TERAPIA FOTODINÂMICA NA INATIVAÇÃO DE MICRORGANISMOS. REVISÃO DE LITERATURA. Costa AS¹, Leite PP¹, Pinto JG, Ferreira Strixino J² ¹Universidade do Vale do Paraíba, Faculdade de Ciências de Saúde, Curso de Biomedicina ²Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento UNIVAP Laboratório de Terapia Fotodinâmica Av. Shishima Hifumi 2911 Urbanova - 12244-000 São José dos Campos SP Brasil. uniaozeladoria@hotmail.com, patrícia.vlj@hotmail.com, juferreira@univap.br. Resumo - Apesar do progresso nos tratamentos de infecções, a crescente variedade de bactérias patogênicas resistentes a antibióticos é preocupante. Sendo assim, na área microbiológica, a TFD vem sendo aplicada de forma ampla no controle microbiológico, destacando-se como uma técnica promissora na inativação de microrganismos. O objetivo do presente estudo foi avaliar os principais parâmetros utilizados no controle microbiológico com TFD a partir de uma revisão de literatura. Para tal realizou-se um levantamento a partir de bancos de dados on line (PubMed, Scielo, Lilacs) entre os anos de 2008 e 2013. As palavras-chave empregadas foram Terapia fotodinâmica, bactéria, controle microbiológico nos idiomas: português e inglês. Com a revisão realizada foi verificado que a TFD tem demonstrado efetividade frente à inativação de diversos microrganismos, com o emprego de uma grande variedade nos parâmetros adotados na aplicação da técnica de TFD em microorganismos. Palavras chave: Terapia Fotodinâmica, bactéria, controle microbiológico. Área de Concentração: Biomedicina. Introdução A Terapia Fotodinâmica (TFD) foi descoberta por meio da observação da morte de microrganismos quando expostos à luz solar e ao ar, na presença de certos corantes. Essa interação propôs uma alternativa no tratamento de infecções locais contra fungos, bactérias e vírus. (CARVALHO, 2012). Diversos estudos foram publicados a respeito da TFD, desde o início do século XX, mas, somente no final de 1980, essa tecnologia foi aplicada efetivamente na área da saúde humana, inicialmente no tratamento de tumores malignos superficiais e, posteriormente no tratamento de infecções locais, fúngica e bacterianas (LONGO et al., 2010). A TFD oferece vantagens em relação ao uso de agentes antimicrobianos habituais, desencadeando morte celular rápida e improvável desenvolvimento de resistência por parte do microrganismo (TEGOS; HAMBLIN, 2006). O processo fotodinâmico se dá pela a ação da luz sobre o fotossensibilizador (FS) que irá ser excitado pela energia absorvida da fonte de luz, ocorrendo uma interação com o oxigênio presente na célula gerando espécies reativas de oxigênio. O FS excitado, por sua vez, interage com o oxigênio presente nas células transferindo sua energia e retornando ao seu estado fundamental. O oxigênio encontra-se no estado tripleto nas células, quando há interação com o FS esse é levado, então, a um estado mais elevado de excitação (estado singleto), gerando espécie reativa de oxigênio singleto. Assim, quando o oxigênio, em seu estado fundamental passa para o estado singleto resulta na destruição celular por gerar oxidação dos constituintes celulares. (RIBEIRO, et al., 2005). O FS é adotado de acordo com a sua farmacocinética tendo como objetivo favorecer a sua permanência nas células doentes por um maior período de tempo. Microrganismos como bactérias, fungos e vírus podem também ser mortos depois do tratamento com um FS próprio e uma fonte de luz específica, em um processo denominado inativação Fotodinâmica (IF) ou quimioterapia fotodinâmica antimicrobiana (QTFDA) (PERUSSI, 2007). Os corantes e FS como xantenos halogenados tais como Rosa Bengala (RB), fenotiazínicos tais como o azul de toluidina (AT) e o Azul de Metileno (AM), acridinas e conjugados de clorina (e6), têm sido estudados para a irradiação de microrganismos 1
