YU & FILIPE, 1993). Isso garante que células que já tenham saído do ciclo celular não apresentem o antígeno (ALVES ET AL, 1999). FALINI e colaboradores (1989) encontraram imunoreatividade do Ki-67 em tecidos de outros mamíferos além do homem, como por exemplo cordeiro, bezerro, cão, coelho e rato, mas a precisa extensão da qual ele é evolucionariamente conservado não é ainda determinado (YU & FILIPE, 1993). De qualquer forma, tendo em vista todos estes dados, nos parece claro que a marcação do Ki-67 resulta numa avaliação bastante aproximada da fração de crescimento de uma população celular. Marcação mesmo que tênue pode ser

considerada positiva, ou seja, a célula mesmo minimamente marcada encontra-se dentro do ciclo celular (SCOTT ET AL, 1991). CASTAGNARO e colaboradores (1998) investigaram a expressão imunohistoquímica do antígeno Ki-67 em 48 carcinomas mamários felinos, para observar se o índice Ki-67 forneceria uma indicação do tempo de sobrevivência pós-cirúrgica (PST). Um ano depois, 50% dos gatos estavam ainda vivos (grupo A), enquanto os outros 50% foram a óbito (grupo B). Uma diferença estatística significante no Ki-67 foi encontrada entre os dois grupos e nenhuma outra diferença estatística foi encontrada. O Ki-67 não correlacionou com a idade ou diferente tipo histológico, de acordo com a classificação da organização mundial de saúde. No carcinoma mamário em mulheres, a atividade proliferativa estudada através da expressão do anticorpo Ki-67, foi significativamente maior no carcinoma ductal infiltrativo do que no carcinoma ductal in situ (SHEN ET AL, 1998). Segundo ZUCARI (2001), o Ki-67 é um excelente marcador de proliferação celular no diagnóstico e prognóstico de carcinomas mamários e para a malignidade em neoplasias mamárias em cadelas. Verificando que o Ki-67 está associado com a proliferação celular, estando a fração de células neoplásicas positivas ao Ki-67 correlacionada com a evolução clínica da doença. Em relação ao diagnóstico histológico, marcadores proliferativos podem mostrar uma boa correlação com categorias histológicas, como por exemplo, distinguindo entre condições benignas e malignas, ou distinguindo entre

malignidades de alto e baixo grau. No entanto, estudos muitas vezes mostram um envolvimento considerável entre os grupos e não é, portanto, justificável na maioria dos casos usar índices de proliferação como um diagnóstico absoluto. O mais indicado é usar os marcadores de proliferação como um adjunto ao critério histológico convencional (YU & FILIPE, 1993). A determinação da imunoreatividade dos marcadores Ki-67 e PCNA é um método objetivo e quantificável mais sensível e específico para avaliar a proliferação celular do que a contagem do número de mitoses na histologia e que pode subsidiar informações prognósticas (ESPOSITO ET AL, 2000 e RIBEIRO JUNIOR ET AL, 2000). A identificação imuno-histoquímica de antígenos específicos para células em multiplicação, por anticorpos monoclonais como Ki-67 e PCNA oferece uma boa abordagem para a avaliação da fração de crescimento (SARLI ET AL, 1994, SARLI ET AL, 1998, PAPANTONIOU ET AL, 2003 e KUSHLINSKII ET AL, 2004). Segundo ALVES e colaboradores (1999) e URRUTICOECHEA e colaboradores (2005), o Ki- 67, na forma do MIB-1, é o melhor marcador operacional da proliferação celular para o patologista cirúrgico. 2.3 MORTE CELULAR POR APOPTOSE A apoptose, também denominada morte celular programada, refere-se a um mecanismo de suicídio celular. É uma via pré-organizada de morte celular,

desencadeada por diferentes sinais extracelulares e intracelulares. A apoptose detecta e destrói células que abrigam mutações, mantendo assim a consistência genética e prevenindo o desenvolvimento do câncer. Por outro lado clones de células tumorais freqüentemente desenvolvem mecanismos para impedir a apoptose (KERR ET AL, 1994, LIU ET AL, 2001, PORTH, 2004, PEREIRA, 2006 e RUBIN, STRAYER, 2006, GRIVICICH ET AL, 2007 e TERZIAN, 2007). A apoptose foi primeiramente descrita por KERR e colaboradores (1972), e caracteriza-se por uma seqüência de eventos programados que incluem ativação de enzimas endógenas, resultando em endonucleólise e culminando com a fragmentação do DNA e de proteínas nucleares e citoplasmáticas (WYLLIE, 1980, ARENDS ET AL, 1990, DARZYNKIEWICZ ET AL, 1992, KAJSTURA ET AL, 1996, HENGARTNER, 2000 e KUMAR ET AL, 2008). Através da análise histológica, nos tecidos corados com hematoxilina-eosina, a apoptose envolve células isoladas ou pequenos grupos de células, denominados corpos apoptóticos. A célula apoptótica aparece como uma massa redonda ou oval de citoplasma intensamente eosinofílico, com fragmentos de cromatina nuclear densa. Como a retração celular e a formação de corpúsculos apoptóticos ocorrem de forma acelerada e os fragmentos são rapidamente fagocitados, degradados ou expulsos para a luz, a apoptose pode ocorrer nos tecidos antes que se torne evidente em seções histológicas. Além disso, a apoptose, ao contrário da necrose, não apresenta reação inflamatória, dificultando a sua detecção histológica, pois o recrutamento de neutrófilos ou de linfócitos não é comum (HENGARTNER, 2000,

PEREIRA, 2006, MITCHELL, 2006, RUBIN & STRAYER, 2006 e KUMAR ET AL, 2008). A pesquisa do processo de morte celular programada, resultando em apoptose, tornou-se uma das áreas em maior expansão na biologia celular nos últimos anos. Este processo vem evidenciando que a eliminação das células é um dos eventos mais importantes na biologia celular e que constitui o principal mecanismo de morte celular em vários processos fisiológicos ou patológicos. Esse mecanismo de morte celular é importante na maturação de certos sistemas orgânicos, tal como na involução tímica; na remoção de células maduras; também na senescência, como ocorre, por exemplo, na regressão prostática; eliminação de células com dano imposto ao DNA por infecção viral, irradiação ou agentes citotóxicos e eliminação de células neoplásicas em tumores, mais freqüentemente em tumores com crescimento celular ativo (WYLLIE, 1980, SANDFORD ET AL, 1984, SAVILL ET AL, 1989, KERR ET AL, 1994, KAJSTURA ET AL, 1996, STEVENS & LOWE, 2002, SOUZA ET AL, 2004, SCHÖNDORF ET AL, 2004 e GRIVICICH ET AL, 2007). O crescimento da massa tumoral ocorre em função do aumento da taxa de proliferação celular em neoplasias, que é devido não somente ao crescimento descontrolado das células neoplásicas, mas também pela diminuição da taxa de morte celular programada, resultado da falta de células que sofrem apoptose; por outro lado, considera-se que, se o índice de apoptose apresenta-se alto, o tumor cresce muito lentamente (CARSON & RIBEIRO, 1993, CUELLO-CARRIÓN & CIOCCA, 1999, OKADA & MAK, 2004 e STRICKER & KUMAR, 2008). Apesar da

enorme variabilidade do câncer, evidências demonstram que a resistência à apoptose é uma das características mais marcantes da maioria dos tumores malignos (OKADA & MAK, 2004). Levando-se em consideração que durante o crescimento tumoral existe um equilíbrio ou um balanço entre a proliferação e morte celular, no qual o processo de apoptose está envolvido, o alto número de células apoptóticas será proporcional a alta taxa de proliferação celular e um prognóstico desfavorável (SIMÃO ET AL, 1999, GONZÁLEZ-CÁMPORA ET AL, 2000, LIU ET AL, 2001, NAKOPOULOU ET AL, 2001 e URRUTICOECHEA ET AL, 2005) Em um estudo realizado por PEREIRA e colaboradores (2003) com 30 casos de tumores mamários caninos, o número de células apoptóticas foi comparado ao prognóstico. Foi observado a possibilidade de um prognóstico desfavorável nos casos com uma alta taxa de células apoptóticas, sendo que nenhum tumor mamário canino, com prognóstico desfavorável apresentou menos que 30 células apoptóticas, contadas em 10 campos de maior aumento. Muitas publicações têm demonstrado que cânceres de mama em mulheres, com um alto índice apoptótico apresentam um prognóstico favorável quando comparado com o mesmo tipo de câncer com um menor índice apoptótico ou nenhuma apoptose (LIPPONEN & AALTOMAA, 1994, BERARDO ET AL, 1998, DEL BUFALO ET AL, 2002, SCHÖNDORF ET AL, 2003 e SIRVENT ET AL, 2004). Taxas extremamente baixas de apoptose podem prolongar a sobrevida ou reduzir a

