3.. RESULTADOS 3.1. Isolamento de riquétsias do GFM em cultura de células Vero a partir de carrapatos Amblyomma cajennense Dos 24 lotes de carrapatos A. cajennense adultos coletados na Fazenda Santa Júlia, município de Jaguariúna/SP, semeados em células Vero, um lote de machos e três de fêmeas resultaram positivos para o isolamento de riquétsias. A tabela 2 apresenta respectivamente as datas de coleta dos carrapatos machos e fêmeas, assim como os resultados da RIFI para confirmação da infecção das células por riquétsias do GFM. No total, foram analisados 510 exemplares. A freqüência mínima de carrapatos positivos (FMCP) foi de 0,41 para os machos e de 1,11 para as fêmeas. Nesta fazenda, a FMCP total foi de 0,78. Dos 25 lotes de carrapatos A. cajennense coletados na Fazenda Monte D Este, município de Campinas/SP, inoculados em cultura de células Vero, um lote de machos e quatro de fêmeas resultaram positivos para o isolamento de riquétsias. A tabela 3 apresenta respectivamente, as datas de coleta dos carrapatos machos e fêmeas, os resultados da RIFI para confirmação da infecção das células por riquétsias do GFM. No total foram analisados 502 exemplares. A freqüência mínima de carrapatos positivos (FMCP) foi de 0,40 para os machos e de 1,56 para as fêmeas. Nesta fazenda, a FMCP total foi de 0,99. 30
Tabela 2 - Detecção de riquétsias do GFM, a partir de carrapatos Amblyomma cajennese coletados na Fazenda Santa Júlia, Município de Jaguariúna, em cultura de células Vero. São Paulo, 2002. Coleta Lote Carrapato (n) Sexo RIFI Coleta Lote Carrapato (n) Sexo RIFI 20/03/00 L15 20 M - 21/02/00 L06 50 F + 20/03/00 L 12 20 M - 21/02/00 L09 20 F + 20/03/00 L 13 20 M - 11/04/00 L42 20 F - 11/04/00 L 31 20 M - 11/04/00 L43 20 F + 11/04/00 L 32 20 M - 11/04/00 L44 20 F - 11/04/00 L 34 20 M - 11/04/00 L45 20 F - 11/04/00 L 35 20 M - 11/04/00 L49 20 F - 11/04/00 L 36 20 M + 11/04/00 L50 20 F - 11/04/00 L 37 20 M - 11/04/00 L51 20 F - 11/04/00 L 38 20 M - 11/04/00 L52 20 F - 11/04/00 L 39 20 M - 11/04/00 L53 20 F - 26/04/00 L 79 20 M - 22/05/00 L95 20 F - Total 12 240 Total 12 270 RIFI: Reação de Imunofluorescência Indireta M: macho; F: fêmea L: lote (+) cultura positiva e (-) negativa n: número de indivíduos contidos no lote 31
Tabela 3 - Detecção de riquétsias do GFM a partir de carrapatos Amblyomma cajennese machos coletados na Fazenda Monte D Este, Município de Campinas, em cultura de células Vero. São Paulo, 2002. Coleta Lote Carrapato (n) Sexo RIFI Coleta Lote Carrapato (n) Sexo RIFI 29/02/00 L 02 47 M + 29/02/00 L05 48 F - 21/03/00 L 21 20 M - 21/03/00 L25 20 F + 21/03/00 L 22 20 M - 21/03/00 L26 20 F - 12/04/00 L59 20 M - 21/03/00 L28 20 F + 12/04/00 L60 20 M - 21/03/00 L30 08 F - 12/04/00 L61 20 M - 21/03/00 L58 04 F - 12/04/00 L62 20 M - 12/04/00 L65 05 F - 25/04/00 L74 20 M - 12/04/00 L67 20 F + 09/05/00 L85 20 M - 12/04/00 L68 20 F - 09/05/00 L86 20 M - 12/04/00 L69 20 F + 09/05/00 L87 20 M - 12/04/00 L70 20 F - RIFI: Reação de Imunofluorescência Indireta M: macho; F: fêmea L: lote (+) cultura positiva e (-) negativa n: número de indivíduos contidos no lote 25/04/00 L76 10 F - 09/05/00 L91 20 F - 23/05/00 L97 20 F - Total 11 247 Total 14 255 32