(WAINWRINGHT, 2002). O Azul de Metileno (AM) é um corante catiônico da classe das fenotiazinas e sua absorção máxima se dá na região do vermelho do espectro em um comprimento de onda de 660 nm. Contra as bactérias Gram-positivas ele apresenta uma alta efetividade, porém nas bactérias Gramnegativas a sua efetividade é inferior. A carga positiva do AM promove uma ligação eletrostática na superfície da bactéria, causando um dano inicial na sua parede o que possibilita uma maior atividade fotodinâmica contra as bactérias (WAINWRINGHT, 1998). A fonte de luz laser é um dispositivo que foi desenvolvido na década de 60 e apresenta propriedades importantes, como elevada concentração de energia, à medida que a luz se propaga, apresentando pouca dispersão de energia, coerência, monocromaticidade e colimação (GENOVESE, 2000). O Diodo Emissor de Luz (Light emitting diode- LED) é um diodo semicondutor que absorve energia elétrica e a emite na forma de luz visível. Ele é considerado como uma fonte de luz contínua e tem uma alta eficiência, sendo os efeitos do LED e do Laser semelhantes (GENOVESE, 2000). A inativação fotodinâmica é eficiente na redução dos microrganismos apresentando-se como uma terapia alternativa confiável para o tratamento antimicrobiano convencional (PERUSSI, 2007). De acordo com Moura (2011) o tipo de microrganismo que será tratado com a aplicação da TFD deve ser levado em consideração, pois diferentes organismos respondem de forma desigual frente à aplicação da técnica. Diversos estudos têm descrito os benefícios da TFD visando à redução bacteriana (MOURA 2011). Porém, nos estudos analisados foram utilizadas diferentes metodologias o que proporcionou alguns resultados que não podem ser simplesmente comparados. A aplicação da TFD na maioria dos microrganismos relatados nos estudos presentes está relacionada principalmente na área odontológica e também na aplicação em infecções de feridas. Geralmente os parâmetros que foram empregados na técnica de TFD influenciaram diretamente na inativação dos microrganismos. O objetivo do presente estudo foi avaliar os principais parâmetros utilizados no controle microbiológico com TFD, sua aplicação e o estado da arte a partir de uma revisão de literatura. Metodologia A busca pelos artigos desta revisão foi realizada através de um levantamento a partir de bancos de dados on line (PubMed,Scielo,Lilacs). A pesquisa dos artigos foi iniciada em setembro de 2012 e finalizada em junho de 2013. As palavras-chave empregadas foram terapia fotodinâmica, bactéria, controle microbiológico nos idiomas: português e inglês. Primeiramente, a seleção foi feita a partir dos resumos e, posteriormente, os textos completos foram analisados. Foram levantados 72 artigos, dos quais foram selecionados 15 para serem utilizados na revisão do presente estudo. Os critérios de inclusão que foram usados na seleção do estudo foram: O período de tempo entre os anos de 2008 e 2013 e artigos que avaliassem diferentes parâmetros na aplicação da técnica de TFD na inativação de microrganismos, dessa forma realizou-se a tabulação dos dados com a finalidade de avaliar os principais parâmetros utilizados no controle microbiológico com TFD entre os anos estudados. Resultados Após a leitura dos resumos dos artigos e a avaliação dos critérios de Inclusão e exclusão, as buscas em cada tipo de pesquisa resultaram em 15 artigos selecionados por meio dos bancos de dados on Line PubMed,Scielo,Lilacs. (sete com aplicação de lasers, sete com aplicação de LED e um com aplicação de Luz branca endoscópica). Após a leitura completa dos artigos selecionados, os dados foram separados em tabelas onde evidenciamos alguns parâmetros como o microrganismo, fonte de luz, comprimento de onda, entre outros (Tabela 1). Dos estudos investigados observa-se que os parâmetros adotados apresentam uma grande variedade na aplicação da TFD para inativar microrganismo. 2
Tabela 1: Artigos pesquisados (2008-2013) e os principais parâmetros observados: Microrganismos, fonte de luz, comprimento de onda, potência, agente fotossensibilizador, modelo, dose de energia e o efeito da TFD. MO - Microrganismos. P Pseudomonas. S-Staphilococcus E-Escherichia. C- candida. H- Helicobacter. T- Trichophyton BP-Baixa Potência. NC- Não Consta. AF-Agente Fotossensibilizador. AM-Azul de Metileno. RB- Rosa Bengala. VM-Verde Malaquita. AT-Azul de Toluidina. PDZ- Photoditazine. DE-Dose de Energia TFD-Terapia Fotodinâmica. FS- Fotossensibilizador. 3
