PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA VEGETAL DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA 88040970, Florianópolis, Fone/Fax: (048)3721-8545 Florianópolis, setembro de 2012. Algumas instruções aos usuários do Laboratório de Biologia Molecular do Depto de Botânica (LBM/ BOT) do Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina Responsável: Bióloga e Pós-doutoranda Janayna L. Bouzon Biossegurança - A prática de processos referentes à biossegurança é essencial para a manutenção da saúde das pessoas que lidam diretamente com organismos vivos e substâncias tóxicas para o organismo humano, por isso é importante eliminar ou minimizar os riscos de contaminação do ambiente, soluções, bancadas, equipamentos, utensílios (pinças, espátulas, etc.) ou vidrarias por substâncias tóxicas para o organismo humano. Conto com a colaboração de todos, e seguem abaixo algumas recomendações. Informações básicas e obrigatórias: O JALECO é de uso obrigatório ao entrar no laboratório, seja para qualquer procedimento. O mesmo nunca deve ser deixado no laboratório após o término do procedimento. Não é permitido entrar com bolsas, mochilas, casacos, computadores etc, nem levar colegas/ acompanhantes, família etc. Nosso espaço é muito pequeno e suporta no máximo dois procedimentos no mesmo horário. Máximo de 4 alunos contando com a coordenadora do laboratório. Prestar atenção no protocolo de extração utilizado, pois se em alguma etapa precisar de um overnight, a extração não é indicada ser feita nas sextas-feiras.
Pipetas automáticas: No laboratório estão separadas pipetas exclusivas para extração e pipetas exclusivas para eletroforese. Pipetas da extração não devem sair de dentro da capela de exaustão por causa de compostos de alta toxicidade utilizados nas mesmas. As mesmas só saem da capela para autoclavagem. Pipetas automáticas devem ser mantidas em volume máximo após a utilização e término do procedimento. Material próprio: Além do jaleco cada usuário deve ter consigo alguns materiais de uso particular, entre eles luvas de procedimentos, canetinhas do tipo marcador permanente e lenços de papel para secagem do dna. Luvas de nitrila são recomendadas para mexer com agentes perigosos, assim como preparar soluções ou até mesmo na extração com o fenol, clorofórmio, mercaptoetanol, polietilenoglicol (PEG) e outros. Todos os reagentes, amostras, produtos de extração, purificados ou produtos da PCR de uso particular devem obrigatoriamente estar armazenados em caixinhas próprias, de tamanho adequado, e etiquetadas com nome do aluno, e, impreterivelmente o nome do professor. Autoclave: Todos somos responsáveis para que nunca faltem ponteiras e tubos eppendorfs autoclavados nas caixinhas. Por isso, sempre após a utilização do laboratório conferir se caixinhas podem ser preenchidas com ponteiras e colocadas na caixa de materiais a serem autoclavados, assim como os potes contendo tubos plásticos para reações. Aceito sugestões e pessoas que possam se responsabilizar em 1 ou 2 x por semana autoclavar materiais. Nitrogênio líquido: Está disponível um óculos de proteção para quem for manusear o nitrogênio líquido. Se for utilizar a garrafa térmica, todo cuidado é necessário. Pedir auxílio aos responsáveis do laboratório. A garrafa térmica nunca deverá ser fechada com nitrogênio líquido dentro pois pode estourar e causar graves ferimentos.
