TERAPIA FOTODINÂMICA COM AZUL DE METILENO SOBRE CEPA DE. Freitas MAA, Pereira AHS, Fontana LC, Ferreira-Strixino, J

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1 TERAPIA FOTODINÂMICA COM AZUL DE METILENO SOBRE CEPA DE Staphylococcus aureus RESISTENTE À METICILINA Freitas MAA, Pereira AHS, Fontana LC, Ferreira-Strixino, J Universidade do Vale do Paraíba UNIVAP, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) Av Shishima Hifumi, 2911 São José dos Campos, SP, mirianafreitas@hotmail.com Resumo- S. aureus é o agente etiológico de maior importância associado às infecções adquiridas tanto em âmbito comunitário ou hospitalar, devido a sua capacidade de desenvolver resistência às terapias convencionais. A Terapia Fotodinâmica (TFD) surge como alternativa a ser utilizada no controle de cepas resistentes aos antibioticos. O objetivo do presente estudo é avaliar os efeitos da TFD com Azul de Metileno (AM) sobre cepas de S. aureus resistente à meticilina (MRSA). As amostras foram diluídas em PBS estéril de acordo com a escala 0,5 de MacFarland. Os grupos foram compostos com diferentes concentrações de AM, incubados no escuro durante 15 minutos e irradiados por LED Biopdi/Irrad-Led5 em 660nm com fluência de 10 J/cm². Posteriormente, foram semeadas e incubadas à 37ºC por 24 horas. A contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) demonstrou que a TFD foi eficaz na menor concentração testada de AM sobre cepas de MRSA. Palavras-chave: Staphylococcus aureus, Terapia Fotodinâmica, Azul de Metileno Área do Conhecimento: Biomedicina Introdução O gênero Staphylococcus são cocos Gram positivos, comumente encontrados na região do trato respiratório e pele. Geralmente as infecções se caracterizam por serem superficiais e leves na maioria dos pacientes, mas podem tornar-se graves em pacientes imunocomprometidos. O S. aureus é o agente etiológico de maior importância associado às infecções adquiridas tanto em âmbito comunitário ou hospitalar, devido a sua capacidade de desenvolver resistência às terapias medicamentosas convencionais (CATAO et al., 2013; FU, X.J; FANG, Y; YAO, M., 2013). Embora o S. aureus seja suscetíveis à Meticilina (MSSA), alguns mecanismos relacionados à mutação ou transdução levam ao desenvolvimento de cepas resistentes à Meticilina (MRSA) que podem ser resistentes também a outros fármacos, tais como Clindamicina, Eritromicina e Tetraciclina (BASTOS et al., 2013; CATAO et al., 2013; PINTO, 2013). Em determinadas circunstâncias o S.aureus pode provocar infecções oportunistas brandas, como as folicutes simples, impetigo e furúnculos ou podem ocasionar infecções sistêmicas graves potencialmente fatais. Em alguns casos a infecção pode ser causada por bactérias do próprio paciente, de outros doentes ou de indivíduos sadios e a sua transmissão ocorre por contato direto ou indireto. O uso prolongado da terapia antimicrobiana pode facilitar o surgimento de cepas multirresistentes que ocorre por meio de mutações e aquisição de plasmídeos. Os MRSA são resistentes à ação das beta-lactamases o que implica em um sério problema para o inicio da terapia antimicrobiana, uma vez que as opções terapêuticas são escassas e o tempo de tratamento é prolongado, resultando em infecções severas (RATTI, R.P; SOUSA, C.P., 2009). Tendo em vista o potencial elevado dos MRSA produzirem infecções invasivas, terapias alternativas, como a Terapia fotodinâmica, têm sido utilizadas para sua erradicação. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma terapia minimamente invasiva, devido ao seu amplo espectro de ação, inativação de cepas resistentes aos antibióticos, baixo potencial mutagênico e a falta de cepas microbianas resistentes à TFD (PINTO, 2013; TIM, 2015). Envolve três componentes: Luz, fotossensibilizador (FS) e oxigênio molecular. Quando o FS é irradiado com luz de comprimento de onda especifico, o mesmo passa de um estado de baixa energia para um estado excitado chamado de singleto O oxigênio no estado singleto pode decair para o estado fundamental com emissão de fluorescência ou passar para um estado tripleto excitado. No estado tripleto, esta espécie poderá passar por dois mecanismos de reação, do tipo I ou II. Na reação de tipo I, há transferência direta de 1

