UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO AF 060- Biotecnologia Vegetal Marcadores Moleculares Prof a. Renata Faier Calegario Profº Bruno Portela Brasileiro
Marcadores genéticos Marcador: função de identificar ou etiquetar; Marcadores genéticos: marcar alelos cuja expressão seja de difícil identificação; Selecionar o alelo de interesse de forma indireta, por meio do marcador;
Marcadores genéticos Deve ser herdável e de fácil avaliação; Deve estar intimamente ligado ao alelo que deseja-se selecionar; Estudos de divergência genética, teste de paternidade, seleção etc. Marcadores genéticos: Morfológicos; Moleculares.
Marcadores moleculares Década de 70: engenharia genética (biologia molecular); Marcadores moleculares: Proteínas (produtos diretos dos alelos); DNA (seqüências de DNA situadas próximas aos genes que queremos marcar).
INTRODUÇÃO Marcadores Características que permitem a distinção de indivíduos geneticamente diferentes Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares (BORÉM, 1997).
Aplicações: diversas áreas do conhecimento Melhoramento Genética mendeliana Genética de populações Marcadores Genéticos Genética molecular Organização do genoma Sequenciamento Transferência gênica
Fenótipo Características visíveis de um indivíduo Sofre influência: ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Genótipo Fatores ambientais Genótipo Constituição genética de um organismo => o conjunto de genes
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Haplóide: Constituído por uma cópia de cada cromossomo Diplóide: Constituído por duas cópias de cada cromossomo Alelo: Genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos Local ocupado pelo gene no cromossomo Haplóide Diplóide
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Homozigotos: Célula diplóide com alelos idênticos de um gene em ambos os cromossomos homólogos Heterozigotos: Célula diplóide com alelos diferentes de um gene em ambos os cromossomos homólogos
DOMINÂNCIA Gene Recessivo (a) Só manifesta o fenótipo quando em homozigose (aa) Presente em dose dupla (dois alelos iguais) Gene Dominante (A) Manifesta o mesmo fenótipo em homozigose (AA) e heterozigose (Aa)
MARCADORES DOMINANTES A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 A1= alelo dominante Presença de bandas 2 alelos recessivos no mesmo loco: Ausência de banda só amplifica locus com alelos dominantes Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose => exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto
MARCADORES CO-DOMINANTES A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 Genes no mesmo locus Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose => Expressão de ambos os alelos no heterozigoto
Monomorfismo e Polimorfismo
TIPOS DE MARCADORES Marcadores Morfológicos Características fenotípicas do organismo Ex. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala Marcadores Bioquímicos Presença ou ausência de compostos Ex. isoenzimas e proteínas Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas
CONCEITO DE MARCADOR dominante e co-dominante Dominante Co-Dominante
Tipos de Marcadores
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM MARCADOR Reprodutibilidade Amplamente distribuído através do genoma Poder de discriminação Ausência de influências ambientais Barato Fácil de mensurar
MARCADORES MOLECULARES Marcadores genéticos que exploram a variabilidade do DNA Características polimórficas herdáveis que refletem diferenças na sequência de DNA ao nível de nucleotídeos Qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA Polimorfismo detectado na sequência de DNA => Variabilidade
APLICAÇÕES Diversidade genética de organismos Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de qualquer outra variedade da mesma espécie Análise da pureza genética de semente Mapeamento de genes e características (associação do marcador com os genes de interesse) Seleção de genitores Retrocruzamento assistido...
MARCADORES MOLECULARES Vantagens Não sofre influência do ambiente Neutros em relação a efeitos fenotípicos N ilimitado de marcadores e de polimorfismo Identificação de genótipos em estágios iniciais da planta Acelera o processo de seleção e recombinação desejáveis Desvantagens Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos
CLASSES DE MARCADORES MOLECULARES A partir 1980... => Varia de acordo com a técnica usada para identifica-lo RFLP Restrição e Hibridização de sequências DNA RAPD, Microssatélites PCR AFLP PCR + restrição...
Técnicas para obtenção de padrão polimórfico de DNA Marcadores baseados em PCR PCR (Reação da polimerase em cadeia). RAPD ISSR Microssatélites Minissatélites AFLP, etc.
Marcadores isoenzimáticos Marcadores de proteína mais utilizados são representados pelas isoenzimas (esterase, fosfatase, peroxidase etc); Como são produtos diretos dos alelos, basta identificá-los para selecionarmos os indivíduos com o fenótipo desejado; Possuem reduzida variabilidade (polimorfismos);
Marcadores isoenzimáticos Os alelos responsáveis pelas proteínas facilmente identificáveis não ocorrem em número suficiente para marcar um grande número de alelos de interesse. Ex. Em cevada Isoenzima esterase para selecionar plantas resistentes ao vírus do mosaico amarelo. Vantagem: menores custos.
