UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMETO GISLENE RODRIGUES DA SILVA

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1 UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMETO GISLENE RODRIGUES DA SILVA AVALIAÇÃO DE CEPAS CLÍNICAS E ATCC DE Staphylococcus aureus e Escherichia coli SUBMETIDOS À TERAPIA FOTODINÂMICA com CLORINA ESTUDO in vitro São José dos Campos, SP 2016

2 GISLENE RODRIGUES DA SILVA AVALIAÇÃO DE CEPAS CLÍNICAS E ATCC DE Staphylococcus aureus e Escherichia coli SUBMETIDOS À TERAPIA FOTODINÂMICA com CLORINA ESTUDO in vitro Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. Orientadora: Profa. Dra Juliana Ferreira Strixino Co-orientador: Prof. Dr. Leandro José Raniero São José dos Campos, SP 2016

3 Ficha catalográfica

4 Banca

5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Professora Dra Juliana Ferreira Strixino, por aceitar me orientar em nesta etapa da minha vida acadêmica e ter feito isso maravilhosamente. Agradeço a paciência, dedicação, incentivo para ter iniciado e chegado até o fim, pois desde o início sempre falei que não sabia o porquê estava fazendo o Mestrado e mesmo assim não desistiu de mim. Agradeço a Deus por ter me dado a vida e pessoas como estas que torcem por mim e que cada um deixou um pedacinho de si em mim, me ensinando um pouco da vida e também do projeto. Obrigado por ter me dado o prazer de ter chegado até aqui e estar realizando coisas que jamais achei que fosse capaz de realizar. Aos meus pais, Edna e Pedro e meus irmãos, Everton, Washington, Jéssica e Daiane, que me dão muito amor, que me apoiaram, nunca desistiram e confiarem sempre em mim. Ao meu marido, Alexandre, por ter me dado força para que não desistisse e continuasse até o fim do curso, que apesar de ter me dividido com os trabalhos e aulas estava sempre com os braços abertos para me ouvir e me ajudar da forma que ele pudesse. Muito obrigado meu amor pela compreensão e carinho. Te amo muito. Aos meus amigos Leticia, André, João, Pablo e Daniele por todo o carinho, amizade e ajuda durante o projeto. Em especial quero agradecer a Juliana Guerra por ter me dado força mental, psicológica e física, porque sem ela acho que teria desistido. Muito obrigada por ser amiga, parceira e irmã, adorei ter te conhecido. Aos professores do curso pelos ensinamentos e paciência. A todos os funcionários da UNIVAP pela dedicação e comprometimentos. A Capes pela bolsa taxa, pois sem a qual não conseguiria iniciar e concluir este projeto. A Profª Drª Sandra por ter me cedido uma bolsa para finalizar meu mestrado.

6 Que a cada amanhecer tenhamos a humildade de agradecer tudo que possuímos. Reflitam... Um lar, uma família, um corpo saudável, uma mente imperfeita, um trabalho, um prato de comida. Que a cada entardecer eu consiga vislumbrar alguma luz, um pouco de serenidade, maturidade e paciência. Que a cada anoitecer eu tenha a sinceridade de reconhecer cada passo em falso, cada palavra mal colocada, cada desculpa entalada na garganta, cada pequena solidão sentida. Que a cada dia eu me mantenha firme, não desvie do caminho escolhido, não esqueça meus propósitos, não desista dos meus sonhos. Que a cada segundo eu consiga pensar, falar e sentir coisas boas. E que consiga ajudar quem passa pela minha vida. Que assim seja. Sempre. (Clarissa Corrêa)

7 RESUMO O uso indiscriminado de antibióticos no tratamento de infecções bacterianas gerou uma resposta adaptativa dos microrganismos frente ao contato frequente com tais substâncias. A terapia fotodinâmica (TFD) surge como alternativa promissora no combate a microrganismos causadores de infecções. Consiste na associação de uma substância fotossensibilizadora, uma fonte de luz em comprimento adequado ao FS e oxigênio molecular. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da TFD na viabilidade celular de bactérias S. aureus e E. coli de cepas clínicas, utilizando o Photodithazine (PDZ) como fotossensibilizador (FS). O PDZ foi adicionado aos respectivos grupos a um volume de 200 µl nas concentrações de 0.3 mg/ml, 0.6 mg/ml, 1.0 mg/ml e incubados por 15 minutos e 24 horas. Após o período de incubação foram transferidos para uma placa de 96 poços e irradiados, os grupos que não foram irradiados foram processados da mesma maneira, exceto para a irradiação. A avaliação do crescimento bacteriano foi realizada por meio da leitura de absorbância, utilizando o comprimento de onda de 490 nm para leitura. Para avaliar a internalização do PDZ as cepas foram incubadas com 125 µg/ml de PDZ em meio BHI, a 37 C durante 15 minutos e 24 horas após a incubação, o PDZ foi removido, e as bactérias foram fixadas com paraformaldeído a 4%, as imagens foram feitas utilizando microscópio confocal. A internalização do PDZ na cepa S. aureus após 15 minutos mostrou que a maioria das bactérias internaliza o PDZ e após 24 horas de incubação a cepa apresentou o PDZ em seu interior. Avaliando a porcentagem da absorbância incubada por 15 minutos não foi possível reduzir ou inibir o crescimento bacteriano das cepas clínica e ATCC de S. aureus, já no tempo de 24 horas apresentou uma redução geral nos grupos com a TFD com PDZ. A cepa E.coli incubado com PDZ durante 15 minutos, observou se que a internalização do FS não é homogênea e no tempo de 24 horas a cepa internalizou e manteve o PDZ nas bactérias. A porcentagem de crescimento de E.coli incubado por 15 minutos com PDZ apresentou-se citotóxico em todos os grupos e no tempo de 24 horas também apresentou - se citotóxico, mas na fluência de 50 J/cm 2 os grupos submetidos a TFD com 1,0 mg/ml de PDZ obtiveram crescimentos em relação aos grupos controles para as cepas ATCC e clínica de E.coli. Correlacionando os resultados podemos sugerir que as bactérias que não internalizaram o FS não foram alvo da TFD, favorecendo o crescimento das mesmas. A TFD utilizando o PDZ apresenta-se como uma alternativa eficaz na inativação S.aureus, quando utilizado tempo de incubação adequado, vindo a ser uma interessante alternativa para o futuro desenvolvimento de tratamentos para infecções localizadas causadas por essa espécie de microrganismos. Palavras-chave: Terapia fotodinâmica. Staphylococcus aureus. Escherichia coli. Photodithazine