2 elétrons de um FS excitado para um substrato, formando diferentes tipos de radicais livres, como peroxido de hidrogênio e hidroxila. Estas Espécies Reativas de Oxigênio (ERO'S) são capazes de oxidar uma variedade de biomoléculas, provocando danos biológicos no microrganismo. Na reação de tipo II o FS excitado transfere energia ao oxigênio molecular e gera oxigênio singleto altamente reativo que irá oxidar biomoléculas, levando a lise da membrana celular. Reações do tipo I e II podem ocorrer simultaneamente (PINTO, 2013; NASCIMENTO, 2013; TIM, 2015). A escolha do FS apropriado é necessária para obter uma eficácia antimicrobiana e oferecer baixa toxicidade, para isso é necessário cumprir alguns requisitos, como alto rendimento quântico de oxigênio, ser fotoestável, apresentar amplo espectro de ação antimicrobiana (bactéria, fungo e parasitas), ter baixa afinidade e toxicidade pelas células do paciente, baixo potencial mutagênico e ausência de toxicidade no escuro (TIM, 2015). O Azul de Metileno pertence à classe dos fenotiazínicos com absorção entre nm, região do espectro eletromagnético, comumente utilizado por se encontrar dentro da janela terapêutica, devido a capacidade de penetração da luz no tecido (BUCK, 2009). Tendo em vista a necessidade de novas terapias eficazes, menos invasivas e que não ofereçam resistência antimicrobiana, o objetivo do presente estudo é avaliar os efeitos da Terapia Fotodinâmica com Azul de metileno sobre cepas de S. aureus MRSA. Metodologia As cepas de S. aureus MRSA foram cedidas pelo Laboratório Oswaldo Cruz de São José dos Campos, que mantêm convênio com o Laboratório de Terapia Fotodinâmica da Universidade do Vale do Paraíba. São provenientes de material clínico já submetido aos procedimentos de identificação. As cepas foram cultivadas em caldo BHI durante 24 horas em estufa bacteriológica à 37ºC, aliquotadas em eppendorfs com 5 de glicerol e, posteriormente acondionadas em freezer à -4ºC. Para os ensaios as cepas foram descongeladas em caldo BHI e incubadas à 37ºC por 24 horas e, posteriormente semeadas em Ágar Manitol. Inicialmente as amostras foram diluídas em PBS estéril de acordo com a escala 0,5 de MacFarland, correspondente a 1,5 x 10 8 células/ml. Os grupos amostrais foram divididos de acordo com as concentrações testadas de Azul de Metileno, descritos na tabela 1. Depois de adicionado o FS, as amostras foram incubadas no escuro durante 15 minutos e suspensas em caldo BHI estéril. Os grupos tratados foram irradiados pelo dispositivo LED s Biopdi/Irrad-Led5 660, com comprimento de onda de 660nm, irradiância de 25mW/cm², potência de 70mW/cm² e fluência de 10J/cm². Posteriormente, alíquotas foram semeadas por espalhamento em ágar BHI e incubadas à 37ºC por 24 horas. A análise dos efeitos da TFD foi realizada, após o período de incubação, por meio da contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/ml). Tabela 1 Grupos Amostrais Grupo Concentração FS (μm) Fluência Controle Escuro s/ AM s/ irradiação AM 0,1 0,1 mg/ml s/ irradiação AM 0,3 0,3 mg/ml s/ irradiação AM 0,5 0,5 mg/ml s/ irradiação Controle Claro s/ AM Irradiado 10J/cm² TFD 0,1 0,1 mg/ml Irradiado 10J/cm² TFD 0,3 0,3 mg/ml Irradiado 10J/cm² TFD 0,5 0,5 mg/ml Irradiado 10J/cm² Os mesmos ensaios foram realizados com a cepa ATCC de S. aureus, a fim de comparar os resultados com a cepa clínica e para garantir a fidelidade dos experimentos. Todos os experimentos foram realizados em triplicatas. Os resultados foram apresentados em forma de tabelas e gráficos contendo a média da contagem do número de unidades formadoras de colônia em Log10 e percentual de redução em relação aos controles. Nos gráficos também foram inseridas barras de erro considerando o desvio padrão obtido para cada um dos grupos experimentais. 2

