Fases do Ciclo Celular.

Transcrição

1 Ciclo celular

2 Fases do Ciclo Celular

3 Fases do Ciclo Celular

4 Leveduras são importantes ferramentas para o estudo d ciclo celular

5 O estudo de mutantes cdc sensíveis à temperatura em leveduras foi crucial para a compreensão do ciclo celular cdc = cell-division-cycle ts = temperature-sensitive

6 Rastreio de mutantes sensíveis à temperatura

7 O ciclo celular também pode ser estudado em embriões Oócito de Xenopus

8 O ciclo celular também pode ser estudado in vitro

9 O ciclo celular também é estudado em linhas celulares primárias e imortalizadas fibroblastos primários (25-40 divisões) fibroblastos transformados (imortalizados)

10 Como determinar a fase do ciclo celular de uma célula Marcação com 3 H-timidina e autorradiografia Marcação com BrdU e detecção por immunofluorescência (BrdU = bromo-desoxiuridina)

11 Como determinar a fase do ciclo celular de uma célula citometria de fluxo por FACS

12 Como controlar o ciclo celular? Relógio / temporizador interno que concede um período de tempo específico para cada evento Mecanismo que estabelece uma ordem temporal precisa de eventos (a mitose só deve acontecer após a replicação do DNA e não antes) Mecanismo que garante que um determinado evento só acontece 1 vez Sistema binário (ligado / desligado) que inicia um evento de uma maneira irreversível e completa Sistema robusto com cópias de segurança (backups) redundantes Sistema flexível para poder ser adaptado conforme a estrutura e função da célula

13 O ciclo celular é controlado por pontos de controlo ( checkpoints )

14 Os pontos de controlo normalmente funcionam através de sinais negativos cromossomas não ligados ao fuso mitótico enviam sinais negativos inibindo a progressão da mitose

15 O controlo do ciclo celular é realizado em grande parte por cinases dependentes de ciclinas (cdk) ciclina ciclina P proteína substrato Evento Y cdk (inactiva) cdk (activa) proteína substrato Evento X

16 Modelo muito simplificado de como os complexos ciclinas-cdks actuam sobre o ciclo celular

17 Tipos de ciclinas e suas funções Ciclinas G1 (na maioria das células) - promovem a passagem de G1 para S através do ponto de controlo START Ciclinas G1/S - ligam-se a Cdks no fim da fase G1 e comprometem a célula a iniciar e terminar a replicação de DNA Ciclinas S - ligam-se a Cdks durante a fase S, sendo necessárias para a replicação de DNA Ciclinas M - promovem eventos associados à mitose

18 Em leveduras várias ciclinas ligam-se a uma Cdk, em vertebrados elas ligam-se a várias Cdks específicas para cada ciclina

19 As Cdks podem ser estimuladas por outras cinases (ex: CAK)

20 As Cdks podem ser inibidas por outras cinases (ex: Wee1), que por sua vez podem ser contrariadas por fosfatases (ex: Cdc25)

21 As Cdks podem ser inibidas por ligação a proteínas inibidoras (CKIs = cdk inhibitor proteins)

22 Qual a função das ciclinas-s-cdk? Como funcionam?

23 Os complexos ciclinas-s-cdk estimulam a replicação de DNA apenas uma vez por ciclo

24 Qual a função das ciclinas-m-cdk? Como funcionam?

25 A activação dos complexos ciclina-m-cdk que estimulam a entrada da célula na mitose é regulada por sinais positivos, negativos e de feedback positivo

26 As proteínas citosólicas e nucleares quando marcadas com uma etiqueta molecular (ubiquitina) são degradadas pela célula num complexo cilíndrico chamado proteassoma

27 O controlo do ciclo celular depende da proteólise cíclica das ciclinas e/ou dos inibidores das Cdks (CKIs) Fase G1 e S (SCF, ligase de ubiquitina com actividade constitutiva, reconhece substratos fosforilados) Fase M (APC = anaphase promoting complex, promove também a ubiquitinação dos seus substratos, mas a sua actividade depende de proteínas reguladoras)

28 Outra função do complexo APC-cdc20 é a promoção da separação dos cromatídeos irmãos Os cromatídeos irmãos são mantidos juntos pela coesina

29 Outra função do complexo APC-cdc20 é a promoção da separação dos cromatídeos irmãos Prova experimental que sublinha a importância da proteólise para a progressão da mitose

30 Outra função do complexo APC-cdc20 é a promoção da separação dos cromatídeos irmãos (anafase) APC-cdc20 estimula a degradação do inibidor da separase, a enzima que degrada as coesinas

31 A acumulação da ciclina M (ciclina B em vertebrados) durante a fase S e G2 activa cdk1 na fase G2 tardia e, antes da anafase, esta ciclina é rapidamente destruída por proteólise

32 Entrada na mitose, porém, precisa de passar com sucesso pelo ponto de controlo da replicação A hidroxiureia é um inibidor da síntese de DNA A cafeína é um inibidor de fosfatases Trabalho para a aula TP: procurar as causas destes resultados.

33 Funções da activação do complexo ciclina-m-cdk Indução da montagem do fuso mitótico Verificação se os cromossomas estão ligados ao fuso (ponto de controlo da ligação ao fuso; spindle attachment checkpoint) Indução da condensação dos cromossomas (na maioria das células) Destruição do invólucro nuclear, incluindo a despolimerização da lâmina nuclear (em vertebrados, mas não em leveduras) Activação do complexo APC-cdc20, que promove a sua destruição e a anafase

34 Ponto de controlo de ligação ao fuso Cdc20-APC Mad2 Metafase Anafase

35 A fase G1 depende da estabilidade da inibição de cdk após a mitose Ciclina M (-) (+) Cdc20 APC APC Hct Ciclina M

36 No inicio da fase G1 é a fase do ciclo celular com menor actividade de cdks A concentração de ciclinas (S/G1, M) é baixa (devido a proteólise e baixa expressão dos genes das ciclinas) A concentração de CKIs é suficiente para inibir ainda mais qualquer actividade das cdks

37 Como as ciclinas-g1/s-cdk ultrapassam a inibição imposta pelos CKIs e o Hct-APC?

38 A proteína Rb (Retinoblastoma) é crucial para a regulação da passagem da fase G1 para a fase S e a sua actividade inibidora tem de ser inibida por fosforilação por parte dos complexos ciclina G1-cdk

39 p53 é crucial para a regulação do ponto de controlo G1 e detecção de danos no DNA

40 Sumário da regulação do ciclo celular

41 p53 é crucial para a decisão entre entrada na fase S ou apoptose

42 p53 é crucial para a decisão entre entrada na fase S ou apoptose Filme p53.swf

43 As bolhas de apoptose (blebs) são provavelmente os locais de apresentação de antigéneos aos leucócitos

44 p53 é um dos genes que aparece mutado com mais frequência em células tumorais

45 Leituras Recomendadas Livros online recomendados: Lodish et al e Alberts et al. Palavras chave de pesquisa recomendadas: cell cycle, cyclin, cdk, replication checkpoint, spindle attachment checkpoint, CKI, p53, apoptosis, APC, Rb