Nenhum dos 26 lotes de carrapatos A cajennense coletados na Fazenda Instituto Agronômico, município de Monte Alegre do Sul/SP, inoculados em células Vero, resultaram positivos para o isolamento de riquétsias. A tabela 4 apresenta respectivamente, as datas de coleta dos carrapatos machos e fêmeas, assim como os resultados da RIFI utilizados para confirmação da infecção das células por riquétsias do GFM através do isolamento. No total foram analisados 471 exemplares. Nesta fazenda, a FMCP total foi igual a zero. As figuras 4 e 5 documentam resultados da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para detecção de riquétsias do GFM em culturas de células Vero, inoculadas com triturados de carrapatos. 33
Tabela 4. Isolamento de riquétsias do GFM a partir de carrapatos Amblyomma cajennese machos coletados na Fazenda Instituto Agronômico, Município de Monte Alegre do Sul/SP, em cultura de células Vero. São Paulo, 2002. Coleta Lote Carrapato (n) Sexo RIFI Coleta Lote Carrapato (n) Sexo IFI 24/05/00 L100 20 M - 22/03/00 L56 07 F - 24/05/00 L101 20 M - 13/04/00 L73 20 F - 24/05/00 L102 20 M - 27/04/00 L82 20 F - 24/05/00 L107 20 M - 27/04/00 L83 05 F - 24/05/00 L108 20 M - 11/05/00 L93 20 F - 24/05/00 L109 20 M - 24/05/00 L103 20 F - 24/05/00 L110 10 M - 24/05/00 L104 20 F - 14/06/00 L130 20 M - 24/05/00 L105 20 F - 14/06/00 L131 20 M - 24/05/00 L106 16 F - 14/06/00 L132 20 M - 14/06/00 L137 20 F - 14/06/00 L134 20 M - 14/06/00 L138 20 F - 29/06/00 L167 20 M - 14/06/00 L139 14 F - 29/06/00 L165 20 F - 29/06/00 L166 19 F - Total 12 230 Total 14 241 RIFI: Reação de Imunofluorescência Indireta M: macho; F: fêmea L: lote (+) cultura positiva e (-) negativa n: número de indivíduos contidos no lote 34
a b Figura 4. Reação de Imunofluorescência Indireta em cultura de células Vero (a) não infectadas, controle negativo e (b) infectadas com Rickettsia rickettsii cepa Sheila Smith (Center for Disease Control, Atlanta, EUA), controle positivo. Aumento de 400X. 35
a b Figura 5. Reação de Imunofluorescência indireta em cultura de células Vero infectadas com Rickettsia do GFM isolada de carrapatos Amblyomma cajennense colhidos na Fazenda Monte D`Este, Município de Campinas (a) Lote 02 machos, e (b) Lote 69 fêmeas. Aumento de 400X. 36
3.2. Detecção de riquétsias do GFM em carrapatos e em coágulos sanguíneos humanos através da PCR 3.2.1. Carrapatos A tabela 5 apresenta os resultados nas pesquisas dos genes riquetsiais dos lotes de triturados de carrapatos Amblyomma cajennense, através da PCR. De um total de 75 lotes analisados, 22 resultaram em positivos com os genes glta e ompa. As figuras 6 e 7 mostram respectivamente, os géis de agarose com os fragmentos amplificados pela PCR na pesquisa dos genes glta e ompa, dos lotes de carrapatos analisados. 37