3 Resultados Foram testadas as concentrações de 0,1; 0,3 e 0,5mg/mL de Azul de Metileno para os experimentos no claro (irradiado) e no escuro (não irradiado). Na cepa clínica MRSA, pode-se observar que na ausência de luz, houve baixa citotoxicidade em todas as concentrações, obtendo redução de 1 log no AM 0,1mg/mL. O mesmo ocorreu nas concentrações de 0,3 mg/ml e 0,5 mg/ml com redução de 2 logs quando comparado ao controle. Conforme demonstrado na tabela 2, nos grupos irradiados com 10J/cm² nas três concentrações testadas houve redução de 4 logs comparado ao controle. O gráfico 1 apresenta a contagem de UFC/mL da TFD aplicada nas cepas de MRSA. Tabela 2 Terapia Fotodinâmica com Azul de Metileno em MRSA Escuro MRSA Claro 10 J/cm² - MRSA Controle 9,67 0,06 0 Controle 9,9 0,17 0 AM 0,1 8 0,25 17,3 TFD 0,1 5,9 0,07 40,4 AM 0,3 7,6 0,11 21,4 TFD 0,3 5,32 0,15 46,3 AM 0,5 5,15 0,21 46,7 TFD 0,5 5,3 0,09 46,5 Na cepa ATCC foi observado redução, na ausência de luz, de 2 logs no grupo AM 0,1 mg/ml e redução de 3 logs nos grupos AM 0,3 e AM 0,5, conforme apresentado na tabela 3. Analisando os grupos irradiados, pode-se observar redução de 6 logs no grupo TFD 0,1mg/mL, porém nos grupos com 0,3 e 0,5 mg/ml de AM foi observado redução de 4 logs, tendo menor redução quando comparado à menor concentração de AM (Gráfico 2). Tabela 3 Terapia Fotodinâmica com Azul de Metileno em S. aureus ATCC Escuro ATCC Claro 10 J/cm² - ATCC Controle 10,62 0,4 0 Controle 10,56 0,34 0 AM 0,1 8,16 0,59 23,2 TFD 0,1 4,76 0,15 54,9 AM 0,3 7,89 0,29 25,7 TFD 0,3 6,44 0,03 39,0 AM 0,5 7,38 0,3 30,5 TFD 0,5 6,61 0,02 37,4 3

4 Gráfico 1 Terapia Fotodinâmica utilizando Azul de Metileno aplicada em MRSA Gráfico 2 Terapia Fotodinâmica utilizando Azul de Metlieno aplicada em S.aureus ATCC Discussão O aumento de bactérias resistentes aos antimicrobianos tem incentivado o estudo de métodos alternativos para combater as infecções ocasionadas por esses microrganismos (SILVA et al., 2013). Tendo em vista a necessidade do emprego de novos métodos terapêuticos, o presente trabalho buscou avaliar o efeito da TFD sobre cepas resistentes de S. aureus (MRSA) isolados de material clinico, avaliando o efeito citotóxico do AM e do LED isoladamente e a associação de ambos. No presente estudo, nas cepas de MRSA, foi observado redução de 40,4 quando irradiado a 10J/cm² na concentração de 0,1mg/mL de AM, nas concentrações de 0,3 e 0,5mg/mL testadas houve redução de 46,3 e 46,5 respectivamente. Analisando a cepa ATCC foi observado 55 de redução 4

5 quando utilizado o AM a 0,1mg/mL. Porém, na concentração de 0,3mg/mL houve 39 de redução e 0,5mg/mL 37. No trabalho de Pereira em 2009, a TFD foi aplicada em biofilmes de C. albicans, S.aureus e S. mutans utilizando o Azul de Metileno na concentração de 0,1mg/mL e irradiado por Laser (660nm) durante 98 segundos. Foi possível observar redução de 40,22, 55,91 e 47,35 para C.albicans, S.aureus e S. mutans respectivamente. Para um fotossensibilizador ser considerado eficiente, é necessário que ele tenha baixa toxicidade na ausência de luz e baixa agregação em soluções (OLIVEIRA, et al., 2015). Os ensaios realizados no escuro com a cepa ATCC demonstrou baixo efeito citotóxico do AM em todas as concentrações. Outro ponto relevante foi nos ensaios realizados com a aplicação da luz, onde o grupo TFD 0,1mg/mL teve redução de 6 logs e nos grupos TFD 0,3 e TFD 0,5mg/mL a redução foi menor (4logs), tal comportamento pode sugerir que o AM se agregou em concentrações maiores e não interagiu de forma eficiente com bactéria ou com a luz. Nos ensaios com a cepa clinica MRSA, no escuro, foi observado efeito citotóxico do AM em todas as concentrações testadas. Na concentração 0,1mg/mL de AM houve redução de 1log demonstrando baixa toxicidade, essa redução se manteve na concentração de 0,3mg/mL. Na concentração de 0,5mg/mL a redução foi de 4logs comparado ao controle escuro, conforme demonstrado nas tabelas 1 e 2, sugerindo o efeito citotóxico considerável do AM. Entretanto, quando irradiado os grupos com 10J/cm² foi observado redução de log UFC/mL na concentração de 0,1 e 0,3mg/mL, salientando a eficiência da associação da luz com o fotossensibilizador. A concentração de 0,5mg/mL de AM demonstrou-se citotóxica, uma vez que seu percentual de redução, no escuro, foi maior comparado ao mesmo grupo quando irradiado por LED. Carvalho e colaboradores em 2014, avaliaram a ação da TFD in vitro na inativação de microrganismos em feridas infectadas, utilizando AM e Photodithazine (PDZ) a 