substituição de células anormais. Esse acúmulo de células pode originar neoplasias malignas, como as de mama, próstata e ovários (MITCHELL, 2006). Embora a seqüência de eventos intracelulares responsáveis pela apoptose ainda não esteja totalmente conhecida, várias alterações bioquímicas foram implicadas no processo (STITES ET AL, 2000). O processo de apoptose é bastante complexo e regulado, em parte, por marcadores moleculares muitas vezes associados com a carcinogênese mamária, ou seja, um desequilíbrio entre a proliferação celular e a apoptose pode contribuir para a carcinogênese e progressão tumoral (LIU ET AL, 2001). Dado o papel central da apoptose em muitos processos patológicos, a identificação das células apoptóticas vem se tornando um aspecto importante na investigação da patogênese da doença (POPOVSKA ET AL, 1999, SATOH ET AL, 2000, DEL BUFALO ET AL, 2002, SCHÖNDORF ET AL, 2003, PEREIRA ET AL, 2003 e SIRVENT ET AL, 2004). O evento fundamental na apoptose é a ativação de enzimas denominadas caspases. O processo de apoptose pode ser dividido em uma fase de ativação, ou seja, onde as caspases tornam-se ativas e uma fase efetora, na qual as enzimas atuam provocando a morte celular (SATOH ET AL, 2000, MITCHELL, 2006, PEREIRA, 2006, GRIVICICH ET AL, 2007 e KUMAR ET AL, 2008). As caspases proteolíticas que medeiam a fase de ativação são altamente conservadas entre as espécies: no termo caspase, o c refere-se a uma enzima que possui uma cisteína em seu local ativo e aspase refere-se à habilidade dessas

enzimas de clivar os resíduos do ácido aspártico (STITES ET AL, 2000, SATOH ET AL, 2000, GRIFFITHS ET AL, 2001, MITCHELL, 2006 e KING, 2007). As caspases são divididas em dois grupos básicos iniciadoras e efetoras dependendo da ordem em que são ativadas durante a apoptose. As caspases iniciadoras incluem a caspase-8 e a caspase-9. Várias caspases, incluindo a caspase-3 e a caspase-6 são efetoras. Depois que uma caspase iniciadora é ativada, o programa de morte enzimática é iniciado pela ativação rápida e seqüencial das outras caspases, desta forma desencadeiam os processos nucleares e citoplasmáticos que levam à morte celular por apoptose. As caspases efetoras atuam em vários componentes celulares; elas clivam proteínas do citoesqueleto e da matriz nuclear, rompendo assim o citoesqueleto e levando à destruição do núcleo. No núcleo, as caspases clivam as proteínas envolvidas na transcrição, replicação e reparação do DNA. Em especial, a caspase-3 ativa uma DNAse citoplasmática que resulta na clivagem internucleossômica característica do DNA (PATEL ET AL, 1996, DE ROBERTIS, 2001, KIVINEN ET AL, 2005, PEREIRA, 2006 e MITCHELL, 2006). O início da apoptose ocorre por sinais de duas vias distintas, porém convergentes: a via extrínseca ou iniciada por receptores, e a via intrínseca, ou mitocondrial (MITCHELL, 2006 e PEREIRA, 2006). Os desencadeadores da apoptose mais bem conhecidos na membrana celular são o ligante do TNF-α (fator de necrose tumoral) a seu receptor (TNFR) e a proteína ligante Faz/CD95 (Fas-L ou CD95-L) a seu receptor (Fas ou receptor Fas), ou seja, via extrínseca. O TNF-α, é com maior freqüência, uma citocina livre,

enquanto a proteína ligante Fas localiza-se na membrana plasmática. Receptores para TNF-α e a proteína ligante Fas tornam-se ativados mediante ligação com seus ligantes. Essas proteínas transmembrana possuem seqüências de aminoácidos em suas caudas citoplasmáticas, denominadas domínios de morte, que operam como pontos de atracamento para os domínios de morte de outras proteínas que participam do processo sinalizador acarretando apoptose. Após se ligar aos receptores, estas últimas proteínas ativam moléculas sinalizadoras na seqüência, especialmente a pró-caspase-8, que é convertida a caspase-8. Por sua vez, a caspase-8 inicia uma cascata de ativação de outras caspases seqüenciais na via da apoptose. Essas caspases (3, 6 e 7) ativam muitas enzimas nucleares, como a PARP (poli-adp-ribosil polimerase) que medeiam a fragmentação nuclear da morte celular apoptótica (YONISH-ROUACH ET AL, 1991, EVAN ET AL, 1992, NAGATA & GOLSTEIN, 1995, RUBIN & STRAYER, 2006 e KUMAR ET AL, 2008). A apoptose também é mediada por proteínas mitocondriais, via intrínseca. A membrana mitocondrial é um regulador essencial do equilíbrio entre morte e sobrevida celular. A escolha entre a sobrevivência e a morte é determinada pela permeabilidade da mitocôndria, controlada por uma família de mais de 20 proteínas, cujo protótipo é a Bcl-2. As proteínas da família de Bcl-2 residem na membrana interna mitocondrial e são pró-apoptóticas ou anti-apoptóticas (pró-sobrevida). Quando há preponderância de homodímeros compostos de proteínas próapoptóticas, desta família, a cascata apoptótica é ativada. Este excesso de constituintes pró-apoptóticos da família bcl-2 promove a abertura dos poros mitocondriais, aumentando a permeabilidade da membrana mitocondrial, permitindo o extravasamento do citocromo C e outras proteínas mitocondriais para o citosol. O

citocromo C, em conjunto com alguns co-fatores, como APAF-1 (Fator Ativador de Protease da Apoptose-1), convertem a pró-caspase-9 em caspase-9. Esta ativa as caspases seqüenciais (3, 6, 7) da mesma forma que a caspase-8. Em muitos tipos celulares, a caspase-8 também pode clivar e ativar um membro pró-apoptótico da família Bcl-2, chamado Bid, portanto no interior da via mitocondrial. A ativação combinada de ambas as vias lança um golpe letal para a célula, logo a via mitocondrial parece ser a via responsável pela maioria das situações de apoptose (HOCKENBERY ET AL, 1990, SHEN ET AL, 1998, RUBIN & STRAYER, 2006 e KUMAR ET AL, 2008). 2.3.1 MARCADOR DE APOPTOSE CASPASE-3 Um método para o estudo da apoptose, se dá através da pesquisa de marcação imuno-histoquímica da proteína caspase-3. A caspase-3 é uma enzima encontrada no citosol e é ativada somente em células acometidas pela apoptose, uma vez ativada, ela é essencial para a desintegração da estrutura nuclear, contribuindo para a fragmentação do DNA da célula, e é neste estágio que ocorre o desenvolvimento das características morfológicas clássicas da apoptose. A ativação da caspase-3 ocorre em resposta a uma variedade de indutores de apoptose (KUMAR, 1995, HADJILOUCAS ET AL, 2001 e KIVINEN ET AL, 2005). A detecção da forma ativa da caspase-3 no citoplasma de células em apoptose pela imunohistoquímica, indica o início do evento, seguido do desenvolvimento das características morfológicas clássicas da apoptose, sendo uma maneira segura e