Tabela 5. Pesquisa de DNAg riquetsial em triturados de carrapatos Amblyomma cajennense pela reação em cadeia da polimerase. Localidade Gene Número de Identificação (lote) FMCP glta Fêmea Macho F M F/M Santa Júlia 06* 0 0,37 0 0,19 Monte D Este 97 02* e 22 0,39 0,80 0,59 Instituto Agronômico 0 0 0 0 0 Total 0,39 ompa Fêmea Macho F M F/M Santa Júlia 09* 18 0,41 0,37 0,39 Monte D Este 25*, 26, 28*, 21 3,13 0,40 1,79 58, 65, 68, 70 e 76 Instituto 56, 103 e 109, 134, 1,65 1,30 1,48 Agronômico 106 137 e 167 Total 1,21 PCR: reação em cadeia da polimerase FMCP: freqüência mínima de carrapatos positivos F: fêmea e M: machos * lotes positivos em cultura de células Vero glta gene que codifica citrato sintase, organismos do gênero Rickettsia ompa gene que codifica proteína 190 kda de riquétsias dos grupos tifo (GT) e da febre maculosa (GFM) 38
M + + C- C+ 381 pb : FIGURA 6. Lotes de carrapatos (16) coletados na Fazenda Monte D Este, Campinas, analisado pela PCR para a pesquisa do gene glta;m, Marcador molecular 100 pb; C-, Controle negativo; C+, Controle positivo DNAg de Rickettsia rickettsii, cepa Sheila Smith (100 ng/ml) ; + lotes positivos. 39
M + + + + + + + + + + + C - C + 532 pb : M + + + + + + + C - C + 532 pb : FIGURA 7. Lotes de carrapatos (16) coletados na Fazenda Monte D Este, Campinas, analisado pela PCR para a pesquisa do gene omp A; M, Marcador Molecular 100 pb; C-, Controle negativo; C+, Controle positivo DNAg de Rickettsia rickettsii, cepa Sheila Smith (100 ng/ml); + lotes positivos. 40
3.2.2. Coágulos sanguíneos humanos Genes glta, ompa e omp B: genes riquetsiais foram detectados em 19 dentre as 20 amostras de pacientes com suspeita clínica para FM, procedentes dos municípios de Arthur Nogueira, Amparo, Campinas, Jaguariúna e Paulínia no Estado de São Paulo. Quatro das amostras positivas puderam ser confirmadas como do Grupo da Febre Maculosa. As figuras 8 e 9 mostram géis de agarose com produtos amplificados pela PCR e confirmação pela Southern blotting. A tabela 6 sumariza os dados obtidos nos ensaios realizados para cada amostra. 41
Tabela 6 Pesquisa de DNAg riquetsial em coágulos sanguíneos de pacientes com suspeita de Febre Maculosa pela reação em cadeia de polimerase e hibridação Southern blotting. Gene glta Gene ompb Gene omp A Amostra Localidade PCR S.Blot PCR S. Blot PCR S. Blot 01 Paulínia - - + + + + 02 Campinas - - - + - - 03 Artur Nogueira + + + + - + 04 Campinas + + - - - - 05 Campinas - + + + - - 06 Campinas - + + + - - 07 Jaguariúna + + + + - - 08 Campinas - + + + - - 09 Amparo - + + + - - 10 Amparo - - + + - - 11 Amparo - - + + - - 12 Campinas - - - - + + 13 Campinas - - + + - - 14 Campinas + + + + - - 15 Campinas - - - - - - 16 Campinas - + - - - - 17 Campinas - - + + - - 18 Campinas + + - - + + 19 Campinas - + + + - - 20 Campinas - + + + - - TOTAL 5 12 14 15 3 4 PCR: reação em cadeia da polimerase S.blot: reação de hibridação de Southern blotting (+) amostra positiva e (-) negativa 42