8 Evaluation of clinical and ATCC Strains of Staphylococcus aureus and Escherichia coli subjected to Photodynamic therapy with Chlorine: in vitro ABSTRACT The treatment of bacterial infections has been a major challenge after the end of the era of the antibiotics. The indiscriminate use of the antibiotics to treat bacterial infections triggered a adaptive response from the microorganisms due to the recurrent contact with these drugs. The photodynamic therapy (PDT) is a promising alternative to treat the infections caused by microorganisms. This therapy consists in the association of a photosensitizer, a light source, in appropriated wavelength and molecular oxygen. This study aimed to evaluate the effect of the PDT in viability of bacteria strains of Staphylococcus aureus and Escherichia coli using Photodithazine (PDZ) as photosensitizer (PS). PDZ was added to the respective groups to a volume of 200 µl in concentrations of 0.3 mg / ml, 0.6 mg / ml, 1.0 mg / ml and incubated for 15 minutes and 24 hours. After the incubation period were transferred to a 96 well plate and irradiated, the groups that were not irradiated were processed in the same way except for the irradiation. The evaluation of the bacterial growth was performed by absorbance reading, using the wavelength of 490 nm for reading. To evaluate the internalization of PDZ both strains were incubated with 125 µg/ml PDZ in BHI medium at 37 C for 15 minutes and 24 hours after incubation, PDZ was removed, and the bacteria were fixed with paraformaldehyde 4 % and the images were made using confocal microscopy. The PDZ internalization by the S. aureus strain after 15 minutes showed that most bacteria internalized PDZ and after 24 hours of incubation the strain still presented the PDZ inside. Evaluating the percentage of absorbance after 15 minutes of incubation it was not possible to reduce or inhibit bacterial growth in clinical and ATCC strains of S. aureus, however the time of 24 hours had an overall reduction in the groups of PDT with PDZ. In the E.coli strain incubated for 15 minutes with PDZ was noted that the internalization of FS not homogeneous and 24 hours after incubation the PDZ internalized still is retained in bacteria. The E.coli incubated for 15 minutes with PDZ presented cytotoxicity in all groups. The same was observed in 24 hours. However, in the fluence of 50 J / cm² the groups subjected to PDT with 1,0 mg/ml of PDZ presented growth compared to control groups for ATCC strains and clinical E.coli. Correlating the results we suggest that the fact that the bacteria do not internalize the FS and therefore were not subject PDT favoring their growth. PDT using PDZ presents itself as an effective alternative to inactivate S. aureus, as used suitable incubation time, been an attractive alternative for the future development of treatments for localized infections caused by this type of microorganisms. Keywords: Photodynammic therapy. S.aureus. E. coli. Photodithazine.

9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Diagrama de Jablonski simplificado Figura 2- Estrutura Química do Photodithazine Figura 3 Provas bioquímicas para identificação dos microrganismos Figura 4 - Microscopia confocal demonstrando a internalização do PDZ após 15 minutos de interação à 37 C. (A) Observação da lâmina em campo claro. (B) Observação da fluorescência emitida pelo PDZ Figura 5 - Microscopia confocal demonstrando a internalização do PDZ após 24 horas de interação à 37 C. (A) Observação da lâmina em campo claro. (B) Observação da fluorescência emitida pelo PDZ Figura 6 Avaliação da porcentagem de crescimento Staphylococcus aureus com concentrações diferentes de PDZ em 15 min de incubação (º,*,#, p<0,01) Figura 7 Avaliação da porcentagem de crescimento de Staphylococcus aureus com concentrações diferentes de PDZ em 24 horas de incubação (º,*,#,,, + p<0,01) Figura 8 - Microscopia confocal demonstrando a internalização do PDZ após 15 minutos de interação à 37 C. (A) Observação da lâmina em campo claro. (B) Observação da fluorescência emitida pelo PDZ Figura 9 - Microscopia confocal demonstrando a internalização do PDZ após 24 horas de interação à 37 C. (A) Observação da lâmina em campo claro. (B) Observação da fluorescência emitida pelo PDZ Figura 10 - Avaliação da porcentagem de crescimento Escherichia coli com concentrações diferentes de PDZ em 15 minutos de incubação (º p<0,01) Figura 11 - Avaliação da porcentagem de crescimento Escherichia coli com concentrações diferentes de PDZ em 24 horas de incubação (*p<0,05) (,º,, + p<0,01)... 38

10 LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS ALA Ácido 5-aminolevulinico AM Azul de metileno AT Azul de toluidina ATCC - (American Type Culture Colletion) Coleção de cultura americana BHI (Brain heart infusion) Infusão de cérebro coração cm centímetro DLI (Drug Light Interval) Intervalo droga-luz ERO Espécie reativa de oxigênio E.coli Escherichia coli FS Fotossensibilizador HpD Hematoporfirina ITU Infecção do trato urinário J Joule LPS Lipopolissacarideo LED (Ligt emitting diode) Diodos emissores de luz ml - mililitro mg miligrama mw megawatt nm nanômetro OMS Organização Mundial da Saúde PDZ Photoditazine PpIX Photoporfirina IX RPM rotações por minuto S. aureus Staphylococcus aureus TFD Terapia Fotodinâmica UFC Unidade Formadora de Colônias

11 Sumário 1 INTRODUÇÃO OBJETIVO Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO DE LITERATURA Bactérias Escherichia coli Staphylococcus aureus Infecções e tratamentos convencionais Terapia Fotodinâmica Fotossensibilizadores Fontes de Luz Aplicação da TFD METODOLOGIA Amostras Preparo das bactérias para os ensaios Protocolo de TFD com PDZ e incubação de 15 minutos Protocolo de TFD com PDZ e incubação de 24 horas Avaliação por absorbância Internalização de PDZ Análises estatísticas RESULTADOS Internalização do PDZ em cepas Staphylococcus aureus Terapia Fotodinâmica aplicada a Staphylococcus aureus Incubação de 15 minutos Incubação de 24 horas Internalização do PDZ em cepas Escherichia coli Terapia Fotodinâmica aplicada a Escherichia coli Incubação de 15 minutos Incubação de 24 horas DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 45

12 10 1 INTRODUÇÃO O uso indiscriminado de antibióticos no tratamento de infecções bacterianas gerou uma resposta adaptativa dos microrganismos frente ao contato frequente com tais substâncias. (BANFI et. al., 2006; DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009; FERRAZ et. al., 2011) As bactérias são responsáveis por várias doenças infecciosas, desta forma, o crescente número de bactérias que estão apresentando resistência aos tratamentos convencionais, surge à necessidade do desenvolvimento de terapias alternativas a fim de minimizar, ou até mesmo dispensar o uso de antibióticos (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2006; DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009). O World Economic Forum reportou recentemente, que a resistência bacteriana está entre as três principais ameaças à saúde humana, sendo de interesse primordial ações de prevenção e proteção contra cepas multi-resistentes, além de amplamente necessário o desenvolvimento de novas terapias que reduzam ou dispensem o uso de antibióticos (BUSH et. al., 2011; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2014; ARIAS; MURRAY, 2015; BLAIR et. al., 2015). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a resistência bacteriana a medicamentos deveria ser vista há tempos como um problema de saúde pública, principalmente no âmbito hospitalar, já que é uma prática não muito recente. Estudos para melhor compreensão das infecções, concentrando suas ações em medidas de controle e de diagnósticos precisos com a finalidade do uso racional de antimicrobianos seria a melhor maneira para diminuir a resistência bacteriana (KADOSAKI; SOUSA; BORGES, 2012). O aumento da resistência a antibióticos vem trazendo muita dificuldade para o combate e controle das infecções localizadas podendo tornar uma infecção generalizadas se não obtiver um tratamento rápido e adequado (NASCIMENTO; NAMBA, 2009). A terapia fotodinâmica (TFD) surge como alternativa promissora no combate a microrganismos causadores de infecções. Feridas colonizadas por bactérias como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli, por exemplo, tendem a se tornar complicadores na recuperação dos pacientes e tais micro-