está fortemente correlacionada com a avaliação morfológica (HADJILOUCAS ET AL, 2001). Devido à ampla expressão da caspase-3 e sua função na regulação da vida e morte dos vários tipos celulares, recentes dados sugerem que a taxa de sua expressão em neoplasias malignas está correlacionada com a progressão da carcinogênese (NAKAGAWARA ET AL, 1997 e VAKKALA ET AL, 1999). Esta molécula desempenha uma importante função no mecanismo de apoptose dos carcinomas mamários, sendo um valioso indicador prognóstico para esses carcinomas (NAKOPOULOU ET AL, 2001). A marcação da caspase-3 pode ser usada no controle da resposta aos tratamentos quimioterápicos quanto a possível resistência da droga, onde a diminuição da expressão pode indicar um mecanismo importante de sobrevivência celular em pacientes com câncer de mama (NERURKAR ET AL, 1989, DE JONG ET AL, 2000, PARTON ET AL, 2002 e O DONOVAN ET AL, 2003). A avaliação da apoptose, é portanto de grande interesse para a avaliação biológica da cinética tumoral e no potencial prognóstico da resposta clínica à um tratamento (MACIOROWSKI ET AL, 2001 e SCHÖNDORF ET AL, 2004). A correlação entre o índice apoptótico e a proliferação celular se mostrou bastante positiva, principalmente em carcinomas mamários, indicando que a apoptose está diretamente relacionada à taxa de proliferação tumoral na tentativa de controlar seu crescimento. Quanto à caspase-3, o alto número de células

apoptóticas está relacionado a um prognóstico desfavorável (PARTON ET AL, 2002). Para a avaliação da progressão tumoral, conseqüentemente, de uma proliferação celular mais precisa é necessário a associação de vários marcadores prognósticos, devido a isso este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade proliferativa e a morte celular programada em neoplasias mamárias caninas, comparando os resultados de ambas as técnicas, em associação também com uma análise comparativa do tipo histológico das neoplasias. A técnica de imunohistoquímica, surge como um complemento para análise histopatológica de rotina, acrescentado mais informações sobre o comportamento tumoral e auxiliando de forma bem expressiva num diagnóstico e prognóstico mais precisos das neoplasias mamárias e conseqüentemente num tratamento clínico mais adequado por parte do médico veterinário, podendo desta forma também continuar sendo utilizado como um modelo experimental nos estudos comparativos à neoplasia mamária humana.

3 HIPÓTESES - Existe correlação entre a imunopositividade do anticorpo anti-pcna e do anticorpo anti-ki-67 (MIB-1) em neoplasias mamárias malignas caninas - Existe correlação entre a imunopositividade do anticorpo anti-pcna e do anticorpo anti-ki-67 (MIB-1) com o anticorpo anti-caspase-3 clivada em neoplasias mamárias malignas caninas

4 OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GERAL - Analisar a atividade proliferativa e apoptótica nas neoplasias mamárias malignas caninas 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Avaliar a expressão dos marcadores anti-pcna (antígeno nuclear de proliferação nuclear) e anti-ki-67 (MIB-1) nas neoplasias mamárias malignas caninas - Avaliar a expressão da caspase-3 clivada nas neoplasias mamárias malignas caninas - Correlacionar a expressão dos anticorpos anti-pcna, anti-ki-67 (MIB-1) e anticaspase-3 clivada nas neoplasias mamárias malignas caninas

5 MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 MATERIAL Para a realização deste trabalho, foram utilizados 61 casos de neoplasias malignas de glândulas mamárias em cadelas, sendo que todos os casos eram de cadelas que foram submetidas à mastectomia radical, no período de agosto de 2003 a maio de 2006. Para cada caso existia uma ficha de pedido para análise anátomopatológica, onde constavam informações importantes, como histórico e a técnica utilizada para a exérese da massa tumoral. Todas as cadeias mamárias recebidas, foram imersas em solução de formol tamponado a 10%. Posteriormente foi realizada a checagem e a coleta de amostras destas cadeias mamárias para serem processados e incluídos em parafina. A partir destes, foram realizados cortes dos blocos de parafina que foram corados pela hematoxilina-eosina, para análise histopatológica.

5.2 PROCEDIMENTOS Os casos selecionados foram de neoplasias mamárias malignas caninas obtidas cirurgicamente, através de mastectomia radical bilateral ou não. Foram coletadas informações como a raça e idade do animal, sendo realizada descrição macroscópica da cadeia mamária e descrição microscópica e diagnóstico conclusivo. Posteriormente, foram separados todos os cortes parafinados corados em hematoxilina-eosina dos casos de neoplasias malignas mamárias caninas. A partir de todos os cortes histológicos analisados, foram selecionados de um a dois cortes histológicos, os que melhor representavam o tipo histológico neoplásico observado, ou seja, o diagnóstico conclusivo e após esta seleção, foram obtidos os blocos referentes a cada caso. Dos blocos selecionados foram confeccionados cortes em lâminas silanizadas para a realização de técnica de imuno-histoquímica. 5.2.1 IMUNO-HISTOQUÍMICA De cada bloco selecionado foram feitos cortes com fragmentos de três a quatro µm de espessura em lâminas pré-tratadas com silano à 4% (ATPS) em acetona, para serem utilizadas pela a técnica de imuno-histoquímica.

Ao se iniciar a técnica de imuno-histoquímca, os cortes sofreram um préaquecimento durante dez minutos em estufa à 60 C, a pós, foi realizada a desparafinização, em xilol durante dez minutos em estufa à 60ºC, seguido de quatro banhos de cinco minutos em xilol a temperatura ambiente. Seguiu-se, então a hidratação dos cortes em dois banhos em álcool absoluto (etanol) por cinco minutos, dois banhos em álcool 90% por cinco minutos e duas lavagens em água destilada também por 5 minutos. O bloqueio da peroxidase endógena era realizado com um banho de 30 minutos numa solução de peróxido de hidrogênio a 3% em água destilada. A recuperação antigênica dos cortes era realizada em banho Maria, durante 45 minutos, imersos na solução target retrieval de ph 6.0 (Dako-Cytomation, código S1699) a 10% em água destilada, sendo esta solução previamente aquecida durante 30 minutos. Posteriormente os fragmentos eram esfriados durante, aproximadamente, 40 minutos. Esta etapa só era realizada para os fragmentos que foram incubados com os anticorpos primários anti-ki-67 e anti-caspase-3 clivada, ou seja, para o anticorpo primário anti-pcna a recuperação antigênica não era realizada. Após a recuperação antigênica, as lâminas eram lavadas em tampão TBS, com ph entre 7.2 e 7.4. Em seguida, ocorria a inibição das ligações inespecíficas, onde os cortes foram incubados em câmara úmida com uma solução composta de BSA (soro

albumina bovina), TBS com cloreto de sódio e leite em pó desnatado (POLAK E VAN NOORDEN, 1997), por um período de 15 minutos em temperatura ambiente. Depois o excesso desta solução era retirado e incubava-se os cortes com o anticorpo primário durante 18 hs à 4ºC em câmara úmida, com diluição de 1/30 para anticorpo anti-ki-67 (Dako-Cytomation, Clone MIB-1, código M7240), 1/300 para anticorpo anti-pcna (Dako-Cytomation, Clone PC10 código M0879) e 1/400 para anti-caspase-3 clivada (Cell Signaling Technology, ASP175). Passado este tempo, os cortes eram lavados em tampão TBS e incubados com as soluções contidas no Kit LSAB + System HRP (Dako-Cytomation, código K0690), ou seja, durante 30 minutos com a solução Biotinylated link universal e posteriormente por mais 30 minutos com a solução streptavidin-hrp. Entre estas etapas, eram realizadas três lavagens em tampão TBS por 5 minutos. Após esse tempo, os cortes sofriam novas lavagens em TBS e eram revelados com o substrato cromogênico DAB (diaminobenzidina) (Dako-Cytomation), por cerca de quatro minutos para cada corte, esta revelação foi acompanhada através da microscopia ótica, mostrando uma reação de coloração marrom, nos locais onde existia positividade. Em seguida as lâminas sofriam lavagens em água destilada e eram contracoradas com hematoxilina de Harris, sendo azulados em uma solução de água destilada e amônia.

