PROLIFERAÇÃO E APOPTOSE CELULAR NO ENDOMÉTRIO DA CADELA T E S E D E M E S T R A D O I N T E G R A D O E M M E D I C I N A V E T E R I N Á R I A

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1 PROLIFERAÇÃO E APOPTOSE CELULAR NO ENDOMÉTRIO DA CADELA T E S E D E M E S T R A D O I N T E G R A D O E M M E D I C I N A V E T E R I N Á R I A Sílvia Cruz 10 N O V E M B R O 2011

2 Ciclo éstrico INTRODUÇÃO E OBJECTIVOS Caracteriza-se por modificações cíclicas que ocorrem nas fêmeas após a puberdade. É regulado por mecanismos endócrinos e neuroendócrinos. Proliferação celular; Durante o ciclo éstrico o endométrio sofre alterações morfológicas e bioquímicas: Apoptose celular; Diferenciação celular. O conhecimento destes padrões é importante para o estudo dos mecanismos envolvidos no estabelecimento da gestação e nas alterações patológicas como o complexo hiperplasia quística do endométrio - piómetra.

3 Hiperplasia quística do endométrio (HQE) causa frequente de infertilidade em cadelas mais velhas e é um factor predisponente para o aparecimento de piómetra O mecanismo que leva a esta alteração ainda não é claro, mas: Estimulação E 2 Longo período de dominância P 4 HQE O estabelecimento de um modelo in vitro que permita o estudo do efeito das hormonas esteróides nas células endometriais é relevante para avançar no conhecimento desta afecção.

4 Este trabalho teve como objectivos: Capítulo 1 Avaliar a proliferação e apoptose celular no endométrio normal durante o ciclo éstrico da cadela. Capítulo 2 Estabelecer in vitro um modelo tridimensional de endométrio canino que possibilite o estudo de factores de estimulação e inibição de crescimento e diferenciação celular. Projecto financiado Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - PTDC/CTV/66587/2006; Centro Interdisciplinar de Investigação em Sanidade Animal (CIISA) - CIISA/FMV 74 Hiperplasia do endométrio.

5 PROLIFERAÇÃO E APOPTOSE CELULAR NO ENDOMÉTRIO NORMAL DURANTE O CICLO ÉSTRICO DA CADELA CAPÍTULO 1

6 MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados 44 úteros de cadelas submetidas a OVH de rotina. Para cada cadela: História clínica (data do último cio; existência de gestação prévia); Análise macroscópica do aparelho genital; Zaragatoa vaginal; 5 ml de sangue. Depois da OVH: Amostras de cada corno uterino (cranial e caudal) e os dois ovários: Formol tamponado 4% durante 24h processamento histológico; Citologia vaginal: Corada com giemsa; Sangue: Centrifugado (10min x 3000g) soro armazenado a -20 o C.

7 Caracterização das amostras: Doseamento da progesterona sérica Análise da citologia vaginal Avaliação macroscópica e histológica do útero e ovários Fase do ciclo éstrico Proestro PE1 2 PE2 4 PE3-3 Diestro Estro ID E - 7 ID MD 5 FD - 8 Anestro A - 8

8 Cortes histológicos do útero H&E Ki-67 TUNEL Análise histológica Avaliação da proliferação celular Avaliação da apoptose celular

9 RESULTADOS E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS 500 células de cada uma das estruturas celulares: Epitélio luminal; epitélio das criptas; vasos sanguíneos, estroma e epitélio das glândulas basais Análise da proliferação celular: Índice correspondente à percentagem de células positivas à marcação com o Ki-67 em cada uma das estruturas celulares; Marcação positiva: células com núcleo marcado a castanho. Análise da apoptose celular: Índices correspondentes ao número de células positivas em cada uma das estruturas celulares 5 níveis (0-4); Marcação positiva: células com núcleo marcado a castanho; células com corpos apoptóticos no citoplasma; células com aspecto morfológico característico de apoptose.

10 Ki-67

11 PROESTRO A, B, C GLÂNDULAS BASAIS (400X) D, E, F EPITÉLIO LUMINAL E CRIPTAS (400X)

12 Ki-67

13 INÍCIO DE DIESTRO (0-10 DIAS) A, B, C GLÂNDULAS BASAIS (400X) D, E, F EPITÉLIO LUMINAL E CRIPTAS (400X)

14 Ki-67

15 ESTRO A, B, C GLÂNDULAS BASAIS (400X) D, E, F EPITÉLIO LUMINAL E CRIPTAS (400X)

17 MEIO DE DIESTRO A, B, C GLÂNDULAS BASAIS (400X) D, E, F EPITÉLIO LUMINAL E CRIPTAS (400X)

18 FIM DE DIESTRO A, B, C GLÂNDULAS BASAIS (400X) D, E, F EPITÉLIO LUMINAL E CRIPTAS (400X)

19 ANESTRO A, B, C GLÂNDULAS BASAIS (400X) D, E, F EPITÉLIO LUMINAL E CRIPTAS (400X)

20 TUNEL

22 MEIO DE DIESTRO A, B, C GLÂNDULAS BASAIS (400X) D, E, F EPITÉLIO LUMINAL E CRIPTAS (400X)

23 TUNEL

24 PROESTRO A, B, C GLÂNDULAS BASAIS (400X) D, E, F EPITÉLIO LUMINAL E CRIPTAS (400X)

25 ESTRO A, B, C GLÂNDULAS BASAIS (400X) D, E, F EPITÉLIO LUMINAL E CRIPTAS (400X)

27 CONCLUSÃO Dois picos de proliferação celular: Proestro em todos os grupos celulares; Início de diestro (0-10dias) no epitélio das glândulas basais. Efeito directo do E2 no endométrio Maior índice apoptótico nas células do epitélio das glândulas basais durante o período intermédio do diestro: Regressão do epitélio das glândulas basais associada a mecanismos apoptóticos. Degenerescência do epitélio luminal observada no fim de diestro: Não parece estar associada a mecanismos apoptóticos Alterações nos padrões normais de proliferação e apoptose celular no endométrio da cadela poderão estar envolvidos na patogenia da HQE. Estudo dos factores pró-apoptóticos e anti-apoptóticos poderá ajudar a perceber o balanço entre a proliferação e a apoptose no endométrio.