Vários estudos avaliaram a capacidade antimicrobiana da TFD utilizando laser ou LED contra diversos microrganismos e empregaram diversas metodologias. O uso do LED mostrou-se como uma fonte de luz muito eficaz capaz de inibir bactérias e fungos. A ação da fonte de luz mediada com o FS também é muito importante para que resultados satisfatórios sejam obtidos, uma vez que apenas a aplicação da luz laser ou LED ou do FS não promovem qualquer efeito inibitório ou capaz de inativar os microrganismos. Outro parâmetro muito importante que deve ser levado em consideração é a fluência de energia. Nos estudos investigados observamos que a aplicação de uma maior dose de energia promove maior efeito inibitório dos microrganismos, uma vez que quando em baixa dose de energia ocasiona apenas uma redução de microrganismo ou resultados menos satisfatórios quando comparados com a técnica da TFD utilizando maiores fluências de energia. O corante AM e o Azul de Toluidina (AT) foram os fotossensibilizadores mais utilizados e podem ser observados resultados semelhantes para ambos os corantes. Segundo Prates (2010), é proposto que a TFD pode matar as células microbianas, onde uma diversidade de agentes fotossensibilizadores e fontes de irradiação são atribuídas com parâmetros distintos e em concentrações diferentes do corante. Contudo, para que os processos fotodinâmicos sejam entendidos, são necessários um maior conhecimento sobre a importância tanto da taxa de fluência quanto do tempo de irradiação do laser. Discussão Rossoni (2009) avaliou os efeitos de diferentes corantes (Rosa bengala e eritrosina) associados com luz LED, assim como Costa (2010) e ambos afirmam que a TFD associada com o corante Rosa bengala apresenta uma maior atividade antimicrobiana em relação ao corante eritrosina. Moura (2011) aplicou a TFD sobre culturas de Enterococcus faecalis combinando com o uso de: AM, AT e o verde malaquita (VM) utilizando LED como fonte de luz. Os corantes AM e AT se apresentaram como FS altamente eficazes com potencial de aplicação em TFD. O AM tem demonstrado maior efeito bactericida comparado ao AT, atingindo uma redução de 98,9% em relação ao AT que reduziu 61,2% em um tempo de irradiação de 60s, porém o corante VM não obteve resultados satisfatórios comparado aos corantes AM e AT. Segundo Longo (2010), diversos estudos já demonstraram a efetividade da aplicação da TFD mediada pelo AM em diferentes linhagens de culturas bacterianas isoladas e as reações de fotossensibilização induzidas pelo AM são conhecidas por causar danos aos ácidos nucléicos, proteínas e lipídios. Vahabi (2011) em seu estudo teve como principal objetivo avaliar o efeito antimicrobiano do AM e do FS Radachlorin, em combinação com um laser de diodo na viabilidade de S. mutans e concluiu que a TFD mediada com o AM foi mais eficiente do que a TFD mediada com o FS Radachlorin. Miyabe (2011) avaliou o efeito da TFD utilizando o FS AM comprovando a sua eficácia na inativação de isolados clínicos dos microrganismos estudados. Zolfaghari (2009) fez um estudo paralelo (in vitro e in vivo) utilizando o AM e dose de energia de 360 J/cm² demonstrando que a TFD foi capaz de eliminar o microrganismo S. aureus proveniente de feridas. No entanto, o resultado in vivo foi menos eficaz do que quando realizado in vitro. Vários fatores interferiram no efeito bactericida reduzindo a sua eficácia in vivo incluindo a ligação do FS com o microrganismo, porém, os resultados obtidos foram considerados significativos por constituírem o primeiro relato de morte in vivo de S. aureus. Crescentes estudos in vivo vêm demonstrando que a TFD é um tratamento antimicrobiano eficaz e tais resultados obtidos in vitro podem ser reproduzidos em seres humanos, sendo a técnica um meio eficaz de prevenir a colonização de bactérias em feridas. Segundo Zolfaghari (2009) deve-se considerar que apenas uma única aplicação da TFD foi utilizada em seu estudo e maiores aplicações podem alcançar mortes do microrganismo através da aplicação repetida da técnica, por fracionamento da dose de luz administrada ou em combinação com outros agentes terapêuticos tais como antibióticos O estudo realizado por Carvalho (2013) demonstra o efeito do FS AM e do FS photoditazine (PDZ), comparando a eficácia destes fotossensibilizadores na inativação de microrganismos. O FS AM demonstrou maior eficácia quando comparado ao efeito do FS PDZ. A diferença da eficiência da TFD aplicada com o FS AM e PDZ estão relacionadas com a estrutura da parede celular e à sensibilidade de bactérias gram-negativas e gram-positivas ao FS. Dovigo (2010) investigou a atividade da TFD induzida por Photogem avaliando a suscetibilidade de diferentes espécies de Candida, a TFD apresentou efeito fungicida em suspensões 4