Posteriormente, foi realizada a desidratação dos cortes em dois banhos de um minuto em álcool a 90% e dois banhos de um minuto em álcool absoluto. Seguida da diafanização que era realizada através de quatro banhos de dois minutos em xilol. Logo após, montavam-se as lâminas em entelan e lamínula. Como controle positivo foram utilizados cortes histológicos de tecido mamário e linfonodos humanos e para a realização do controle negativo era excluída a etapa de utilização do anticorpo primário. 5.3 ANÁLISE DO MATERIAL 5.3.1 ANÁLISES HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA A análise histopatológica das amostras de neoplasias mamárias malignas caninas foi realizada por dois observadores, através da leitura de cortes corados pela coloração de rotina hematoxilina-eosina. A classificação e o diagnóstico histopatológico das neoplasias mamárias foram realizados de acordo com a classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS), desenvolvida para tumores mamários caninos (MISDORP ET AL, 1999). A análise histomorfométrica foi realizada por um único observador, através da contagem de células de origem epitelial e mesenquimal que se mostraram imunopositivas para cada anticorpo utilizado, dentre as células observadas incluiu-se as células dos ductos das glândulas mamárias, células mioepiteliais, células

endoteliais e tecido conjuntivo. Antes de se iniciar a contagem, as lâminas eram observadas e toda a área tumoral era circundada usando-se caneta para retroprojetor, no intuito de delinear toda a neoplasia, ou seja, fazendo com que desta forma somente as células da área neoplásica fossem analisadas e contadas. A contagem destas células imunomarcadas, foi feita utilizando-se um microscópio ótico da marca Olympus Optical Company Modelo BX41TF / U-MDOB3, onde foram contados 10 campos com a objetiva de 40x, sendo utilizado para esta contagem o método denominado Barra Grega, para obtenção de uma área contada mais uniforme e fidedigna de todo tumor. Após a contagem, das células imunomarcadas, dos 10 campos era obtida a média de células imunopositivas, por campo, somando-se os valores encontrados em cada campo divididos por 10 (GONZÁLEZ-CÁMPORA ET AL, 2000 e PEREIRA ET AL, 2003). 5.3.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA A análise foi realizada com base nos valores médios dos 10 campos das amostras. Para as análises estatísticas foram utilizadas ferramentas de estatística descritiva. Para as variáveis quantitativas foram usados o teste de Kruskal-Wallis na comparação de 2 ou mais amostras independentes. Foi realizada uma análise de correlação entre as variáveis quantitativas, com teste de significância para as mesmas. Foi adotado nas análises um nível de significância de 5%. O teste quiquadrado foi utilizado na análise, na comparação de grupos quanto a variáveis qualitativas (VIEIRA, 2003).

6 RESULTADOS De acordo com os 61 casos de neoplasias mamárias malignas caninas selecionados (Anexo 1), as massas tumorais apresentaram tamanhos variando de milímetros a 10,0 x 7,8 x 6,0 cm. Com relação a idade dos animais, 4,9% tinham menos de 5 anos de idade, 65,6% tinham entre 5 e 10 anos de idade e 29,5% acima de 10 anos de idade (Tab.1). O maior número de cadelas acometidas foram da raça Poodle (23,0%), sem raça definida (SRD) (16,4%) e da raça Cocker Spaniel (11,5%) (Tab.2). TABELA 1: FAIXA ETÁRIA DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS Freqüência Porcentagem Idade (anos) < 5 3 4,9 [5,10] 40 65,6 > 10 18 29,5 Total 61 100,0

TABELA 2: FREQÜÊNCIA DAS RAÇAS DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS Freqüência Porcentagem Raça poodle 14 23,0 SRD 10 16,4 cocker spaniel 7 11,5 yorkshire 5 8,2 pastor alemão 4 6,6 maltês 3 4,9 basset dachshund 3 4,9 bichon frise 3 4,9 fox paulistinha 2 3,3 rottweiler 2 3,3 pinsher 2 3,3 beagle 2 3,3 labrador 1 1,6 collie 1 1,6 pit bull 1 1,6 husky siberiano 1 1,6 Total 61 100,0 6.1 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA As neoplasias foram classificadas de acordo com a classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) (MISDORP ET AL, 1999), desenvolvida para tumores mamários caninos e posteriormente foram descritas as características conforme os achados histopatológicos. Das 61 (100%) amostras analisadas através da histopatologia, foram observados cinco (8,20%) carcinossarcomas; nove (14,75%) carcinomas em tumores mistos; seis (9,84%) adenocarcinomas tubulares complexos; doze (19,70%) adenocarcinomas tubulares simples; treze (21,31%) adenocarcinomas papilíferos ou

papilares complexos; 15 (24,60%) adenocarcinomas papilíferos ou papilares simples e um (1,63%) carcinoma sólido simples (Tab.3). TABELA 3: FREQÜÊNCIA DOS DIAGNÓSTICOS HISTOPATOLÓGICOS DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS Freqüência Porcentagem Diagnóstico Histopatológico papilífero simples 15 24,6 papilífero complexo 13 21,3 tubular simples 12 19,7 carcinoma em tumor misto 9 14,8 tubular complexo 6 9,8 carcinossarcoma 5 8,2 sólido simples 1 1,6 Total 61 100,0 Não houve nenhuma associação entre a faixa etária dos animais estudados quanto ao diagnóstico histopatológico das neoplasias mamárias malignas analisadas (p=0,522) (Tab.4). TABELA 4: FREQÜÊNCIA DOS DIAGNÓSTICOS HISTOPATOLÓGICOS E A FAIXA ETÁRIA DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS Faixa Etária (anos) papilífero complexo papilífero simples Diagnóstico Histopatológico (HE) tubular complexo tubular simples Carcinoma em tumor misto carcinossarcoma sólido simples < 5 2 1 - - - - - 3 [5,10] 5 11 5 8 8 2 1 40 > 10 6 3 1 4 1 3-18 Total 13 15 6 12 9 5 1 61 Total

Das 61 amostras de neoplasias mamárias malignas caninas analisadas, cinco (8,2%) foram classificadas como carcinossarcoma (Fig.1). Nestes casos, foi observado tecido glandular mamário apresentando pequenas áreas com formações tubulares de células epiteliais neoplásicas cuboidais a colunares, ora com camada dupla, ora com várias camadas de células, pleomorfismo celular e nuclear variando de discreto a acentuado, hipercromatismo nuclear, nucléolos evidentes, algumas células apresentando mais de um nucléolo, às vezes com aparência esmerilhada e em anel de sinete, presença de figuras de mitoses e algumas células com citoplasma vacuolado. Havia também projeções papiliformes de células neoplásicas de revestimento do ducto. Nestas amostras foram observadas também formações nodulares compostas por material mixóide e/ou por tecido cartilaginoso e/ou por ósseo com características histológicas indicativas de malignidade, que caracterizavam componentes condrossarcomatoso e osteossarcomatoso e às vezes estes predominavam em relação ao componente glandular. Algumas amostras apresentavam proliferação de células mioepiteliais. Várias glândulas apresentavam dilatações císticas, secreção acidófila na sua luz e células descamativas no interior. Em alguns casos se observou extensa área de ulceração com processo inflamatório misto associado, congestão, hemorragia, pigmento de hemossiderina, necrose e focos de mineralização. Em nove (14,8%) casos analisados, foi observado o mesmo padrão histológico anteriormente citado, indicando a malignidade dos componentes epiteliais, mas não houve a observação das características malignas dos componentes mesenquimais, ou seja, tecido cartilaginoso e ósseo, logo essas amostras foram classificadas como carcinomas em tumores mistos (Fig.2).