28 ISOLAMENTO E CULTURA DE CÉLULAS DO ENDOMÉTRIO CANINO NUM SISTEMA TRIDIMENSIONAL CAPÍTULO 2

29 MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados 6 úteros de cadelas submetidas a OVH de rotina. Para cada cadela: História clínica (data do último cio; existência de alguma gestação prévia); Análise macroscópica do aparelho genital; Zaragatoa vaginal; 5 ml de sangue. Depois da OVH: Amostras de cada corno uterino (cranial e caudal) e os dois ovários: Formol tamponado durante 24h processamento histológico; Citologia vaginal: Corada com giemsa; Sangue: Centrifugado (10min.x3000g) soro armazenado a -20 o C.

30 Caracterização das amostras: Doseamento da progesterona sérica Análise da citologia vaginal Avaliação macroscópica e histológica do útero e ovários 3 estro Fase do ciclo éstrico 3 início de diestro (1 os 10dias)

31 ISOLAMENTO E CULTURA DE CÉLULAS Endométrio (2-3mm) Solução de lavagem Solução de digestão com colagenase A (2h a 37ºC) 1ª filtração 2ª filtração Organóides vs células do estroma ressuspendidos em meio com SFB Co-cultura células do estroma e organóides do mesmo animal

32 1ª FILTRAÇÃO

34 2ª FILTRAÇÃO

36 6000 organóides/ cm células estroma/ml 200µl matrigel Para cada cadela: Estufa 37ºC Atmosfera húmida 5% CO 2

37 COLOCAÇÃO DO INSERT COM MATRIGEL NA PLACA DE 24 POÇOS

38 48h 48h 48h 48h Retirar: C(-)2d Retirar : E 2 ; MP; E 2 +MP C(-)8d E mol/ml MP 10-6 mol/ml E 2 +MP 10-8 mol/ml E mol/ml MP

39 H&E Receptores progesterona Vimentina Cortes histológicos Receptores estrogénio Citoqueratina Ki-67

40 RESULTADOS E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS Solução de colagenase A + filtrações Organóides tubulares intactos Morfologia semelhante às glândulas endometriais em tecido uterino 80x

41 OBSERVAÇÃO DOS ORGANÓIDES ÀS 48H Estro Início de diestro 400x 400x

42 MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DA CITOQUERATINA E DA VIMENTINA A e B - Tecido uterino (100x.) C, D, E e F - Células em cultura (200x). Citoqueratina: Marcador das células epiteliais; Marcação das glândulas do tecido e dos organóides da cultura de células. Vimentina: Marcador das células mesenquimais; Marcação das células do estroma do tecido uterino e da cultura de células. Marcação não foi influenciada pela estimulação hormonal.

43 CARACTERIZAÇÃO IMUNOHISTOQUIMICA (KI- 67 E RE) DOS ORGANÓIDES EM CO-CULTURA (400X) Aos 2 dias de cultura: estruturas tubulares; elevado índice de proliferação (início diestro); Aos 8 dias de cultura: Ki-67 E 2 relativamente C(-)8d MP e E 2 +MP < Ki-67 do que o C(- ) 8d e do que E 2 Marcação RE em todas as condições estudadas. Maior expressão dos RE no E 2 As células do estroma também marcaram tanto para o Ki-67 como para os RE.

44 CONCLUSÃO Foi estabelecido um modelo tridimensional para o endométrio canino, no qual as células epiteliais mantiveram a resposta à estimulação hormonal. E 2 aumento da proliferação celular; MP e E 2 +MP diminuição da proliferação celular. Em trabalhos futuros este modelo pode ser usado para o estudo de outros factores para além das hormonas esteróides: IGF1, TGFα e EGF; Parecem estar envolvidos na génese da hiperplasia quística do endométrio.

45 AGRADECIMENTOS FCT (Fundação para a Ciência e Tecnologia); CIISA (Centro Interdisciplinar de Investigação em Sanidade Animal); Departamento de Reprodução e Obstetrícia, nomeadamente ao Professor Doutor Luís Costa, à Doutora Elisabete Silva, à Sofia Henriques e à Patrícia Dinis; Professora Doutora Luísa Mateus; Hospital Veterinário da Estefânia, especialmente à Dra. Patrícia Cabral; Canil Municipal de Sintra, nomeadamente Dra. Alexandra Pereira, Alberto Garcia e Tiago Gonçalves; Liga Portuguesa dos Direitos do Animal, nomeadamente Dra. Célia Antunes, Dra. Teresa Landeiro, Dr. Gonçalo Pereira e Dra. Marta Passos; Hospital Escolar da Faculdade de Medicina Veterinária da Faculdade Técnica de Lisboa, em especial à Dra. Ana Murta; Laboratório de Anatomia Patológica FMV-UTL, Professora Conceição Peleteiro, D. Maria do Rosário e Sandra Carvalho. OBRIGADA!