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfirmo no tamanho do fragmentos de restrição Utiliza o DNA genômico digerido com enzima de restrição Examina diferenças no tamanho dos fragmentos de DNA Polimorfismo: é resultado de mutação pontual, inserção, deleção Requer conhecimento sequência
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência das duas cadeias é igual quando for lida de 5 para 3 5... 3......3...5 5......3 3......5
RFLP Planta, fungo, organismos... Hibridização Southern Blot
RFLP - METODOLOGIA 1. DNA tratado com enzimas de restrição = Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos: Eletroforese (gel agarose) 3. Transferência DNA para a membrana e Hibridização com sonda 4. Visualização dos fragmentos na membrana Southern blot sondas marcadas ( 32 P) ou Fluorescência 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas A escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada
SOUTHERN BLOTTING Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico COMO? Sonda: sequência complementar de DNA alvo Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA Sondas Radioativas = nt 32 P Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica ou quimioluminescente)
SOUTHERN BLOTTING Tratamentos: Depurinação Desnaturação Neutralização TRANSFERÊNCIA Gel: Fragmentos DNA - REVELAÇÃO Lavagens Retira excesso de sonda HIBRIDIZAÇÃO - - - - - - - - - - - -
Brássica: diferentes padrões de bandas em F2 = diferença genética => representam um loco RFLP = pode ser usado como marcador genético Eletroforese do DNA cortado com enzima de restrição Homozigotos p/ os alelos A1: 3, 5, 6, 7, 8, 9 Homozigotos p/ os alelos A2: 1, 2,4 Gel revelado com EtBr => UV Visualização de arraste contínuo de fragmentos de DNA
RFLP Vantagens Reprodutibilidade Marcadores co-dominantes Simples Desvantagens Trabalhoso Caro Uso de sondas radioativas
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA Fragmentos de DNA amplificados por PCR Método mais rápido para detecção de polimorfismos DNA genômico amplificado por PCR Uso de um único primer aleatório (8-10 bases): função de R e F Não requer conhecimento da sequência Marcador dominante
RAPD - METODOLOGIA 1. DNA é amplificado via PCR com primer aleatório => Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos por eletroforese 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas
RAPD - METODOLOGIA A B A B
PRIMERS ALEATÓRIOS DNA Primer se anela em vários pontos do DNA (desconhecidos) Quando se anela em direções opostas = Amplificação Anelamento em pequenas distâncias Vários Fragmentos
RAPD - Feijoeiro Resistentes à raça 65 1200 pb 1000 pb 550 pb marcador ligado à Co-1 Co-1 = gene que confere resistência à raça 65 de C. lindemuthianum Fonte: Moura, 2005
RAPD Vantagens Rápido e simples - não envolve hibridização Baixo custo Sem uso de radioisótopos Não precisa conhecimento prévio da sequência de DNA Desvantagens Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são conhecidos Problemas de interpretação: co-migração - mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro! - uma banda: um fragmento? Pode ser dois! Fonte: IPGRI
MICROSSATÉLITES Pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos, repetidas em tandem (em sequência) presentes no genoma eucarioto Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC Dinucleotídeos Trinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC Amplificadas por PCR Marcador Co-dominante Classe de marcador com maior grau de polimorfismo Requer conhecimento prévio da sequência
MICROSSATÉLITES Sinonímias SSR (Simple Sequence Repeats); STMS (Sequence Tagged Microsatellites); SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms); Onde são encontrados??? Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma) Plantas: (AT)n Mitocôndrias Cloroplastos
MICROSSATÉLITES: METODOLOGIA 1. Digestão DNA Enzimas de Restrição 2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor 3. Transformação da bactéria e seleção das colônias por hibridização (sondas marcadas com sequências repetidas) 4. Sequenciamento dos clones 5. Desenho dos primers
MICROSSATÉLITES Marcador Co-dominante M homozigoto heterozigoto Gel de poliacrilamida => Perceber diferenças de nucleotídeos
DETECÇÃO DE LOCUS SSR Simple Sequence Repeats = Microssatélites Homozigoto Heterozigoto Homozigoto CACACA GTGTGT CACACA GTGTGT (CA) 3 (CA) 3 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3
MICROSSATÉLITES cada ilha microssatélite constitui um locus, multialélico Cada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo locus
MICROSSATÉLITES Marcador multialélico Alelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus) Marcador Molecular com maior conteúdo de informação de polimorfismo
MICROSSATÉLITES Vantagens Reprodutibilidade Requer pequena quantidade de DNA Baixo custo Grande poder de resolução Alto nível polimorfismo útil para germoplasmas aparentados e de baixa variabilidade Desvantagens Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (primers aleatórios) Trabalhoso Porém: uma vez desenvolvido é fácil Caro
Distâncias e Dissimilaridades DISSIMILARIDADE utiliza dados binários para o cálculo, ou seja, marcadores dominantes. É o complemento da similaridade (Dis= 1- Sim), é um índice de divergência. DISTÂNCIA utiliza freqüências alélicas para seu cálculo, ou seja, marcadores codominantes. Utilizam-se de conceitos genéticos e/ou geométricos.
Medidas de Dissimilaridades Objetivo: representar o grau de divergência entre diferentes populações ou indivíduos. Os marcadores são interpretados como dados binários (1 e 0) presença ou ausência da banda. Principais índices: - Jaccard - Simple Matching (Coincidência simples) - Dice (Sorensen ou Nei-Li)
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Arquivo marcador dominante
Medidas de Dissimilaridades
Medidas de Dissimilaridades
Medidas de Dissimilaridades
Matriz de Similaridade
Distância genética de Nei
Calculando a distância
Arquivo marcador codominante
Distância Nei: Loco 1
Distância Nei: Locos 1, 2 e 3
Análise de Agrupamento Construção de dendrogramas;
Análise de Agrupamento UPGMA (Unweighted Pair Grouping Method with Aritimetical Means) entre populações e entre indivíduos/populações.
BIBLIOGRAFIA 1. Aluízio Borém e Eveline Teixeira Caixeta - Marcadores Moleculares Viçosa, MG, 2006 2. Fábio Gelape Faleiro - Marcadores Genético-Moleculares aplicados a programas de conservação e uso de recursos genéticos. EMBRAPA Cerrados, Planaltina, DF, 2007. 3.http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicosextras/marcadores-moleculares/