Seis (9,8%) casos, dos 61 estudados, foram definidos como adenocarcinomas tubulares complexos (Fig.3). As amostras destas neoplasias mostraram formações tubulares com revestimento de células epiteliais neoplásicas, em dupla ou mais camadas; este aspecto tubular neoplásico também foi evidenciado na forma de estruturas nodulares circunscritas, mostrando pleomorfismo celular discreto a moderado, núcleos hipercromáticos, nucléolos evidentes, aumentados, células com mais de um nucléolo e a presença de figuras mitóticas. Foram evidenciados também vários ductos dilatados com células descamativas no interior e formações císticas, com material acidófilo na luz. Havia proliferação de células mioepiteliais ao redor dos ductos, ora desorganizadas, ora formando redemoinhos e em determinadas amostras áreas com desmoplasia. Outros aspectos observados foram neovascularização, congestão, hemorragia, pigmento de hemossiderina e em alguns casos áreas de necrose, às vezes com focos de mineralização e presença de infiltrado inflamatório com linfócitos e plasmócitos. Algumas amostras mostraram uma arquitetura e características muito semelhantes ao do adenocarcinoma tubular complexo, por apresentarem células organizadas em formações tubulares, estando em algumas áreas na forma de nódulos circunscritos, com pseudocápsula e no interior proliferação de células epiteliais de revestimento com transformações neoplásicas, com organização tubular, somente não sendo evidenciada a proliferação das células mioepiteliais, desta maneira doze (19,7%) casos foram classificados como adenocarcinomas tubulares simples (Fig.4).

Dos 61 casos estudados, treze (21,3%) foram classificados como adenocarcinomas papilíferos ou papilares complexos (Fig.5), onde foram evidenciadas várias formações tubulares, às vezes organizadas em nódulos, com proliferação de células epiteliais de revestimento neoplásicas de múltiplas camadas, com projeções papiliformes projetadas para o interior do lúmen dos ácinos das glândulas mamárias, demonstrando hipercromatismo nuclear, pleomorfismo celular moderado, núcleos com nucléolo evidente, núcleos com mais de um nucléolo, células com núcleos esmerilhados e figuras mitóticas. Foram observados também alguns ácinos com formações císticas, apresentando na sua luz secreção acidófila e células descamativas. Outros aspectos observados foram áreas ou focos de proliferação de células mioepiteliais. Congestão, hemorragia, pigmento de hemossiderina e necrose também foram evidenciados e em determinadas amostras presença de infiltrado inflamatório linfoplasmocitário. Da mesma maneira em quinze (24,6%) amostras, semelhante padrão arquitetônico foi evidenciado, várias formações nodulares, circunscritas, bem delimitadas e presença de projeções papiliformes para o interior dos ductos, com epitélio glandular composto por células neoplásicas cuboidais a colunares, com hipercromatismo nuclear, nucléolos evidentes, algumas células apresentando mais de um nucléolo, pleomorfismo discreto a acentuado, mas a proliferação das células mioepiteliais não foi observada, sendo estas amostras classificadas como adenocarcinomas papilíferos ou papilares simples (Fig.6). Em um (1,60%) caso foi observado formações nodulares separadas por septos de tecido conjuntivo e células epiteliais de revestimento tubular arranjadas

em cordões sólidos, algumas com formato ovóide, com ausência de formação tubular e ausência de lúmen. As células apresentavam pleomorfismo moderado, nucléolos evidentes, células com mais de um nucléolo, núcleos hipercromáticos, citoplasma vacuolado e presença de mitoses. Assim sendo, essa neoplasia foi classificada como carcinoma sólido simples de glândula mamária (Fig.7). A avaliação das margens de segurança das amostras das neoplasias mamárias malignas demonstrou que 49,2% das margens estavam livres; 26,2% estavam livres, porém próximas à massa neoplásica; 16,4% tinham as margens de segurança comprometidas; 4,9% tinham as margens de segurança comprometidas com metástase em linfonodos e 3,3% tinham as margens de segurança livres com metástase em linfonodos (Tab.5). TABELA 5: FREQÜÊNCIA DAS MARGENS DE SEGURANÇA NAS AMOSTRAS DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS Freqüência Porcentagem Margens de segurança livre 30 49,2 livre, mas próxima 16 26,2 comprometida 10 16,4 comprometida com 3 4,9 metástase linfonodo livre com metástase 2 3,3 linfonodo Total 61 100,0

6.2 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA 6.2.1 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO COM O ANTICORPO ANTI- PCNA (ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR) O anticorpo anti-pcna se mostrou positivo, a marcação dos núcleos das células apresentou certas variações em relação à intensidade, ou seja, em determinadas amostras houve uma marcação intensa e em outros fragmentos, de maneira mais fraca, inclusive, esta variação também pôde ser observada num mesmo campo analisado. Em alguns casos, células em fase M do ciclo celular, apresentaram uma marcação citoplasmática (Fig.8). A imunoreatividade do anticorpo anti-pcna foi mais evidente nos núcleos das células epiteliais dos ductos das glândulas mamárias, do que nas células do tecido conjuntivo e nas células mioepiteliais, encontradas logo abaixo do epitélio ductal glandular (Figs.9 e 10). Da mesma maneira, observou-se uma maior marcação dos núcleos das células nas áreas com menor grau de diferenciação do que em áreas mais bem diferenciadas. Com relação as células endoteliais e inflamatórias, a quantidade de células marcadas foi muito pequena. Com relação ao tipo histológico das neoplasias, foi observado uma maior marcação nos adenocarcinomas tubulares complexos (média=31,53), seguido pelos adenocarcinomas papilíferos simples (média=29,63); carcinossarcomas (média=23,88); adenocarcinomas tubulares simples (média=23,71); carcinomas em

tumores mistos (média=19,50) e adenocarcinomas papilíferos complexos (média=15,55) (Tab.6). No carcinoma sólido a marcação se mostrou maior em toda área tumoral (média=238,9) (Fig.11). Da mesma maneira, em alguns casos de adenocarcinomas papilíferos ou tubulares, havia áreas sólidas que apresentavam este mesmo padrão de imunopositividade. No caso dos carcinossarcomas e carcinomas em tumores mistos, estes apresentaram imunopositividade nas células ductais, mas nas áreas mesenquimais, como as áreas mixóides, de formação cartilaginosa e de tecido ósseo mineralizado, não foi observada nenhuma reatividade com o anticorpo anti-pcna. A área mesenquimal, onde pôde ser observada marcação, era aquela mais próxima dos ductos glandulares e de tecido conjuntivo intersticial (Figs.12, 13 e 14). De acordo com a análise estatística, as medianas dos valores de núcleos imunopositivos de células epiteliais, pelo anticorpo anti-pcna nas amostras estudadas das neoplasias mamárias malignas caninas, tiveram valores próximos. A variabilidade das marcações foi menor nos adenocarcinomas papilíferos complexos, tubulares complexos, carcinomas em tumores mistos e carcinossarcomas. Valores discrepantes foram encontrados nos adenocarcinomas papilíferos complexos, tubulares complexos e carcinossarcomas. Os adenocarcinomas papilíferos simples e tubulares simples apresentaram uma maior variabilidade de marcação. Com o diagnóstico de apenas um caso de carcinoma sólido simples, não foi possível uma avaliação estatística detalhada, no entanto foi observado que esta neoplasia é

facilmente identificável, devido ao alto valor observado em sua marcação (Tab. 6 e Graf.1). TABELA 6: VALORES DA MÉDIA E MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS DOS DUCTOS, IMUNOPOSITIVAMENTE MARCADOS PELO ANTICORPO ANTI- PCNA, DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO Diagnóstico Histopatológico Nº de casos Média±DP Mediana ADENOCARCINOMA PAPILAR 13 15,55±19,18 9,7 COMPLEXO ADENOCARCINOMA TUBULAR 6 31,53±32,98 20,45 COMPLEXO ADENOCARCINOMA PAPILAR 15 29,63±25,56 17,8 SIMPLES ADENOCARCINOMA TUBULAR 12 23,71±24,66 7,38 SIMPLES CARCINOMA EM TUMOR MISTO 9 19,50±13,03 18,9 CARCINOSSARCOMA 5 23,88±36,15 7,7 CARCINOMA SÓLIDO SIMPLES 1 238,9 206,0 LEGENDA: DP (Desvio Padrão)