13 11 organismos já se mostraram sensíveis ao tratamento com a TFD (JORI et. al., 2006; MAISCH, 2007; ROLIM et. al., 2012; CARVALHO et. al., 2014). A Terapia Fotodinâmica (TFD) consiste na associação de uma substância fotossensibilizadora, uma fonte de luz em comprimento adequado ao FS e oxigênio molecular (YAMADA JÚNIOR, 2007; DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009; GUPTA et. al., 2013). O fotossensibilizador (FS) é ativado pela luz em um comprimento de onda visível específico, atingindo um estado excitado, onde poderá transferir a energia adquirida para o oxigênio molecular, gerando espécies reativas de oxigênio (ERO). (DEMIDOVA et. al., 2005; PASZKO et. al, 2011; ROLIM et. al., 2012). A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido estudada nas últimas décadas como uma modalidade de tratamento alternativo para várias doenças, como o câncer, doenças oculares e dermatológicas (feridas e queimaduras) (PASZKO et. al., 2011; ROLIM et. al., 2012). Na área microbiológica, a TFD apresenta vantagens como a erradicação ou inativação de patógenos na forma planctônica e na forma de biofilmes, evitando o desenvolvimento de resistência e diminuindo os fatores de virulência. A desvantagem é a cessação do efeito antimicrobiano quando a luz é desligada (DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009). A inativação de bactérias por meio da TFD é baseada no acumulo de um FS ou a passagem deste através da membrana citoplasmática de forma significativa, induzindo a danos irreversíveis às bactérias após irradiação (ROLIM et. al., 2012). Uma variedade de FS demonstraram eficiência na fotoinativação de bactérias Gram-positivas, enquanto que bactérias Gram-negativas são geralmente mais resistentes. Essa resistência tem sido atribuída à membrana externa organizada, presente nas bactérias Gram negativas, dificultando a interação dos FS com a membrana citoplasmática (DEMIDOVA et. al., 2005; SPESIA et. al., 2009). A TFD é um tratamento local e seletivo, com poucos efeitos pós-tratamento e não apresenta efeito acumulativo, além de não induzir à resistência bacteriana, como ocorre com a antibiótico-terapia. A desvantagem é baixa eficiência dependo do FS utilizado e a falta de protocolos de irradiação. (DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009). Estudos clínicos (ASHKENAZI et. al., 2003; DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009; RAI; NATARAJAN, 2013; JEON et. al., 2015) de TFD para tratamento de lesões papilomatosas e para a acne fazem referência ao efeito antimicrobiano da terapia,

14 12 mas não está claro ainda o quão importante é esse efeito antimicrobiano para o resultado terapêutico global.

15 13 2 OBJETIVO 2.1 Objetivo geral O trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da TFD na viabilidade celular de bactérias S. aureus e E. coli de cepas clínicas, utilizando o Photodithazine (PDZ) como fotossensibilizador. 2.2 Objetivos específicos Avaliar a internalização do PDZ em cepas bacterianas clínicas e ATCC S. aureus e E. coli, em 15 min e 24h de incubação com microscopia confocal; Avaliar, in vitro, a turbidez do meio, após TFD, com 15 min e 24h de incubação, por meio da espectrofotometria, em cepas bacterianas clínicas e ATCC S. aureus e E. coli; Avaliar o comportamento, in vitro, entre cepas bacterianas clínicas e ATCC S. aureus e E. coli;

16 14 3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1 Bactérias As bactérias são células procariontes, unicelulares, envoltas por membrana plasmática, não apresentam citoesqueleto e sua forma é mantida pela parede extracelular que tem como função a proteção da bactéria (MURRAY; ROSENTAHL; PFALLER, 2006). As bactérias podem ser divididas, segundo sua morfologia, em: cocos, bacilos e espirais, sendo que os cocos apresentam formato esférico, os bacilos são alongados e as espirais possuem uma ou mais curvaturas. Além do aspecto morfológico, as bactérias também são classificadas quanto às características de suas paredes celulares em Gram positivas ou Gram negativas de acordo com a coloração de Gram (KIERSZENBAUM, 2012). A aplicação da coloração de Gram faz com que as bactérias se corem de roxas, quando Gram positivas ou vermelho, quando Gram Negativas, devido ao fato de as bactérias Gram-positivas apresentarem uma espessa camada de peptideoglicano, e das Gram-negativas apresentarem uma fina camada de peptideoglicano combinada a uma membrana celular externa. (BARBOZA; TORRES, 2005). A estrutura responsável pela diferenciação da coloração de Gram é a parede celular. Nas bactérias Gram-negativas a parede celular é constituída por múltiplas camadas complexas, contendo uma camada de peptidioglicano e três outros componentes que a envolvem externamente; lipoproteína, membrana externa e lipopolissacarídeo (DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009; KHARKWAL et al.,2011). Essas estruturas não retêm o corante quando submetidas aos solventes nos quais o primeiro corante da bateria é solúvel. Quando o descorante é aplicado, o primeiro corante sai e quando acrescentado o segundo corante, as bactérias adquirem a nova coloração (TORTORA, 2012). Nas bactérias Gram-positivas a parede celular consiste em muitas camadas de peptideoglicano, formando uma estrutura espessa e rígida que retém o primeiro