0,1mg/mL e LEDbased 660nm com dose de energia de 50 J/cm². Nas diferentes cepas analisadas, quando irradiadas, foi observada redução de UFCs comparadas ao controle sem tratamento em ambos os fotossensibilizadores. O mesmo foi observado no trabalho de Peloi (2008), o qual testaram a TFD com AM, em diferentes concentrações, sobre cepas de S. aureus, E. coli, e C.albicans. Observou-se que utilizando comprimento de onda de 663nm e fluência de 4J/cm² foi possível a redução de 93,05 para S. aureus na concentração de 42,2µM, 93,7 redução de E. coli na concentração de 35µM e 93,33 de redução para C.albicans, após 20 minutos de exposição. Nos ensaios de Almeida em 2011, realizados in vivo, foi analisado a efetividade da TFD sobre feridas cutâneas infectadas por S. aureus, utilizando LED com fluência de 10J/cm² e AM a 0,1mg/mL. Foi observado durante o período experimental, que a aplicação da TFD após 72horas de incubação obteve 93,4 de redução e após análises realizadas em 7,14 e 21 dias de incubação obteve-se 100 de redução de UFC/mL de S. aureus nas feridas cutâneas. No presente trabalho a concentração de 0,1mg/mL de AM e fluência de 10J/cm² foi eficaz sobre cepas MRSA e ATCC, apresentando 40,4 e 54,9 de redução respectivamente. Conclusão Pode-se concluir que a TFD com azul de metileno levou a redução de UFCs de cepa clínica MRSA, apresentando baixo efeito citotóxico na menor concentração de fotossensibilizador utilizado, demonstrando ser uma promissora terapia alternativa para o tratamento de infecções ocasionadas por cepas resistentes de S. aureus. Referências ALMEIDA, M.J.G.T. Análise da efetividade da terapia fotodinâmica sobre feridas cutâneas infectadas por Staphylococcus aureus, em ratos. 99p. Dissertação mestrado (Bioengenharia) Universidade do Vale do Paraíba, SP BASTOS, V.M.P. et al. Comparação da incidência, da prevalência da colonização, e da resistência de Staphylococcus aureus em diferentes populações humanas. Revista UNIABEU Belford Roxo V.6 Número 13. Maio- agosto

6 BUCK, S.T.G. Relação entre eficiência fotodinâmica, citotoxicidade e propriedades moleculares de corantes para aplicação em terapia fotodinâmica. Dissertação (Mestrado Química Analítica) Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, CARVALHO, D.P. de LIMA. et al. Study of photodynamic therapy in the control of isolated microorganisms from infected wounds an in vitro study. Lasers Med Sci (2014) 29: CATAO, R.M.R. Prevalence of hospital-acquired infections caused by Staphylococcus aureus and antimicrobial susceptibility profile. J Nurs UFPE on line., Recife, 7(6): , Aug., FU, X.J; FANG, Y; YAO, M. Antimicrobial Photodynamic Therapy for Methicillin-Resitant Staphylococcus aureus infection. BioMed Research International. Volume 2013, Article ID , 9 pages. NASCIMENTO, C.P.C. Bacteriana via Terapia Fotodinâmica. Trabalho de Conclusão de Curso (Farmácia Bioquímica) Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, OLIVEIRA, K.T. et al. Conceitos fundamentais e aplicações de fotossensibilizadores do tipo porfirinas, clorinas e ftalocianinas em terapias fotônicas. Rev. Virtual Quim. Vol 7. No Jan/Fev PELOI, L.S. et al. Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blue. J. Biosci. 33(2), June 2008, PEREIRA, C.A. Efeitos da terapia fotodinâmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans. 91f. Dissertação mestrado (Biopatologia bucal) Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista PINTO, G.C.S. Eficácia da terapia fotodinâmica antimicrobiana em biofilmes de Staphylococcus aureus suscetível e resistente à meticilina. 120 f.; 30 cm. Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia, Araraquara, RATTI, R.P; SOUSA, C.P. Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) e infecções nosocomiais. Rev Cien Farm Basica Apli. 2009;30(2):9-16 SILVA, D.C.G.G. et al. Low level Laser Therapy (AlGaInP) applied at 5J/cm² reduces the proliferation of Staphylococcus aureus MRSA in infected wounds and intact skin of rats. An Bras Dermatol. Vol.88 no.1 Rio de Janeiro Jan/Feb TIM, M. Strategies to optimize photosensitizers for photodynamic inactivation of bacteria. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 150 (2015)