de fungos, sendo eficaz na inativação das espécies de candidas e na inviabilidade completa das suspensões de C. albicans, C. dubliniensis e C. tropicalis. Amorim (2012) estudou o efeito fungicida da TFD em T.rubrum mediada com AT irradiado com LED e concluiu que a TFD é uma técnica alternativa para inibior o microrganismo T. rubrum e um tratamento promissor para as doenças causadas por este fungo. Panhóca (2011) avaliou o efeito antimicrobiano da TFD mediada com os fotossensibilizadores curcumina e Photogem e demonstrou em seu estudo que o uso desses fotossensibilizadores reduziu a quantidade total do microrganismo. Na utilização do FS Photogem houve uma redução de 18% da quantidade de S. mutans e 15% de redução do crescimento de S. mutans foi observado quando se fez o uso do FS curcumina. Gubert (2008) estudou o efeito bactericida da TFD em pequenas doses de energia (2,4 e 6 J/cm²) mediada com o FS AM, após a irradiação observou-se que não houve qualquer halo de inibição e nem de crescimento, porém, também não teve aumento do crescimento bacteriano. Desta forma, Gubert (2008) concluiu que a TFD não produziu efeitos bactericidas, ressaltando que por ser um estudo in vitro, eventualmente produziu perdas de energia, além disso, doses relativamente baixas de densidade de energia interferiram no efeito bactericida e na inativação dos microrganismos, assim como a baixa concentração do fotossensibilizador utilizado. Choi (2010) estudou a atividade fotodinâmica do AM e luz branca endoscópica e confirmou que o efeito letal sobre microrganismos aumenta proporcionalmente à concentração de fotossensibilizador e a duração da irradiação. Prates (2010) em seu estudo afirma que a taxa de fluência e o tempo de irradiação, gera diferentes níveis de inativação nos microrganismos, além da taxa de fluência mostrar um aumento da inativação dos mesmos, mas o fotossensibilizador ou a irradiação separadamente não promovem morte celular. Mais estudos também são necessários para desenvolver fotossensibilizadores que são mais seletivos e não tóxicos no escuro que pode aumentar a eficácia e a seletividade da TFD na inativação de microorganismos. Conclusão Na presente revisão, pode-se concluir que o tempo de irradiação e a dose de energia são parâmetros importantes que interferem diretamente na eficiência da TFD. A TFD é uma técnica que vem demonstrando efetividade tanto in vitro como in vivo contra diversos microrganismos. Vários tipos de fotossensibilizadores estão sendo avaliados com diferentes composições e propriedades de absorção de luz. De acordo com os objetivos propostos foi possível avaliar os principais parâmetros utilizados na aplicação da técnica destacando-se o fotossensibilizador Azul de Metileno o corante mais utilizado nos artigos avaliados nesta revisão, apresentando resultados satisfatórios frente à inativação dos microrganismos comparados aos outros agentes fotossensibilizadores. A fonte de luz LED tem demonstrado resultado eficaz tanto quanto a utilização da fonte de luz laser, quanto à fonte de luz Laser/ LED e o fotossensibilizador aplicados de forma isolada não exerce nenhuma atividade inibidora do crescimento bacteriano. Nos estudos avaliados 46,6% utilizaram como fonte de luz o laser, já a aplicação do LED foi utilizada em 46,6% dos artigos avaliados. A revisão da literatura nos mostra que esse efeito antimicrobiano vem sendo atingido por sucessivos autores, com diversos trabalhos demonstrando a eficácia da TFD em inativar microrganismos. O uso da TFD vem sendo muito explorado na literatura. No entanto, embora esses dados sejam altamente promissores, outros estudos devem ser desenvolvidos, pois uma das limitações dessa técnica é a ausência de parâmetros definidos para que a TFD seja efetiva na eliminação completa de microrganismos. Referências - AMORIM, F.C.J, et al. Phototoxic action of light emitting diode in the in vitro viability of Trichophyton rubrum, An Bras Dermatol., v. 87(2): p.250-5, 2012. - CARVALHO, D.P.L. Estudo da Terapia Fotodinâmica, no controle, de microrganismos isolados de feridas infectadas Estudo In Vitro. 