17 15 corante aplicado, não adquirindo a coloração do segundo corante (TORTORA, 2012; KIERSZENBAUM, 2012) Escherichia coli É uma bactéria da família Enterobacteriaceae, cujo seu habitat normal é o trato intestinal de humanos e animais, tem a forma de bacilo curto, Gram negativa, não esporulado, móvel por flagelos perítricos ou não moveis (ESPARIS et. al., 2006; WIEST et. al., 2009; PEREPELOV, et. al.; 2015). Possui metabolismo respiratório e fermentador, por isso caracterizado com anaeróbico facultativo. São capazes de fermentar a glicose e a lactose com produção de ácidos e gases, e metabolizar substâncias como carboidratos, proteínas e aminoácidos, lipídios e ácidos orgânicos (TRABULSI et al., 2004; SINA et al, 2015) Estruturalmente a E. coli é composta por uma membrana citoplasmática, espaço periplásmico, peptídoglicano e membrana externa composta por Lipopolissacarideo (LPS), porinas e diferentes tipos de fimbrias. As estruturas de superfície são de acordo com os antígenos: O (somático), K (capsular) e H (flagelares). O antígeno O é determinado por carboidratos na cadeia do LPS, antígeno K são polissacarídeos, antígeno H são proteínas presentes nos flagelos (VIEIRA NETO, 2003). Condireado o mais comum patógeno causador de diarreias, septicemia neonatal, infecções do trato urinário (ITU) e bacteremia. É responsável por 80% das ITU e 30 % das infecções nasocomias (ESPARIS et al., 2006; NAGARJUNA et. al., 2015) Staphylococcus aureus É uma bactéria do grupo Micrococaccae, presente em diversas partes do corpo humano como fossas nasais, garganta, intestinos e pele, tem forma de cocos, apresentam se com formato de cachos, medindo entre 0,5-1,5 μm de diâmetro, é

18 16 Gram positiva, imóveis, não esporulados e não encapsulado (CORDEIRO, 2011; PINTO, 2013). São aeróbios ou anaeróbios facultativos, quimiorganotróficos com metabolismo respiratório e fermentativo (CORDEIRO, 2011; CRUVIEL; SILVEIRA; SOARES, 2011). Estruturalmente é composta por uma membrana citoplasmática, parede celular que contem 90 % de peptidioglicano, proteínas e ácidos teicóico. Os ácidos teicóicos são divididos em dois tipos: ácidos teicóicos de parede ligados ao peptídeoglicano e ácidos lipoteicóicos (TRABULSI et al., 2004.). S. aureus é responsável por diversas infecções como: espinhas, furúnculos e celulites ou infecções graves como: endocardites, pneumonia, septicemia, meningite, choque séptico (PACHECO, 2008; FERRER et al, 2013). 3.2 Infecções e tratamentos convencionais O crescimento anormal de microrganismos em uma ferida caracteriza o processo de infecção, problema que aflige pacientes hospitalizados, acamados, que apresentam escaras e outros tipos de feridas (CÂNDIDO, 2001; CAVALCANTI, 2005; IRION, 2005; JORGE; DANTAS, 2003). O tratamento convencional consiste na identificação do microrganismo infectante, e utilização de agentes antimicrobianos associado a remoção do tecido necrosado e do exsudado da ferida (CUNHA, 2010; MALAGUTTI; KAKIHARA, 2010). O tratamento com antibióticos trouxe um novo problema, a seleção de microrganismos resistentes à esses farmacos. O número de bactérias patogênicas resistentes à antibioticoterapia tem aumentado drasticamente nos últimos anos, e grande parte desse comportamento é devido ao uso indiscriminado dessas drogas. (AKOVA et. al., 2015). Esse comportamento resistente é observado tanto em bactérias Grampositivas como Gram-negativas, tornando esse, um problema de saúde pública mundial, devido à morbidade e mortalidade além do alto custo de manutenção de pacientes para controle dessas infecções. Dentre as causadoras de infecção,

19 17 destacam-se espécies como Klebisiela sp., Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. (FEDORENKO, 2015). Os antibióticos usualmente utilizados para o tratamento das infecções bacterianas apresentam algumas limitações, visto que determinados medicamentos agem em apenas algumas espécies de bactérias e, além disso, com o passar dos anos, algumas cepas tornaram-se resistentes a ação dos antibióticos, gerando um novo grande desafio. O World Economic Forum reportou recentemente que a resistência bacteriana está entre as três principais ameaças à saúde humana, sendo de interesse primordial ações de prevenção e proteção contra cepas multiresistentes além de amplamente necessário o desenvolvimento de novas terapias que reduzam ou dispensem o uso de antibióticos (BUSH, 2011; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2014; ARIAS; MURRAY, 2015; BLAIR, et. al., 2015). Segundo a Leung e colaboradores (2011), o número de bactérias resistentes aos antibióticos vem aumentando a cada ano e pesquisas contra a resistência de antibióticos e o desenvolvimento de novas técnicas para o tratamento devem ser desenvolvidas para o controle das bactérias. O uso indiscriminado de antibióticos e a falta de controle de venda dessas drogas é um dos principais fatores que contribuem para o aumento de cepas resistentes. O uso intenso de antibióticos na medicina, na produção de alimentos para animais causa um aumento na resistência a essas drogas (SANTOS, 2004). Dias e colaboradores (2010), realizaram pesquisa com médicos em 2007 sobre a conduta deles em infecções comuns e foi observado que teve discordâncias nas prescrições e que existem classes de antibióticos preferidas pelos médicos, comprovando a dificuldade na padronização de tratamentos em quadros de infecção. Novos tratamentos para controle de microrganismos surgem devido à necessidade de evitar a seleção de cepas resistentes, e a Terapia Fotodinâmica é um deles.

20 Terapia Fotodinâmica Os egípcios, há 4000 anos, já conheciam o efeito da luz solar sobre plantas que continham psoralenos no tratamento de algumas doenças, mas somente em 1900 Raab realizou os primeiros estudos com a Terapia Fotodinâmica (TFD), descrevendo a ação do corante acridina e luz solar sobre Paramecium (SIMPLICIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002; YAMADA JÚNIOR, 2007). Em 1903 Hermann von Tappeiner orientador de Oscar Raab, realizou tratamento de câncer de pele com aplicação tópica do corante de eosina e exposição a luz, dando início aos primeiros estudos de câncer com a TFD (YAMADA JÚNIOR, 2007; WEBBER, 2009; ISSA; MANELA-AZULAY, 2010), entretanto, somente em 1904 o termo ação fotodinâmica foi citado por Tappeiner (WEBBER, 2009). Em 1913, Meyer-Betz realizou um experimento em si mesmo onde injetou 200mg do que ele pensava ser hematoporfirina pura, não sentindo nenhum efeito imediato, somente após se expor a luz observou sensibilidade à mesma, permanecendo fotossensível por longo período (SIMPLICIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002; YAMADA JÚNIOR, 2007). A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um tratamento que associa uma substância fotossensibilizadora, uma fonte de luz de comprimento de onda específico, adequado ao espectro de absorção do fotossensibilizador (FS) e oxigênio molecular (YAMADA JÚNIOR, 2007; DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009; GUPTA et. al., 2013). O resultado dessa interação é a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), que induzem o processo de morte celular (RIORDAN; AKILOV; HASAN, 2005; YAMADA JÚNIOR, 2007; PASZKO et. al., 2011). As EROs podem ser produzidas por dois mecanismos, classificados em reação do tipo I, na qual ocorre transferência de elétrons para o oxigênio, podendo produzir superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxila e reação de tipo II onde ocorre a transferência de energia para o oxigênio resultando na formação de oxigênio singleto ( 1 O 2 ) (Figura 1). Ambos dependem de vários parâmetros, tais como o FS utilizado e a concentração de oxigênio disponível no local de tratamento (DEMIDOVA et. al., 2005; PASZKO et. al., 2011; ROLIM et. al., 2012). Os fotossensibilizadores são moléculas heterocíclicas grandes, que absorvem luz. Quando estas moléculas são irradiadas com luz visível, um elétron é excitado do estado fundamental para o estado singleto. Este elétron pode retornar ao estado