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C- C+ 381 pb I M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C- C+ III M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C- C+ 650 pb II M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C- C+ IV FIGURA 8. Amostras de coágulos sanguíneos (1-10) analisados pela PCR para o gene glta (I) e gene ompb (III) e Southern blotting correspondentes (II e IV); M, Marcador molecular 100 pb; C-, Controle negativo; C+, Controle positivo DNA g de Rickettsia rickettsii, cepa Sheila Smith (100 ng/ml); numeração em vermelho amostras positivas e em preto, negativas. 43
M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C- C+ 532 pb I M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C- C+ II FIGURA 9. Amostras de coágulos sanguíneos (11-20) analisados pela PCR para o gene ompa (I) e Southern blotting (II); M, Marcador Molecular 100 pb; C-, Controle negativo; C+, Controle positivo DNA g de Rickettsia rickettsii, cepa Sheila Smith (100 ng/ml); numeração em vermelho amostras positivas e, em preto negativas. 44
3.3. Seqüenciamento O fragmento do gene ompb amplificado pela PCR do DNAg extraído da amostra 3, do município de Artur Nogueira foi clonado e seqüenciado, apresentando 98% de similaridade com Rickettsia rickettsii (GenBank, gi/46393). 003 AATTCGATTG R.rickettsii............G 003 GCAATTAATA TCGCTGACGG TCAAGGTATC ATATTCAATA CTGATGCTAA R.rickettsii GCAATTAATA TCGCTGACGG TCAAGGTATC ATATTCAATA CTGATGCTAA 003 TAATGCTAAT ACTTTAAATT TACAAGCAGG TGGTACTACT ATTAATTTTA R.rickettsii TAATGCTAAT ACTTTAAATT TACAAGCAGG TGGTACTACT ATTAATTTTA 003 CTGGAACAGA CGGTACGGGT AGATTAGTAT TATTAAGTAA GCATGCTGCT R.rickettsii CTGGAACAGA CGGTACGGGT AGATTAGTAT TATTAAGTAA GCATGCTGCT 003 GCTACCAACT TTAACATTAC AGGAAGTTTA GGCGGTAATC TAAAAGGTGT R.rickettsii GCTACCAACT TTAACATTAC AGGAAGTTTA GGCGGTAATC TAAAAGGTGT 003 TATCGAATTT AACACTGTTG CAGTAGACGG TCAACTTACA GCTAATGCAG R.rickettsii TATCGAATTT AACACTGTTG CAGTAGACGG TCAACTTACA GCTAATGCAG 003 GCGCTGCTAA TGCAGTAATA GGTACTAATA ATGGCGCAGG TAGAGCTGCA R.rickettsii GCGCTGCTAA TGCAGTAATA GGTACTAATA ATGGCGCAGG TAGAGCTGCA 003 GGATTTGTTG TTAGCGTAGA ATAAKGGTTA AGGTTAGCAT CAATCGATGG R.rickettsii GGATTTGTTG TTAGCGTAGA.TAATGGTAA GG..TAGCAA CAATCGATGG 003 ACAAGTTT.............. R.rickettsii ACAAGTTT.............. 45
Tabela 7 Grau de identidade calculado para cada par de seqüências de nucleotídeos, entre a amostra de coágulo sanguíneo e as seqüências obtidas pelo GenBank, São Paulo, 2003. Am 1 R. afri. R. aus. R. ak. R. fel. R. hon. R. par. R. ric. R. sib. Amostra 1 100.0 92.7 86.4 85.1 84.8 93.5 92.9 98.0 92.9 R. africae - 100.0 87.7 86.2 89.9 97.2 99.1 97.3 99.2 R. australis - - 100.0 94.0 88.4 87.5 87.7 87.0 87.7 R. akari - - - 100.0 86.8 86.1 86.1 85.8 86.1 R. felis - - - - 100.0 89.3 89.7 89.5 89.8 R. honei - - - - - 100.0 97.2 97.2 97.2 R. parkeri - - - - - - 100.0 97.3 99.0 R. rickettsii - - - - - - - 100.0 97.3 R. sibirica. - - - - - - - - 100.0 46