Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações

Transcrição

1 Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações Letícia Veras Costa Lotufo Laboratório de Oncologia Experimental Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC [email protected]

2 PROGRAMA: 11/02 aula 1 - Princípios básicos Ensaios de citotoxicidade aula 2 Aplicações no estudo de novas drogas anticâncer 12/02 aula 3 Aplicações no estudo de novas drogas anticâncer aula 4 - Morte celular: apoptose versus necrose

3 O ciclo celular Seqüência ordenada de eventos que possibilita a geração de duas células filhas idênticas à célula original Estímulos: Crescimento Reparo Morte celular Estágios do ciclo: Quiescência Intérfase Mitose

4 Interfase 95% do ciclo celular Duplicação das organelas Duplicação do DNA Crescimento Sub-divida em 3 fases: G1 S G2

5 Fase G1 Metabolicamente ativas Duplicação de organelas, mas não do DNA Duração variável Prepara para fase S

6 Fase S Sinal para duplicação celular Duplicação do centrossomo Replicação semiconservativa do DNA- 2 cópias idênticas do genoma

7 Fase G2 Crescimento contínuo Síntese de proteínas (enzimas) para divisão celular A fase da interfase pode ser identificada pelo conteúdo de DNA

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9 Controle do ciclo celular Controle do ciclo celular: Ciclinas CDKs Fosforilação/desfosforilação Checkpoints Proteínas supressoras tumorais

10 Controle do ciclo celular Ciclinas CDKs Fosforilação/desfosforilação

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12 Progressão G1-S

13 O ciclo celular Controle do ciclo celular: Ciclinas CDKs Fosforilação/desfosforilação Checkpoints Proteínas supressoras tumorais

14 Pontos de checagem Checkpoints :

15 Checkpoints: Ponto de checagem G1 Ponto de restrição Ponto de checagem G2 Localizado na transição G2-M Síntese de DNA completa e correta para a célula entrar em mitose Ponto de checagem da mitose Localizado na transição da metáfase para anáfase Todos os cromossomos devem estar ligados ao fuso Foster A., Radiography, 2007.

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17 ATIVAÇÃO DE SISTEMAS DE REPARO ATIVAÇÃO DE VIAS DE INDUÇÃO DE APOPTOSE

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19 Mitose

20 Aspectos mecânicos da mitose Microtúbulos e proteínas associadas Quinesinas Jordan & Wilson, 2004; Woehlke G and Schliwa M, 2000

21 BASE MOLECULAR DO CÂNCER Agentes que causam lesão no DNA Célula Normal Reparo bem sucedido do DNA Incapacidade de Reparo do DNA Lesão no DNA Mutação em células somáticas Mutações herdadas em: - Genes que afetam o reparo do DNA; - Genes que afetam o crescimento ou apoptose celular oncogenes apoptose supressores tumorais Expressão de produtos gênicos alterados e perda de produtos gênicos reguladores Expansão clonal Mutações adicionais (progressões) Heterogeneidade Neoplasia maligna Kummar, adaptado

22 CÂNCER É uma doença genética complexa causada por mutações em genes que controlam o crescimento celular e/ou apoptose (morte celular programada).

23 CÂNCER Mitoses freqüentes Neovascularização Núcleo aumentado Células anormais e heterogêneas Proliferação descontrolada Síntese anormal de DNA Síntese de proteínas alteradas Perda de inibição por contato Desdiferenciação e perda da função Comprometimento do mecanismo intrínseco de apoptose Neovascularização Poder de invasão e metástase

24 Transformação maligna 4 célulasc Célula normal 2 célulasc 16 célulasc 8 célulasc 1 milhão de célulasc (20 duplicações) 1 bilhão de célulasc (30 duplicações) detectável 1 trilhão de célulasc (40 duplicações)

25 PATOGÊNESE TRANSFORMAÇÃO ANGIOGÊNESE MOTILIDADE E INVASÃO ADERÊNCIA CAPILARES, VÊNULAS E LINFÁTICOS EMBOLISMO E CIRCULAÇÃO TRANSPORTE AGREGAÇÃO MULTICELUAR (LINFÓCITOS E PLAQUETAS) EXTRAVASAMENTO RESPOSTA AO MICROAMBIENTE METASTASES METÁSTASES DE METÁSTASES PROLIFERAÇÃO CELULAR TUMORAL E ANGIOGÊNESE

26 Câncer e Ciclo celular Moléculas Função no ciclo celular Alterações moleculares no câncer Ciclina D Promove a entrada na fase G1 Amplificado Ciclina E Promove a progressão da fase G1 Amplificado CDK4 Promove a entrada na fase S Amplificado Rb1 Regulação nos pontos de checagem G1/S Perda ou inativo p15 e p16 Inibidores da CDK4 e CDK6 Perda TP53 Regulação nos pontos de checagem G1/S e G2/M Perda ou inativo