21 19 fundamental emitindo fluorescência ou passar para o estado tripleto, de menor energia, por meio de cruzamento intersistema (BRAULT, 1990; COLUSSI; NICOLA; NICOLA, 1996). Como o tempo de vida do estado tripleto é relativamente longo (10-3 a 10 segundos) (HENDERSON; DOUGHERTY, 1992) o fotossensibilizador excitado pode interagir com moléculas vizinhas. Esta interação pode ocorrer por dois mecanismos principais: I. mecanismo tipo I ou via formação de radical: o fotossensibilizador no estado excitado pode agir abstraindo um átomo de hidrogênio de uma molécula de substrato ou transferindo elétrons. Os radicais assim formados podem reagir com oxigênio, dando origem a uma variedade de produtos oxidados de alta energia (O 2.-, H 2 O 2 ou OH - ) que provocam lesões celulares e a subseqüente morte da célula. II. mecanismo tipo II ou via formação de oxigênio singleto: o fotossensibilizador no estado tripleto transfere energia ao oxigênio molecular no estado fundamental (tripleto), produzindo oxigênio singleto. O oxigênio singleto é uma forma reativa de oxigênio e é considerado o principal mediador do dano fotoquímico causado à célula por muitos fotossensibilizadores. O oxigênio singleto pode se difundir a uma pequena distância antes de ser desativado e voltar ao estado fundamental ou então sofrer várias reações com substratos biológicos, tais como, oxidação e ciclo adição, que são bastante destrutivas aos processos biológicos (PROFIO; DORION, 1987). Os mecanismos podem ocorrer simultaneamente e a razão entre elas é influenciada pelas características do FS, substratos intracelulares e concentração de oxigênio do meio. Fatores como presença do oxigênio e a eficiência de transferência de energia da luz absorvida pelo FS para o oxigênio tripleto (rendimento quântico) formando o oxigênio singleto, são importantes para a ação da TFD.

22 20 Figura 1 - Diagrama de Jablonski simplificado Fonte: Oliveira et. al., 2015 O oxigênio singleto é uma das várias EROs que podem induzir processos antioxidantes, deteriorar tecidos biológicos, danificar os componentes celulares essenciais, como a membrana citoplasmática, ou alterar irreversivelmente atividades metabólicas, resultando na morte celular (DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009; GUPTA et. al., 2013). DENG e colaboradores (2015) avaliaram o efeito bactericida em Vibrio parahaemolyticus utilizando a TFD com azul de metileno (AM). A TFD com AM foi eficaz no controle ou redução do Vibrio parahaemolyticus produzindo o oxigênio singleto, causando danos irreversíveis na membrana citoplasmática da bactéria. Miyabe e colaboradores (2010) avaliaram o efeito da TFD com AM em bactérias isoladas da cavidade oral incluindo S. aureus, S. schleiferi, S. epidermidis, S. capitis, S. haemolyticus e S. lentus, sendo observada a redução do número de células viáveis das cepas Staphylococcus em estudo. OLIVEIRA e colaboradores (2014), demostraram que a TFD com AM foi capaz de reduzir o número de células viáveis de Candida albicans, S.aureus, Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis cultivados em suspensão na presença do corante, sendo que E. faecalis e S. aureus demostraram-se mais sensíveis ao tratamento.

23 Fotossensibilizadores A fotosensibilização é definida como um conjunto de processes que induz um sistema a se tornar sensível à luz, assim o fotossensibilizador pode ser definido como uma substância capaz de absorver fótons, quando associado a um sistema irradiado, sendo capaz de induzir efeitos específicos que não ocorrem na ausência da luz (SPIKES, 1991; CARVALHO, 2001). O fotossensibilizador deve apresentar características específicas para ser empregado em TFD, dentre elas, a hidrossolubilidade, composição química definida e fluorescência. Os FS são compostos atóxicos ou pouco tóxicos, no escuro, e quando combinados com luz e oxigênio, produzem ERO e radicais livres, induzindo a morte do tecido por necrose e/ou apoptose (BASTOS, 2013; MELO, 2014). Os FS podem ser divididos em Porfirinas (PpIX, derivados de hematoportifirna, uroporfirinas, Clorinas (clorinas e bacterioclorinas) e Corantes (ftalocianinas) (PINTO, 2011). Os primeiros FS na década de 60 a serem utilizados em estudos na terapia fotodinâmica foram os derivados de hematoporfirina (HpD). KENNEDY, Pottier e Pross, em 1990, apresentaram, pela primeira vez estudos sobre a aplicação do ácido 5-aminolevuliníco (5-ALA) um precursor da protoporfirina IX (PpIX). Uma vez que as células sejam capazes de metabolizar o ALA, a PpIX é acumulada no interior da célula e quando irradiada o processo de morte celular é iniciado. (ISSA; MANELA-AZULAY, 2010; OLIVEIRA, et al., 2015). As porfirinas compreendem uma classe de moléculas que estão presentes em muitos sistemas biológicos e têm sido amplamente utilizadas em TFD, sendo consideradas FS de primeira geração. As porfirinas e seus derivados desempenham papéis vitais no funcionamento de muitos sistemas bioquímicos como a fotossíntese, a transferência de elétrons na cadeia respiratória, bem como o transporte e armazenamento de oxigênio. As porfirinas apresentam espectro de absorção contendo 5 bandas, sendo a de maior intensidade na região de 400 nm, chamada banda de Soret e quatro outras bandas de menor intensidade, mas em comprimentos maiores, chamadas de banda Q. Apesar de eficientes, estes FS não são considerados ideais, pois ficam retidos

24 22 nas células por longo tempo, causando fotossensibilidade dérmica e ocular, além de possuírem a última banda de absorção na faixa de nm, limitando a penetração da luz no tecido biológico (MENEZES, 2006). As clorinas são FS de segunda geração, estruturalmente são semelhantes as porfirinas, são encontradas na clorofila, sendo considerados compostos quimicamente puros, que absorvem luz em comprimentos de onda maiores que 650 nm, permanecendo na célula por um tempo mais curto (OLIVEIRA, et. al., 2015). O Photodithazine (PDZ) é uma clorina e 6 fabricado na Rússia, a partir da cianobactéria Spirulina platensis. Sua estrutura química (Figura 2) é modificada com a adição de N-metil-D-glicosamina como agente solubilizante e estabilizante, tornando a molécula hidrossolúvel (BERNAL, 2011). Figura 2- Estrutura Química do Photodithazine Fonte: Corrêa, 2006 Essa modificação no PDZ aumenta sua capacidade de penetração nas células através da membrana biológica, além disso, estudos in vivo mostraram que este composto não apresenta toxicidade no escuro, exceto em concentrações elevadas e apresenta rápida depuração, com 94% da eliminação nas primeiras 24 horas (STRANADKO et al., 2000; MARTINKOVICS, 2002; MENEZES et al., 2005; CORRÊA, 2006).