GRÁFICO 1: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS, DAS CÉLULAS EPITELIAIS, MARCADOS IMUNOPOSITIVAMENTE PELO ANTICORPO ANTI-PCNA POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO Não houve diferença significativa entre o diagnóstico dos tipos histopatológicos das neoplasias mamárias malignas caninas quanto à imunomarcação com o anticorpo anti-pcna dos núcleos das células epiteliais imunopositivos, ao nível de significância de 5% (p=0,473). O caso de neoplasia mamária canina com o maior número de núcleos positivos de células epiteliais foi o carcinoma sólido (caso nº9) e um adenocarcinoma tubular complexo (caso nº53) e o caso que apresentou a menor marcação foi um adenocarcinoma papilar complexo (caso nº1). Na avaliação estatística dos núcleos marcados, de células epiteliais, imunopositivamente com o anticorpo anti-pcna, dos casos estudados de neoplasias

mamárias, com relação as margens de segurança, os valores das medianas dos três primeiros grupos (que tinham pelo menos cinco animais) ficaram próximos (Tab.7 e Graf.2). Não foi encontrada diferença significativa, entre esses três grupos, das margens de segurança quanto à imunomarcação do anticorpo anti-pcna (p=0,468) nos casos estudados de neoplasias mamárias. TABELA 7: VALORES DA MÉDIA E DA MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS IMUNOMARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-PCNA, DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA Nº de casos Média±DP Mediana Margens de Segurança livre 30 17,83±17,94 11,67 livre, mas 16 23,00±21,69 15,92 próxima comprometida 10 48,63±72,87 21,52 comprometida 3 40,60±41,62 26,70 com metástase linfonodo livre com metástase linfonodo 2 71,47±12,33 71,47 LEGENDA: DP (Desvio Padrão)

GRÁFICO 2: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS COM O ANTICORPO ANTI-PCNA DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA 6.2.2 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO COM O ANTICORPO ANTI- Ki-67 O anticorpo anti-ki-67 mostrou imunoreatividade em todas as amostras de neoplasias mamárias malignas caninas, com a marcação dos núcleos das células na fase M do ciclo celular e às vezes mostrando somente a marcação de nucléolos e/ou marcação perinuclear, de maneira semelhante ao observado no controle positivo utilizado (Fig.8). Foi observado também alguma variação na intensidade de marcação das células entre amostras e na mesma amostra.

Assim como na imunoreatividade com o anticorpo anti-pcna, a positividade com o anticorpo anti-ki-67, foi mais observada nas células epiteliais dos ductos glandulares mamários, do que nas células de origem mesenquimal (Fig.9 e 10). A marcação das células em proliferação celular foi mais evidente nos adenocarcinomas tubulares complexos (média=27,18), seguidos pelos adenocarcinomas papilíferos simples (média=25,21); adenocarcinomas tubulares simples (média=18,8); carcinossarcomas (média=17,25); carcinomas em tumores mistos (média=11,67) e adenocarcinomas papilíferos complexos (média=10,84) (Tab.8). No caso do carcinoma sólido, uma grande quantidade de células epiteliais positivas foram observadas em toda área neoplásica (média=224,5), inclusive com a marcação de células em anel de sinete. O mesmo foi visualizado nas áreas sólidas encontradas em alguns casos de adenocarcinomas (Fig.11). Em relação aos carcinossarcomas e carcinomas em tumores mistos, a imunopositividade com o anticorpo anti-ki-67, foi mais evidente na área dos ductos glandulares do que nas áreas mixóides, de tecido cartilaginoso e tecido mineralizado, nestas áreas a marcação foi nula. A maioria das células fusiformes que apresentaram positividade foram àquelas mais próximas aos ductos glandulares (Fig.12, 13 e 14). De acordo com a análise estatística, as medianas dos valores de núcleos imunopositivos, de células epiteliais, pelo anticorpo anti-ki-67 das amostras

estudadas de neoplasias mamárias caninas tiveram valores próximos. A variabilidade das marcações foi menor do que com o anticorpo anti-pcna, mas esta variabilidade se manteve menor nos adenocarcinomas papilíferos complexos, tubulares complexos, carcinomas em tumores mistos e carcinossarcomas. Valores discrepantes também foram encontrados nos adenocarcinomas papilíferos complexos, tubulares complexos e carcinossarcomas. Os adenocarcinomas papilíferos simples e tubulares simples apresentaram uma maior variabilidade de marcação, assim como o observado com o anti-pcna. Da mesma forma, devido ao diagnóstico de apenas um caso de carcinoma sólido simples, não foi possível uma avaliação estatística detalhada, no entanto foi observado que esta neoplasia é facilmente identificável pelo elevado valor observado (Tab.8 e Graf.3). TABELA 8: VALORES DA MÉDIA E MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS DOS DUCTOS, IMUNOPOSITIVAMENTE MARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-Ki- 67, POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO Diagnóstico Histopatológico Nº de casos Média±DP Mediana ADENOCARCINOMA PAPILAR 13 10,84±7,89 8,2 COMPLEXO ADENOCARCINOMA TUBULAR 6 27,18±29,24 17,8 COMPLEXO ADENOCARCINOMA PAPILAR 15 25,21±22,76 13,6 SIMPLES ADENOCARCINOMA TUBULAR 12 18,8±16,23 13,95 SIMPLES CARCINOMA EM TUMOR MISTO 9 11,67±9,48 9,8 CARCINOSSARCOMA 5 17,25±20,84 7,65 CARCINOMA SÓLIDO SIMPLES 1 224,5 202,0 LEGENDA: DP (Desvio Padrão)

GRÁFICO 3: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS IMUNOPOSITIVAMENTE PELO ANTICORPO ANTI-KI-67 POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO Não foi observada diferença significativa em relação ao diagnóstico dos tipos histopatológicos das neoplasias mamárias caninas e a imunomarcação com o anticorpo anti-ki-67 dos núcleos das células epiteliais imunopositivas, ao nível de significância de 5% (p=0,594). O caso de neoplasia mamária canina com o maior número de núcleos positivos de células epiteliais foi o carcinoma sólido (caso nº9) e um adenocarcinoma papilífero simples (caso nº16) e o caso que apresentou a menor marcação foi um carcinossarcoma (caso nº36). Na avaliação estatística dos núcleos marcados, de células epiteliais, imunopositivamente com o anticorpo anti-ki-67, dos casos estudados de neoplasias

mamárias, com relação as margens de segurança, não houve variabilidade entre eles, e os valores das medianas para os três primeiros grupos ficaram próximos (Tab.9 e Graf.4). Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos das margens de segurança quanto a imunomarcação do anticorpo anti-ki-67 (p=0,232) nos casos estudados de neoplasias mamárias. TABELA 9: VALORES DA MÉDIA E DA MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS IMUNOMARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-KI-67, DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA Margens de Segurança LEGENDA: DP (Desvio Padrão) Nº de casos Média±DP Mediana livre 30 12,88±11,01 8,85 livre, mas 16 19,33±17,30 12,40 próxima comprometida 10 45,17±68,34 10,62 comprometida 3 27,48±23,27 2,17 com metástase linfonodo livre com metástase linfonodo 2 43,05±41,64 43,05

GRÁFICO 4: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS COM O ANTICORPO ANTI-KI-67 DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA 6.2.3 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO COM O ANTICORPO ANTI- CASPASE-3 CLIVADA Com relação ao anticorpo anti-caspase-3 clivada, este mostrou-se positivo com uma marcação citoplasmática nas células dos ductos glandulares, evidenciando as características morfológicas da apoptose e/ou células que estão apresentando a caspase-3 clivada. A imunoreatividade com a caspase-3 clivada, foi bem menor nas áreas observadas, quando comparada com os anticorpos anti-pcna e anti-ki-67.