27 GENES-ALVOS NA CARCINOGENICIDADE: PROTO-ONCOGENES GENES SUPRESSORES Ativados por Mutações RNA -virus DNA-vírus Inativados por Mutações -dominante -Atividade -recessivo -perda de atividade REPLICAÇÃO DO DNA e PROLIFERAÇÃO CELULAR

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30 TRATAMENTO DA DOENÇA Cirurgia; Quimioterapia consiste em um tratamento a base de fármacos que interferem em diferentes processos tais como: desenvolvimento, crescimento, disseminação e invasão de células cancerígenas (Souza et al., 2007). Radioterapia;

31 QTs Antineoplásicos Ciclo-específicos e cicloinespecíficos Fase-específicos: S M Antibiotics Antimetabolites S (2-6h) Alkylating agents G2 (2-32h) M (0.5-2h) Vinca alkaloids Taxoids G1 (2- h) G0

32 SÍTIO DE AÇÃO A DOS QUIMIOTERÁPICOS Antimetabólitos (inibe síntese de TMP) Hidroxiuréia, PALA (inibe ribonucleosídeo redutase e inibe biosíntese de pirimidina) Antagonistas purínicos (inibem síntese purínica) Dactinomicina e derivados (intercalação no DNA e inibição da RNA polimerase) Agentes alquilantes (formam derivados com DNA) Enzimas (inibe síntese protéica) Alcalóides vegetais e taxóis (inibe polimerização de microtúbulos) Calabresi e Chabner,

33 Bioensaios

34 Coleta e e identificação de de material Toxicidade em Artemia salina Citotoxicidade em 4 linhagens tumorais (MTT) Atividade hemolítica Inibição do desenvolvimento de ovos do ouriço do mar Identificação dos dos compostos ativos Proliferacão celular (MTT) Inibição de de topoisomerase I e II II Fracionamento biomonitorado das das amostras (MTT) Estudo do do mecanismo de de atividade citotóxica Cinética celular (curva de de crescimento) Estudos in vivo Sarcoma 180 Análise morfológica (coloração por H/E) Indução de de apoptose (citometria de de fluxo) Duplicação celular (incorporação de de BrdU)

35 Ensaios celulares para o desenvolvimento de novas drogas anticâncer Programas de screening Etapa inicial HTS Ensaios de citotoxicidade

36 Exclusão por Azul de Tripan Construção de curvas de crescimento Tripan Amostra Contagem Inviável Azul de Tripan Viável

37 INCORPORAÇÃO DE BRDU - SÍNTESE DE DNA - BrdU Anticorpos Primário e Secundário DAB Montar placa Estreptavidina- Peroxidase DNA Síntese de DNA Desnaturação

38 Síntese de DNA-Positivo Síntese de DNA-Negativo

39 Análise morfológica Coloração diferencial por hematoxilina/eosina Montar placa Incubar com droga Análise 24h Hematoxilina Eosina Hematoxilina Eosina

40 ANÁLISE PELO CONTEÚDO DO DNA G1 Number DNA Fragmentado G2 CICLO CELULAR Channels (RED-HLin-Red Fluorescence (RED-HLin))

41 CITOMETRIA DE FLUXO 100 µm Detectores: Filtros: Laser de íon argônio (488 nm) FSC Vermelho Amarelo 680 nm 583 nm Verde 525 nm SSC Células

42 Alguns exemplos:

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49 Alguns exemplos: Cancer Cell 2005, Vol 8: 49-59

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51 Topoisomerases I/II

52 O Problema Topológico

53 Mecanismo de ação da DNA topoisomerase I A topoisomerase I introduz um nick no DNA, permitindo a rotação duma cadeia em torno da outra e aliviando a força de torsão que se acumula à frente do garfo replicativo. O nick é transitório, sendo re-ligado imediatamente após a topoisomerase I ter libertado a outra cadeia.

54 Mecanismo de ação da DNA topoisomerase I

55 Mecanismo de ação da DNA topoisomerase II As topoisomerases também podem levar a cabo a reação inversa, ou seja, introduzir mais voltas na hélice, causando o seu super-enrolamento.

56 Topo I/II Drug Screening Topoisomerase Inibidor SC-DNA 30 min a 37ºC; Parar a reação com SDS 10%; Digestão com PK; Extração de impureza com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) Análise Eletroforese em gel de agarose 1%

57 Topo I/II Relaxation Assays

58 Topo I/II Cleavage Analyses

59 Kinetoplast DNA (kdna)

60 Kinetoplast DNA (kdna)

61 Alguns exemplos

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66 ATÉ JÁ