25 Fontes de Luz No último século, pesquisadores americanos e europeus, iniciaram pesquisas envolvendo as propriedades da luz laser para ser empregadas como terapia. Diversas fontes de luz podem ser utilizadas na aplicação da TFD, inclusive a luz solar, entretanto se destacam três grupos, os lasers, as lâmpadas de amplo espectro e os Diodos Emissores de Luz (LED). O laser produz um feixe de luz com energia concentrada, comprimento de onda único, concentração elevada de energia e pouca dispersão de energia à medida que a luz se propaga. De acordo com sua potência pode ser utilizado como instrumento de corte, vaporizando tecidos, ou como uma ferramenta para a TFD (GENOVESE, 2000). Além disso, o uso de fibras ópticas permite irradiar o interior de tumores e estruturas corpóreas, entretanto, uma das limitações para aplicação na TFD em tratamentos cutâneos, por exemplo, é a dificuldade em irradiar toda a superfície de uma ferida igualmente, pois o diâmetro do feixe de laser tende a ser pequeno, sendo necessárias várias aplicações para cobrir uma área grande (GENOVESE, 2000). O Diodo Emissor de Luz (Liht emitting diode - LED) é um diodo semicondutor capaz de absorver energia elétrica e emitir na forma de luz visível, considerado uma fonte de luz contínua de alta eficiência. Os efeitos dos LEDs são semelhantes ao do laser, apesar da luz não ser monocromática colimada e nem coerente, a possibilidade de irradiar áreas maiores e o menor custo dos equipamentos de LED o tornam uma alternativa atraente para a aplicação de TFD (GENOVESE, 2000; TOMAZINI et. al., 2007). 3.6 Aplicação da TFD O emprego da TFD na inativação de microrganismos pode ser uma alternativa para redução ou eliminação dos patógenos causadores de infecções. A TFD tem sido estudada nas últimas décadas como uma modalidade de tratamento alternativo para várias doenças, como o câncer, doenças oculares e

26 24 dermatológicas (feridas e queimaduras) (PASZKO et. al., 2011; ROLIM et. al., 2012), além de ter sido utilizada com sucesso para inativar agentes patogênicos. Um grande número de estudos clínicos envolvendo a TFD para lesões de papilomatose virais e para a acne demonstraram seu efeito antimicrobiano (DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009). A inativação de bactérias por meio da TFD é baseada no acúmulo de um FS ou a passagem deste através da membrana citoplasmática de forma significativa, induzindo a danos irreversíveis às bactérias após irradiação (ROLIM et. al., 2012). Uma variedade de FS demonstrou eficiência na fotoinativação de bactérias Gram-positivas, enquanto que as bactérias Gram-negativas, geralmente, não respondem à TFD da mesma forma. Esse comportamento tem sido atribuído à membrana externa organizada que esta possui, dificultando a interação de FS com a membrana citoplasmática (DEMIDOVA et. al., 2005; SPESIA et. al., 2009). Segundo Deminova e colaboradores (2005), um fotossensibilizador neutro ou uma molécula iônica são capazes de se ligar em bactérias Gram positivas, resultando em sucesso na aplicação da TFD. No caso de bactérias Gram negativas seria necessário a penetração do FS pela membrana externa e parece celular, para que a TFD fizesse efeito (DEMIDOVA et. al., 2005). Embora vários estudos abordem a inativação microbiana utilizando a TFD (DAI; HUANGA; HAMBLIN, 2009; CARVALHO et. al.,2014; CARMELLO et. al., 2015), não existe uma padronização de protocolo. Diferentes cepas respondem ao mesmo protocolo de formas distintas. Carvalho e colaboradores (2014) testaram o efeito da TFD com o PDZ e dose de luz de 50 J/cm², obtendo inibição total das cepas gram-positivas, entretanto, as cepas gram-negativas que foram testadas, não apresentaram resposta ao protocolo testado. O uso do PDZ no controle de outros microrganismos, também tem sido estudado, como, por exemplo, no processo de inativação fotodinâmica de Candida albicans. Carmello e colaboradores (2015) obtiveram a diminuição de unidades formadoras de colônia utilizando a TFD com PDZ. Os testes foram realizados em animais, e além dos resultados positivos, não foram observados efeitos adversos no tecido tratado. Desta forma, o aumento da resistência a antibióticos dificultando o combate e controle das infecções localizadas, podendo induzir a infecção generalizada se não tratada de modo rápido e adequado (NASCIMENTO; NAMBA, 2009), e a grande

27 25 disseminação de bactérias resistentes aos antibióticos, faz-se necessária a busca por terapias mais efetivas. A Terapia Fotodinâmica surge como uma terapia alternativa na inativação microbiana devido ao fato de não promover a seleção de microrganismos resistentes e à possibilidade de um tratamento seletivo, de aplicação local, e que minimiza a exposição do paciente a antibióticos.

28 26 4 METODOLOGIA 4.1 Amostras As bactérias utilizadas foram provenientes de acervo interno do Laboratório de Terapia Fotodinâmica, coletadas de feridas na Clínica de Enfermagem de Taubaté no trabalho de dissertação da Denise Pereira de Lima Carvalho aprovado pelo comitê de ética em pesquisa sob o número 100/2011. Para confirmação das espécies de bactérias utilizadas, as cepas foram submetidas a testes em meios seletivos e provas bioquímicas. Inicialmente foram semeadas em Agar Manitol e MacConkey e posteriormente submetidas à coloração de Gram. Foram utilizadas as provas bioquímicas de coagulase e catalase, quando Gram-positivas, e inoculadas em meio Rugai, quando Gram-negativas, conforme demonstra a Figura 3. Figura 3 Provas bioquímicas para identificação dos microrganismos Fonte: Autor.