2012. 65 p. 1 Disco Laser Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade Vale do Paraíba, São José dos Campos, 2012. - CARVALHO D.P.L, et al. Study of photodynamic therapy in the control of isolated microorganisms from infected wounds an in vitro study. Lasers in medical Science., v.28(2): 2013. - COSTA, A.C.B. P, et al. Susceptibility of planktonic cultures of Streptococcus mutans to photodynamic therapy with a light-emitting diode. Braz Oral Res. Oct-Dec., v. 24(4): p.413-8, 2010. 5
- CHOI S.S et al., In vitro photodynamic antimicrobial activity of methylene blue and endoscopic white light against Helicobacter pylori 26695. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology., v.101,p.206-209, 2010. - DOVIGO.N, et al., Photodynamic Inactivatio of for Candida Species Induced by Photogem. Brazilian Journal of Microbiology., v.41, p.42-49, 2010. -GENOVESE, W.J. Laser de baixa intensidade: aplicações terapêuticas em odontologia. SãoPaulo: Lovise, 2000, 175 p. 26695. Journal of Photochemistry and Photobiologi B: Biology.,v.101,p.206-209, 2010. - GUBERT, B.R et al., Efeitos da terapia fotodinâmica e de uma única aplicação de laser de baixa potência em bactérias in vitro.fisioterapia e Pesquisa, 2008. - LONGO, F.P.J, et al. Efeito da terapia fotodinâmica mediada pelo azul de metileno sobre bactérias cariogênicas. Rev. Clín. Pesq. Odontol., Curitiba.set./dez., v. 6 (3):p.249-257, set./dez. 2010. - MOURA S.C.R. Comparação do Potencial Fotodinâmico de três fotossensibilizadores associados a uma lâmpada de LEDs sobre culturas de Enterococcus faecalis. 2011 58p. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Tecnólogo em processos ambientais) Departamento Acadêmico de Química e Biologia (DAQBI) do Câmpus Curitiba da Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR, 2011. - MIYABE, M, et al. Effect of photodynamic therapy on clinical isolates of sthapylococcus spp. Bras oral Res., v. 25 (3): p.230-4, may./jun. 2011. - PANHÓCA V.H. Avaliação In Vitro da atividade Antimicrobiana da Terapia Fotodinâmica sobre Streptococcus mutans em Biofilme Dental In Situ. 2011.74p. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), 2011. - PERUSSI, J.R. Inativação fotodinâmica de microrganismos. Quim. Nova., v.30(4):p.988-994, 2007. - PRATES R.A et al. Parâmetros de irradiação influenciam na inativação de leveduras tratadas com terapia fotodinâmica, Revista Brasileira de Física Médica., v.4(1):p.53-7,2010. - RIBEIRO, J.N et al. Terapia Fotodinâmica: Uma luz na luta contra o Câncer. Physicae, v.5(2): p.5, 2005. - ROSSONI, D.R et al. Photoinactivation of Escherichia coli using xanthene dyes and lightemitting diodes, Braz Dent Sci. out./dez., v.12(4):p.6-11, 2009. - SILVA, E.J.N.L et al. Efecto antimicrobiano de la terapia fotodinámica sobre Enterococcus faecalis, estudio in vitro. Rev Estomatol Herediana., v.21(4) : p.185-189, 2011. -TEGOS G.P, HAMBLIM M.R. Phenothiazinium Antimicrobial Photosensitizers Are Substrates of Bacterial Multidrug Resistance Pumps. Amtimicrobial Agents and Chemotherapy., p.196-203, Jan. 2006. - VAHABI, S, et al. The Effect of Antimicrobial Photodynamic Therapy with Radachlorin and Toluidine Blue on Streptococcus Mutans: An in Vitro Study. Journal of Dentistry, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran., v.8(2), 2011. -ZOLFAGHARI, P.S, et al. In vivo killing of Staphylococcus aureus using a light-activated antimicrobial agent. BMC Microbiology., v.9(27), 2009. -WAINWRIGHT, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT).J. AntimicrobChemother., v. 42, p.13-28, 1998. -WAINWRIGHT, M. The emerging chemistry of blood product disinfection.chem. Soc.Rev., v. 31, p.128-136, 2002. 6