A marcação citoplasmática na maioria das vezes se mostrou de maneira bem intensa, dando ao citoplasma um aspecto granular, já em alguns casos houve variação na intensidade da marcação. Em algumas células em alguns casos também pôde ser observada uma marcação nuclear. A positividade do anticorpo anti-caspase-3 clivada foi mais evidente nas células dos ductos das glândulas mamárias, do que nas células do tecido conjuntivo e nas células mioepiteliais, encontradas logo abaixo do epitélio ductal glandular. Da mesma maneira, observou-se uma maior marcação nas células das áreas com maior grau de diferenciação do que em áreas menos diferenciadas (Fig.8, 9 e 10). A positividade do anticorpo anti-caspase-3 clivada foi mais observada nos adenocarcinomas tubulares complexos e carcinossarcomas (média=5,46 cada um), seguidos pelos adenocarcinomas papilíferos complexos (média=5,08); adenocarcinomas tubulares simples (média=4,87); carcinomas em tumores mistos (média=4,73) e adenocarcinomas papilíferos simples (média=3,16) (Tab.10). Com relação aos casos de carcinomas sólidos a marcação positiva com a caspase-3 clivada foi muito pequena. O mesmo ocorreu em áreas sólidas, encontradas em alguns casos de adenocarcinomas (Fig.11). Em relação aos carcinossarcomas e carcinomas em tumores mistos, a imunopositividade com o anticorpo anti-caspase-3 clivada, foi mais evidente nas células dos ductos glandulares do que nas células das áreas mixóides, de tecido

cartilaginoso e tecido mineralizado, nestas áreas a marcação foi nula (Fig.12, 13 e 14). De acordo com a análise estatística, as medianas dos valores de células epitelais imunopositivas pelo anticorpo anti-caspase-3 clivada, nas amostras estudadas das neoplasias mamárias caninas, tiveram valores próximos. Em todos os casos, foi observado uma variabilidade menor e um menor número de células imunopositivas, quando comparado aos valores das imunomarcações com os anticorpos anti-pcna e anti-ki-67. Da mesma forma, devido ao diagnóstico de apenas um caso de carcinoma sólido simples, não foi possível uma avaliação estatística detalhada, no entanto foi observado que esta neoplasia é facilmente identificável pelo baixo valor observado (Tab.10 e Graf.5). TABELA 10: VALORES DA MÉDIA E MEDIANA DO NÚMERO DE CÉLULAS EPITELIAIS DOS DUCTOS, IMUNOPOSITIVAMENTE MARCADAS PELO ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA, POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO Diagnóstico Histopatológico Nº de casos Média±DP Mediana ADENOCARCINOMA PAPILAR 13 5,08±3,27 3,9 COMPLEXO ADENOCARCINOMA TUBULAR 6 5,46±5,83 3,97 COMPLEXO ADENOCARCINOMA PAPILAR 15 3,16±2,22 3,55 SIMPLES ADENOCARCINOMA TUBULAR 12 4,87±4,36 3,63 SIMPLES CARCINOMA EM TUMOR MISTO 9 4,73±2,73 3,55 CARCINOSSARCOMA 5 5,46±6,02 1,3 CARCINOMA SÓLIDO SIMPLES 1 0,3 1,0 LEGENDA: DP (Desvio Padrão)

GRÁFICO 5: BOXPLOT DA MÉDIA DAS CÉLULAS EPITELIAIS MARCADAS IMUNOPOSITIVAMENTE PELO ANTICORPO ANTI- CASPASE-3 CLIVADA POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO Não houve diferença significativa entre o diagnóstico dos tipos histopatológicos, das neoplasias mamárias caninas, quanto a imunomarcação com o anticorpo anti-caspase-3 clivada das células epiteliais, ao nível de significância de 5% (p=0,844). O caso de neoplasia mamária canina com o maior número de células epiteliais positivas foi um adenocarcinoma tubular complexo (caso nº23) e os casos que apresentaram uma menor marcação foram o carcinoma sólido (caso nº9) e um adenocarcinoma tubular simples (caso nº48). Na avaliação estatística das células epiteliais marcadas imunopositivamente pelo anticorpo anti-caspase-3 clivada, dos casos estudados de neoplasias mamárias, com relação as margens de segurança, os valores das medianas foram

próximos (Tab. 11 e Graf.6). Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos das margens de segurança quanto a imunomarcação do anticorpo anticaspase-3 clivada (p=0,934).nos casos estudados de neoplasias mamárias malignas. TABELA 11: VALORES DA MÉDIA E DA MEDIANA DO NÚMERO DE CÉLULAS EPITELIAIS IMUNOMARCADAS PELO ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA, DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA Nº de casos Média±DP Mediana Margens de Segurança livre 30 4,47±3,58 3,50 livre, mas 16 3,98±2,90 3,47 próxima comprometida 10 4,08±3,64 3,53 comprometida 3 9,97±7,76 12,30 com metástase linfonodo livre com metástase linfonodo 2 3,00±1,98 3,00 LEGENDA: DP (Desvio Padrão)

GRÁFICO 6: BOXPLOT DA MÉDIA DAS CÉLULAS EPITELIAIS MARCADAS COM O ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA 6.2.4 CORRELAÇÃO DAS IMUNOMARCAÇÕES COM OS ANTICORPOS ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA De uma maneira geral, em todos os casos de neoplasias mamárias malignas caninas estudados, nas células epiteliais, existiu uma correlação positiva entre a imunomarcação com o anticorpo anti-pcna e o anticorpo anti-ki-67, que foi significativa (r=0,923; p<0,001) (Graf.7), ou seja, quando houve um elevado número de núcleos imunopositivos para PCNA, também houve um elevado número de núcleos imunopositivos para Ki-67. Entre a imunomarcação com o anticorpo anti-

PCNA e anti-ki-67, quando comparado à imunomarcação com o anticorpo anticaspase-3 clivada, houve uma tendência de correlação negativa, isto é, quando foram observados muitos núcleos imunomarcados pelo PCNA e Ki-67, poucas células foram observadas imunomarcadas pela Caspase-3 clivada, porém não foi considerado significativo a nível de significância de 5% (PCNA: r= -0,219, p=0,09; Ki- 67: r= -0,255; p=0,047) (Graf.8 e 9). GRÁFICO 7: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-KI-67 X ANTI-PCNA DAS CÉLULAS EPITELIAIS DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS

GRÁFICO 8: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-PCNA X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA DAS CÉLULAS EPITELIAIS DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS GRÁFICO 9: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-KI-67 X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA DAS CÉLULAS EPITELIAIS DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS

A análise estatística da correlação das imunomarcações dos três anticorpos nas células epiteliais das neoplasias mamárias malignas caninas, só foi realizada nos casos de adenocarcinomas papilíferos complexos, papilíferos simples e tubulares simples, pois os outros tipos histopatológicos, ou seja, os adenocarcinomas tubulares complexos, carcinomas em tumores mistos, carcinossarcomas e carcinoma sólido, tinham um número de amostras insuficientes para a realização desta análise. A significância da associação das imunomarcações das células epiteliais pelos anticorpos anti-ki-67 e anti-pcna, nos adenocarcinomas papilíferos complexos (PC), papilíferos simples (PS) e tubulares simples (TS) foi mantida, ou seja, existiu uma correlação positiva entre a imunomarcação com o anticorpo anti- PCNA e o anticorpo anti-ki-67, que foi significativa, isto é, quando era observado uma grande imunomarcação dos núcleos pelo PCNA, o mesmo ocorria com o Ki-67 (PC: r=0,798, p=0,001; PS: r=0,707, p=0,003; TS: r=0,850, p<0,001). Nos adenocarcinomas papilíferos complexos (PC) e papilíferos simples (PS), a relação entre as imunomarcações das células epiteliais pelos anticorpos anti- PCNA e anti-ki-67, quando comparados com a imunomarcação das células epiteliais pelo anticorpo anti-caspase-3 clivada, pareceu ser decrescente, ou seja, quanto maior era quantidade de núcleos imunopositivos pelos marcadores PCNA e Ki-67, menor era a quantidade de células imunopositivas pela Caspase-3 clivada, mas no entanto, não gerou uma correlação significativa (PC: PCNA: r= -0,096, p=0,755; Ki- 67: r= -0,131, p=0,669 / PS: PCNA: r= -0,361, p=0,186; Ki-67: r= -0,410, p=0,129).