29 27 As bactérias identificadas e utilizadas para o estudo foram Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Para fins de comparação com as cepas clínicas foram incluídas as cepas (ATCC) padrão: Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922). 4.2 Preparo das bactérias para os ensaios Foram retiradas colônias previamente semeadas em agar BHI e incubadas a 37ºC durante 18 horas, e diluídas em PBS até igualar a concentração de bactérias ao tubo nº 0,5 da escala nefelométrica de Mc Farland (1,5x10 8 células/ml). Em seguida os tubos foram centrifugados a 266 xg por 15 minutos, desprezando-se o sobrenadante, e posteriormente ressuspenso em 2 ml de PBS estéril. Divisão de Grupos Amostrais Os grupos foram divididos de acordo com a Tabela 1: Tabela 1 - Ensaios com PDZ Ensaios com PDZ Staphylococcus aureus Escherichia coli Cepa Clínica Cepa ATCC Cepa Clínica Cepa ATCC Escuro Controle Controle Controle Controle 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml Irradiado 10 LED 10 J/cm² LED 10 J/cm² LED 10 J/cm² LED 10 J/cm² J/cm² 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml Irradiado 50 LED 50 J/cm² LED 50 J/cm² LED 50 J/cm² LED 50 J/cm² J/cm² 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

30 Protocolo de TFD com PDZ e incubação de 15 minutos Foram utilizados 4 tubos para cada cepa testada, dividindo-se de acordo com a concentração de FS aplicada da seguinte forma: Tubo 1: Controle: Bactérias sem FS Tubo 2: Bactérias incubadas com o PDZ 0.3 mg/ml Tubo 3: Bactérias incubadas com o PDZ 0.6 mg/ml Tubo 4: Bactérias incubadas com o PDZ 1.0 mg/ml Os tubos foram centrifugados, desprezando-se o sobrenadante e adicionando-se 200 µl de PDZ nas concentrações de 0.3 mg/ml, 0.6 mg/ml, 1.0 mg/ml e incubados por 15 minutos. Após o tempo de incubação os grupos foram homogeneizados e distribuídos em duas placas de 96 poços estéreis, uma para cada dose de energia testada, enquanto os grupos escuros foram diretamente transferidos para placa de 24 poços e ressuspendidos em 1 ml de caldo BHI. Com base na literatura e outros estudos não foi realizada a remoção do FS para irradiação (PFITZNER et al., 2004). Cada placa de 96 poços foi irradiada utilizando um dispositivo à base de LEDs (Biopdi / Irrad-Lead 660), composto por 54 LEDs cada um com 70 mw de potência na região de 660nm do espectro eletromagnético, com intensidade de 25 mw/cm 2 e dose de luz de 10 e 50 J/cm 2, durante 6 minutos e 40 segundos e 33 minutos e 20 segundos, respectivamente. Após a irradiação, os grupos foram transferidos para placas estéreis de 24 poços e ressuspendidos em 1 ml de caldo BHI. 4.4 Protocolo de TFD com PDZ e incubação de 24 horas Semelhantemente ao teste utilizando o tempo de incubação de 15 minutos, as cepas foram novamente dividias em 4 tubos de acordo com a concentração de PDZ a ser aplicada: Tubo 1: Controle: Bactérias sem FS Tubo 2: Bactérias incubadas com o PDZ 0.3 mg/ml

31 29 Tubo 3: Bactérias incubadas com o PDZ 0.6 mg/ml Tubo 4: Bactérias incubadas com o PDZ 1.0 mg/ml Os tubos foram centrifugados, desprezando-se o sobrenadante e adicionando-se 200 µl de PDZ nas concentrações de 0.3 mg/ml, 0.6 mg/ml, 1.0 mg/ml e incubados durante 24 horas. Após o tempo de incubação as amostras foram lavadas com PBS, centrifugadas e o sobrenadante desprezado e, em seguida, adicionado 2mL de caldo BHI. As amostras foram homogeneizadas e distribuídas em placas de 96 poços. As placas também foram irradiadas a 10 e 50 J/cm², já os grupos escuros foram transferidos diretamente para placa de 24 poços e ressuspendidos em 1 ml de caldo BHI. Após a irradiação, os grupos foram transferidos para plada de 24 poços e ressuspendidos em 1 ml de caldo BHI. Por fim, procedeu a incubação do experimento em estufa bacteriológica a 37ºC, com o tempo variando de acordo com o método de avaliação. 4.5 Avaliação por absorbância Para a avaliação do crescimento bacteriano por absorbância, as placas de 24 poços foram incubadas durante 3 horas e em seguida foram lidas em equipamento de espectofotometria (Synergy HT Multi-Detection, marca Bio-Tek, Winooski, UT), utilizando o comprimento de onda de 490nm para leitura. Os valores de absorbância obtidos foram transformados em porcentagem de turbidez em relação ao controle, por meio da seguinte fórmula: % de turbidez = (Absorbância teste - branco) x 100 (Absorbância controle - branco)

32 Internalização de PDZ Os testes para avaliar a internalização do PDZ utilizaram cepas ATCC de Staphylococcus aureus e Escherichia coli, as quais foram incubadas com 125 µg/ml de PDZ em meio BHI, a 37 C durante 15 minutos e 24 horas. Após a incubação, o meio com PDZ foi removido, e as bactérias foram fixadas com paraformaldeído a 4%. Todo o processo foi realizado em um ambiente escuro. As imagens foram feitas utilizando microscópio confocal (LSM Zeiss), e montadas utilizando o software GIMP Análises estatísticas A análise estatística foi realizada utilizando o teste ANOVA um critério, com teste de Tukey, por meio do software Bioestat 5.0.

33 31 5 RESULTADOS Após o processamento do material coletado foram identificadas as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Para fins de comparação com as cepas clínicas foram incluídas as cepas padrão: Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922) Internalização do PDZ em cepas Staphylococcus aureus A análise em microscopia confocal demonstrou que a cepa de S. aureus também foi capaz de internalizar o PDZ após 15 minutos de interação à 37 C. Observou-se que a maioria das bactérias internaliza o PDZ, entretanto isso não ocorre em todas as células bacterianas (Figura 4). Após 24 horas de incubação com o PDZ, foi observado que a cepa de S. aureus internalizou e manteve o PDZ nas bactérias (Figura 5). Neste grupo, também foi observado, que nem todos os microorganismos apresentavam o PDZ em seu interior. Figura 4 - Microscopia confocal demonstrando a internalização do PDZ após 15 minutos de interação à 37 C. (A) Observação da lâmina em campo claro. (B) Observação da fluorescência emitida pelo PDZ. Fonte: Autor.

34 32 Figura 5 - Microscopia confocal demonstrando a internalização do PDZ após 24 horas de interação à 37 C. (A) Observação da lâmina em campo claro. (B) Observação da fluorescência emitida pelo PDZ. Fonte: Autor. 5.2 Terapia Fotodinâmica aplicada a Staphylococcus aureus Incubação de 15 minutos Para a melhor visualização dos resultados obtidos nas medidas de absorbância, os valores foram transformados em porcentagem, normalizando os dados de acordo com os grupos controle. A Figura 6 compara a porcentagem entre os grupos submetidos à TFD utilizando o tempo de 15 minutos de interação com o PDZ nas três concentrações de FS utilizadas, bem como os resultados obtidos nos grupos controle escuro e controle irradiado com doses de energia de 10 e 50 J/cm².