Pasta com protocolos e fichas de emergência: A pasta contendo protocolos está na bancada para consulta, assim como os manuais de todos os equipamentos do laboratório. As fichas de emergências dos produtos estão sendo impressas e em breve estarão em pasta adequada para consulta no laboratório. Freezer e Geladeira: A princípio há bastante espaço nos dois. Separei no freezer gavetas de uso exclusivo para cada grande área (fungos, algas e plantas). Há também uma gaveta de uso comum, onde temos alíquotas de água Milli-Q, séries de etanol (70, 80, 90 e 100%), clorofórmio, isopropanol e outros reagentes de uso comum. Prestar muita atenção para não confundir estoques de alíquotas em uso. Favor perguntar sempre antes da utilização. Tampão de extração: Tampão CTAB (utilizado para fungos e plantas): Estocado na geladeira em tubo falcon de 50ml. Deve ser preparado um dia antes da extração, caso não tenha pronto. Deve ser aquecido antes do uso no banho, ou então no termobloco assim que estiver disponível. Tampão de lise de algas: estocado em geladeira, tubos falcon de 50ml. Fenol: Preparado e aliquotado em tubo falcon, geladeira, última gaveta. O Fenol é muito sensível a luz e perde totalmente a atividade em 24h de exposição a mesma. Os tubos falcon estão embrulhados em papel alumínio. Assim que retirá-lo da geladeira evitar ao máximo de mexer o conteúdo, pois acima da fase orgânica está um tampão que não deve ser removido em hipótese nenhuma para a eficácia da extração. Muito importante: O fenol requer manipulação em capela de exaustão devido à sua característica de volatilização. Os gases liberados são altamente tóxicos, irritantes de pele e mucosa, podendo resultar em queimaduras ou até mesmo sérios problemas respiratórios. Uma das formas de minimizar o problema de descarte destas substâncias é o tratamento químico para inativar essas moléculas pelo rompimento do anel aromático, pelo uso de resinas ou carvão ativado ou mesmo pela queima em fornos de alta temperatura. Mercaptoetanol: Aliquotas na geladeira, e estoque na última gaveta, também protegido da luz. Produto extremamente tóxico e mortal, indico fortemente a leitura da ficha de emergência na página eletrônica da Sigma-Aldrich.
Etanol (diferentes concentrações), isopropanol e álcool isoamílico: Estocados em alíquotas de 50ml em tubos falcon SEMPRE no freezer, na gaveta de uso comum. TBE: Temos TBE 10x, TBE 1x (usado) para a cuba e TBE1x (novo) para a confecção do gel, favor não confundir. Está escrito nos frascos. Eletroforese: o quadro abaixo discrimina volume de TBE, concentração do gel requerido e o peso da agarose, para a confecção dos géis. Fôrma Volume TBE 1x Gel agarose 0.8% Gel agarose 1% Gel agarose 1.5% 6 x 6 cm 18.5 ml 0.148 g 0.185 g 0.277 g 6 x 12 cm 36 ml 0.288 g 0.36 g 0.54 g 12 x 12 cm 72 ml 0.576 g 0.72 g 1.08 g Obs. TBE novo e TBE usado na mesma bancada, etiquetados como novo e usado. O novo é para confecção do gel e o usado para realizar a corrida. Sugestão para a corrida de produto de PCR ou produto de extração: Ladder: Amostra: 1 ul ladder + 2 ul loading buffer + 1ul de gel red +1ul H 2 O Milli-Q 2 ul loading buffer + 2 ul dna + 1ul de gel red Loading Buffer (feito a partir do Azul de Bromofenol) Várias alíquotas em estoque a 6x no freezer. Diluir a medida que for terminando as alíquotas de 2x. Utilizamos na corrida do dna o loading buffer 2x, estocado fora da geladeira, junto aos aparatos da eletroforese. Quaisquer dúvidas em relação às proporções utilizadas na confecção contatar a responsável. Primers: Estoque PCR Responsável pelo estoque e alíquotas Fungos 100pmol 15pmol Valéria Algas 100pmol 10pmol Janayna Plantas
Termocicladores São dois os equipamentos que realizam a PCR. Sugiro que os programas dos usuários sejam inseridos nos dois, com o nome do grupo ou professor, e o nome do primer (p.e. calcárias UPA). Transiluminador O manuseio deste equipamento deve ser realizado com muita cautela. Nunca ligar o equipamento sem avisar anteriormente quem está no laboratório, pois existe escape de radiação UV pelas laterais. Caso houver interesse em captura de imagens do gel, levar câmera fotográfica própria ou utilizar celular para obtenção da imagem. Questionar sobre a segurança na utilização, para evitar contaminação do laboratório. Utilizar óculos de proteção devido radiação emitida. Lixo O descarte dos géis de agarose é dentro da capela assim como a luva que utilizou para o manuseio do gel. Solventes orgânicos como fenol, clorofórmio e também o mercaptoetanol são obrigatoriamente descartados dentro da capela em recipiente devidamente etiquetado. O lixo tóxico é recolhido de 15 em 15 dias, e quando os recipientes estiverem repletos devem ser estocados em sacos fechados e mantidos em caixa fechada embaixo da capela de exaustão. Agendamento de utilização do laboratório e informações finais Marcar com antecedência a utilização do laboratório. Caso a extração seja feita através de métodos manuais é obrigatório um dia antes ir até o laboratório para conferir se há pronto tampão de extração e lavar os cadinhos conforme protocolos próprios.