No caso dos adenocarcinomas tubulares simples, houve uma correlação linear negativa significativa entre a imunomarcação das células epiteliais pelo anticorpo anti-ki-67, quando comparado com o anticorpo anti-caspase-3 clivada, isto é, quanto maior a quantidade de núcleos imunomarcados pelo Ki-67, havia uma menor quantidade de células imunomarcadas com a Caspase-3 clivada (r= -0,620, p=0,031) e quando da comparação da imunomarcação do anticorpo anti-pcna e com o anti-caspase-3 clivada houve também uma tendência de correlação negativa significativa (r= -0,584, p=0,046) (Graf.10 e 11). GRÁFICO 10: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-Ki-67 X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA NAS ÁREAS EPITELIAIS DOS ADENOCARCINOMAS TUBULARES SIMPLES

GRÁFICO 11: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-PCNA X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA NAS ÁREAS EPITELIAIS DOS ADENOCARCINOMAS TUBULARES SIMPLES

A E C D Figura 1: Cadela. Glândula Mamária. Carcinossarcoma. Fotomicrografia A. Tecido glandular com formações tubulares e papilíferas dos ductos glandulares com células epiteliais neoplásicas e presença de área mixóide. B. Pleomorfismo celular e nuclear, núcleos esmerilhados e núcleolos evidentes. C. Formação de matriz óssea. D. Formação de matriz cartilaginosa com características histológicas indicativas de malignidade.(he,barra=100µ)

A B C D Figura 2: Cadela. Glândula Mamária. Carcinoma em Tumor Misto. Fotomicrografia A. Tecido glandular com formações tubulares dos ductos glandulares com células epiteliais neoplásicas e presença de área mixóide. B. Pleomorfismo celular e nuclear, e núcleolos evidentes e aumentados. C. Formação de matriz cartilaginosa. D. Formação de matriz mineralizada.(he,barra=100µ)

A B Figura 3: Cadela. Glândula Mamária. Adenocarcinoma Tubular Complexo. Fotomicrografia A e B. Padrão tubular das células epiteliais neoplásicas dos ductos glandulares com proliferação de células mioepiteliais. C. Pleomorfismo nuclear, núcleos hipercromáticos, nucléolos evidentes, aumentados, núcleos esmerilhados, presença de núcleos com mais de um nucléolo e mitoses. (HE,Barra=100µ) C

A B Figura 4: Cadela. Glândula Mamária. Adenocarcinoma Tubular Simples. Fotomicrografia A e B. Padrão tubular das células epiteliais neoplásicas dos ductos glandulares. C. Pleomorfismo nuclear, núcleos hipercromáticos, nucléolos evidentes, aumentados, núcleos esmerilhados e mitoses. (HE,Barra=100µ) C

A B C D Figura 5: Cadela. Glândula Mamária. Adenocarcinoma Papilífero Complexo. Fotomicrografia A e B. Formações tubulares com projeções papiliformes para o interior do lúmen dos ductos glandulares e proliferação de células mioepiteliais. C. Padrão papilífero. D. Pleomorfismo nuclear, núcleos hipercromáticos, nucléolos evidentes, núcleos com mais de um nucléolo, células com núcleos esmerilhados e figuras mitóticas.(he,barra=100µ)

A B Figura 6: Cadela. Glândula Mamária. Adenocarcinoma Papilífero Simples. Fotomicrografia A e B. Presença de projeções papiliformes para o interior dos ácinos glandulares. C. Pleomorfismo celular e nuclear, núcleos hipercromáticos, núcleos esmerilhados, nucléolos evidentes, células com mais de um nucléolo e mitoses. (HE,Barra=100µ) C

A B C Figura 7: Cadela. Glândula Mamária. Carcinoma Sólido Simples. Fotomicrografia A e B. Formações nodulares separadas por septos de tecido conjuntivo e arranjo das células em cordões sólidos. C. Pleomorfismo nuclear, núcleos hipercromáticos, nucléolos evidentes e mitoses. (HE,Barra=100µ)

A B C D E F Figura 8: Cadela. Glândula Mamária. Adenocarcinoma Papilífero Simples. Fotomicrografia A. Projeções papilíferas para o interior dos ductos glandulares, coloração de hematoxilina-eosina. B e C. Imunoreatividade das células epiteliais dos ductos glandulares em proliferação com o anticorpo anti-pcna. D e E. Imuno-reatividade das células epiteliais dos ductos glandulares em proliferação com o anticorpo anti-ki- 67. F. Imuno-reatividade das células epiteliais dos ductos glandulares com o anticorpo anti-caspase-3 clivada. (Barra=100µ)

A B C D Figura 9: Cadela. Glândula Mamária. Adenocarcinoma Tubular Complexo. Fotomicrografia A. Padrão Tubular com proliferação de células mioepiteliais, coloração de hematoxilina-eosina. B. Imuno-reatividade do anticorpo anti-pcna no núcleo das células epiteliais em proliferação e rara marcação na área mesenquimal. C. Imuno-reatividade do anticorpo-anti-ki-67 no núcleo das células epiteliais em proliferação e rara marcação na área mesenquimal. D. Imuno-reatividade do anticorpo anti-caspase-3 clivada e ausência de marcação na área mesenquimal. (Barra=100µ)

A B C D Figura 10: Cadela. Glândula Mamária. Adenocarcinoma Papilífero Complexo. Fotomicrografia A. Células dos ductos com características neoplásicas e proliferação de células mioepiteliais, coloração hematoxilinaeosina. B. Imuno-reatividade das células epiteliais dos ductos glandulares em proliferação com o anticorpo anti-pcna. C. Imuno-reatividade das células epiteliais dos ductos glandulares em proliferação com o anticorpo anti-ki-67. D. Imuno-reatividade das células epiteliais dos ductos glandulares com o anticorpo anti-caspase-3 clivada (Barra=100µ)

A B C D Figura 11: Cadela. Glândula Mamária. Carcinoma Sólido. Fotomicrografia A. Formações nodulares com padrão sólido das células epiteliais, separadas por septos de tecido conjuntivo, coloração de hematoxilinaeosina. B. Imuno-reatividade do anticorpo anti-pcna no núcleo das células epiteliais em proliferação. C. Imuno-reatividade do anticorpo-anti-ki-67 no núcleo das células epiteliais em proliferação. D. Imunoreatividade do anticorpo anti-caspase-3 clivada evidenciando a ausência de células epiteliais em apoptose. (Barra=100µ)

A B C D E F Figura 12: Cadela. Glândula Mamária. Carcinossarcoma. Fotomicrografia A. Formações tubulares e papilíferas dos ductos glandulares com células epiteliais neoplásicas, coloração hematoxilina-eosina. B. Imuno-reatividade das células epiteliais dos ductos glandulares em proliferação com o anticorpo anti- PCNA. C e D. Imuno-reatividade das células epiteliais dos ductos glandulares em proliferação com o anticorpo anti-ki-67. E e F. Imuno-reatividade das células epiteliais dos ductos glandulares com o anticorpo anti-caspase-3 clivada.(barra=100µ)

A B C D Figura 13: Cadela. Glândula Mamária. Carcinoma em Tumor Misto. Fotomicrografia A. Padrão tubular com células epiteliais neoplásicas, coloração hematoxilina-eosina. B. Imuno-reatividade do anticorpo anti-pcna nas células em proliferação dos ácinos glandulares. C. Imuno-reatividade do anticorpo anti-ki-67 nas células em proliferação dos ácinos glandulares. D. Imuno-reatividade do anticorpo anti-caspase-3 clivada nas células em apoptose dos ácinos glandulares.(barra=100µ)

A B C D E F Figura 14: Cadela. Glândula Mamária. Fotomicrografia A e B Carcinossarcoma. A. Formação de matriz cartilaginosa, coloração hematoxilina-eosina. B. Imuno-reatividade do anticorpo anti-pcna na matriz cartilaginosa. C-F. Carcinoma em Tumor Misto. C Formação de matriz cartilaginosa e óssea, coloração hematoxilina-eosina. D. Imuno-reatividade do anticorpo anti-pcna na matriz cartilaginosa e óssea. E. Imunoreatividade do anticorpo anti-ki-67 na matriz cartilaginosa. E. Imuno-reatividade do anticorpo anti-caspase-3 clivada na matriz cartilaginosa e óssea.(barra=100µ)