35 33 Figura 6 Avaliação da porcentagem de crescimento Staphylococcus aureus com concentrações diferentes de PDZ em 15 min de incubação (º,*,#, p<0,01). Fonte: Autor. Analisando a figura, é possível observar que, de forma geral, quando utilizando o tempo de incubação de 15 minutos com o PDZ, não foi possível reduzir ou inibir o crescimento bacteriano das cepas clínicas e ATCC S. aureus, nas diferentes concentrações de FS e fluências de energia testadas. O PDZ, no tempo de incubação de 15 minutos, não apresentou grande citotoxicidade no escuro, sendo que apenas o grupo Controle 0,3 mg/ml da cepa Clínica S. aureus apresentou redução de 5% em relação ao controle. Para a irradiação utilizando a fluência de 10 J/cm², por exemplo, houve um crescimento de 10% para as cepas ATCC e clinica em relação ao controle na maior concentração de PDZ. Tal crescimento também foi observado quando utilizada a fluência de 50 J/cm², chegando a 15% de crescimento acima do grupo controle para a cepa Clínica S. aureus quando utilizada a concentração de 0,6 mg/ml de PDZ Incubação de 24 horas A Figura 7 compara as porcentagens entre os grupos amostrais para as cepas clínica e ATCC S. aureus quando utilizado um tempo de incubação com o PDZ de 24 horas, variando-se a concentração do FS e a fluência de energia.

36 34 Figura 7 Avaliação da porcentagem de crescimento de Staphylococcus aureus com concentrações diferentes de PDZ em 24 horas de incubação (º,*,#,,, + p<0,01) Fonte: Autor. Quando utilizado o tempo de incubação de 24 horas, a TFD com o PDZ apresentou redução geral nos grupos em que foi aplicada, no entanto, os grupos PDZ mantidos no escuro apresentaram redução, mesmo sem a aplicação da TFD, sugerindo que o PDZ utilizado por longo período de incubação, pôde ser toxico para as células bacterianas. A cepa ATCC apresentou maior citotoxicidade no escuro nas concentrações de 0,3 mg/ml, com 19% de redução, e 0,6 mg/ml, apresentando 26% de redução. Proporcionalmente, comparado ao seu controle, a cepa Clínica sofreu menor citotoxicidade no escuro, apresentando uma redução de 13% apenas na concentração de 0,3 mg/ml. Os grupos irradiados, por sua vez, apresentaram maior redução em relação ao controle, sendo que, em todos os grupos testados, ao aumentar a fluência de energia, de 10 J/cm² para 50 J/cm², o efeito da TFD foi maior, reduzindo o crescimento bacteriano em relação aos controles. A cepa ATCC, proporcionalmente ao seu controle, foi relativamente mais sensível ao tratamento, visto que chegou a ter o crescimento reduzido em até 59% na concentração de 0,6 mg/ml de PDZ na fluência de 50 J/cm², enquanto o maior percentual de redução para a cepa clínica foi de 54% na concentração de 1,0 mg/ml de PDZ e fluência de energia de 50 J/cm².

37 Internalização do PDZ em cepas Escherichia coli As bactérias da cepa E. coli foram incubadas a 37ºC com o PDZ durante 15 min, após este período foram submetidas a análise de microscopia confocal para determinação da internalização do FS (Figura 8). Observou-se que a internalização do FS pelo microrganismo não é homogênea, pois nem todas as bactérias internalizaram o FS. Figura 8 - Microscopia confocal demonstrando a internalização do PDZ após 15 minutos de interação à 37 C. (A) Observação da lâmina em campo claro. (B) Observação da fluorescência emitida pelo PDZ. Fonte: Autor. Com o tempo de interação de 24 horas de incubação com o PDZ, foi observado que a cepa E. coli internalizou e manteve o PDZ nas bactérias (Figura 9), entretanto não foram todos os microrganismos que apresentaram o PDZ em seu interior.

38 36 Figura 9 - Microscopia confocal demonstrando a internalização do PDZ após 24 horas de interação à 37 C. (A) Observação da lâmina em campo claro. (B) Observação da fluorescência emitida pelo PDZ. Fonte: Autor. 5.4 Terapia Fotodinâmica aplicada a Escherichia coli Incubação de 15 minutos A figura 10 demonstra a comparação percentual entre os grupos irradiados e não irradiados das cepas clínicas e ATCC Escherichia coli, nas diferentes concentrações de PDZ e diferentes fluências de energia testadas utilizando o tempo de incubação com FS de 15 minutos.

39 37 Figura 10 - Avaliação da porcentagem de crescimento Escherichia coli com concentrações diferentes de PDZ em 15 minutos de incubação (º p<0,01). Fonte: Autor. É possível observar diferenças nas porcentagens de crescimento bacteriano ao utilizar incubação de 15 minutos com o PDZ, indicando uma redução de até 8% no grupo ATCC no escuro e de até 6% nos grupos tratados com TFD. O PDZ, nas concentrações testadas, chegou a ser citotóxico para a cepa ATCC E. coli, apresentando 8% de redução na maior concentração de FS. A cepa clínica, por sua vez, não sofreu citotoxicidade perante o PDZ sem a presença da luz, já que chegou a apresentar até 5% de crescimento superior ao controle no escuro sem FS. Quando submetidas à TFD, as cepas clínicas e ATCC apresentaram pequenas reduções em relação aos grupos apenas irradiados. Apenas para a concentração de 0,6 mg/ml de PDZ, nas duas fluências de energia testadas, os grupos demonstraram elevação no crescimento em relação ao controle em até 4%, comportamento observado apenas na cepa clínica Incubação de 24 horas A figura 11 apresenta a porcentagem de crescimento bacteriano dos grupos irradiados e não irradiados das cepas clínicas e ATCC Escherichia coli nas

40 38 diferentes concentrações e fluências de energia testadas utilizando o tempo de incubação de 24 horas. Figura 11 - Avaliação da porcentagem de crescimento Escherichia coli com concentrações diferentes de PDZ em 24 horas de incubação (*p<0,05) (,º,, + p<0,01) Fonte: Autor. O tempo de incubação de 24 horas apresentou maiores variações em relação ao tempo de incubação de 15 minutos. Nesse caso, a citotoxicidade observada no menor tempo de incubação não foi mantida, sendo que apenas na concentração de 0,6 mg/ml para as cepas ATCC e clínica foi observada redução de 4% em relação ao grupo controle no escuro. A cepa clínica, submetida a fluência de energia de 10 J/cm² foi mais sensível ao tratamento em relação à cepa ATCC proporcionalmente aos controles, chegando a ter a maior taxa de redução na concentração de 0,6 mg/ml de PDZ, cerca de 22%. Já a irradiação com fluência de 50 J/cm² não apresentou mesmo padrão, visto que os grupos submetidos à TFD com 1,0 mg/ml de PDZ obtiveram crescimento de 32% e 28% em relação aos controles, para as cepas ATCC e clínica E. coli, respectivamente.