Reação em Cadeia Da Polimerase X Jornada Farmacêutica IV Amostra 2010 Sueli Massumi Nakatani LACEN-PR
Um Pouco de História...
Um Pouco de História... 1983 Kary Mullis for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method Nobel Prize in Chemistry - 1993 1944
Reação em Cadeia pela Polimerase PCR Diagnóstico de doenças Infecto-Contagiosas Detecção de doenças Hereditárias Diagnósticos de Câncer Transplantes Medicina Forense Genoma Humano Alimentos Transgênicos
The Economist July 22, 2000
O Brasil e os Genomas Completos Nature (2000) 406:151-157 Nature (2002) 417:459-464 J. Bacteriol. (2003) 185:1018-1026 PNAS (2003) 100:11660-11665
Projetos no Brasil Sugarcane Schistosoma mansoni Eucalyptus Coffee Human Cancer Genome
Reação em Cadeia da Polimerase Constitui um mecanismo para detectar, com alta especificidade concentrações extremamente baixas de determinadas seqüências de DNA
O DNA principais características Dupla-Fita Direcional Anti-Paralelas Complementares A T C G
Hibridização A hibridização se baseia em uma das principais características da dupla-fita de DNA a complementaridade das seqüências das duas fitas A dupla fita pode se restabelecer perfeitamente a partir de duas fitas separadas previamente As fitas podem ser separadas pela
Hibridização As fitas de DNA podem ser separadas pela ação do calor Com o resfriamento, as fitas complementares encontram-se, umas com as outras, e re-hibridizam
Polymerase Chain Reaction Thermus aquaticus, bactéria que vive em altas temperaturas Taq DNA polymerase Life at High Temperatures by Thomas D. Brock - Biotechnology in Yellowstone, 1994 Yellowstone Association for Natural Science http://www.bact.wisc.edu/bact303/b27
Reação em Cadeia da Polimerase
Reação em Cadeia da Polimerase PCR é usado para amplificar seqüências específicas de DNA O DNA molde é desnaturado (96 o C) suas fitas são separadas Dois oligonucleotídeos complementares as extremidades 3 do segmento de interesse são adicionados em excesso e a temperatura é diminuída (50-60 o C) Os oligonucleotídeos se hibridizam com seqüências complementares presentes nas moléculas do DNA molde
Reação em Cadeia da Polimerase
Reação em Cadeia da Polimerase Os óligos funcionam como iniciadores (primers) para a síntese de DNA, a qual se inicia com a adição de nucleotídeos e de uma polimerase resistente a temperatura A Taq Polimerase tem a capacidade de estender os óligos em temperaturas superiores a 72 o C Quanto a síntese esta terminada, aquece-se de novo a 96 o C para, novamente separar-se as dupla-fitas de DNA A repetição (30 40 vezes) deste ciclo de síntese,
PCR - P CiCLOS DA PCR Reaction 5 min 45 seg 45 seg 2 min 7 min 96 o C 96 o C 54 o C 72 o C 72 o C 30-40 X
1-Coleta 2-Extração 4-Detecção 3-PCR
Etapas para a realização do PCR Etapa 1 - Extração do DNA -RNA Proteinase K Kits comerciais -Genomic Prep Blood DNA Isolation Kit (Amersham Pharmacia Biotech) Método de Boom Fenol clorofórmio
Etapa 2 - Preparo do Master Mix Mg++ dntp s nucleotídeos Taq polimerase Primers Tampão da enzima H 2 O
Etapa 3 Adicionar a amostra ao master mix DNA alvo
Etapa 4 - Amplificação no Termociclador Eppendorf Cobas MJ Applied Biosystems
Ciclos da PCR Etapa A- Desnaturação por aquecimento 95ºC
Ciclos da PCR Etapa B- Hibridização dos Primers Seqüência alvo Primer 2 Primer 1 Seqüência alvo 55ºC a 65ºC
Ciclos da PCR Etapa C : Extensão 72ºC Taq polimerase Taq polimerase
Ciclo 1 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1
96 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1
Ciclo 2 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2
96 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 0 + 2
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 0 + 2
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 0 + 2
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 1 2
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 1 2
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 1 2
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 2
Ciclo 3 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3
96 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 1 + 3
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 1 + 3
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 1 + 3
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 4 3
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 4 3
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 3
Ciclo 4 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4
96 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4
54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 + Cópia delimitada = 4 + 4
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 + Cópia delimitada = 4 + 4
72 o C DNA original = 1 Cópia original = 4 Cópia delimitada = 11 4
Ciclo Cópia delimitada 1 0 2 1 3 4 4 11 5 26 6 57 7 120 10 1.013 20 1.048.555 30 1.073.741.793 35 34.359.738.332 40 1.099.511.627.735 50 1.125.899.906.842.570
Etapa 5 - Detecção do Amplificado gel de agarose a 1,5% brometo de etídio
Métodos de Detecção dos Produtos de PCR Eletroforese em Gel Horizontal de Agarose Eletroforese em Gel Vertical em Poliacrilamida Hibridização ( sondas radioativas ou não radioativas) Detecção Colorimétrica Restrição Enzimática
Gel - Corrida de eletroforese ( - ) ( + )
Gel - Corrida de eletroforese ( - ) ( + )
Gel - Corrida de eletroforese ( - ) ( + )
Gel - Corrida de eletroforese ( - ) Gel - Corrida de eletroforese ( + )
Gel - Pipetagem das amostras (PCR)
OTIMIZAÇÃO DO PCR Concentração da enzima Deoxinucleotídeos Trifosfatos (dntps) Concentração do Magnésio Anelamento dos primers Extensão do primers Temperatura e Tempo de Desnaturação Números de ciclos
Sala 3- Amplificação e Detecção dos Produtos de PCR SETOR DE BIOLOGIA MOLECULAR Sala1- Preparo e Estocagem de Reagentes Preparação do Master Mix Sala 2- Extração e Purificação do DNA RNA Estocagem das Amostras Extraídas Adição dos Ácidos Nucléicos ao Master Mix
Fluxo de Trabalho Sala1 Sala 2 Sala 3 Preparação de Reagente Preparação da amostra Amplificação Detecção e Análise dos produtos de PCR
Controle de qualidade Boas Práticas de Pipetagem Organização laboratorial Vestimentas Controles Cuidados Especiais Descontaminação
Tipos de PCR SIMPLES 1 par de primers 1 PCR primer 1 DNA alvo primer 2 amplicon
TIPOS DE PCR PCR-RFLP Enzimas de Restrição cortam segmentos de DNA
PCR-RFLP
Tipos de PCR NESTED-PCR 2 pares de primers 2 PCR DNA alvo primer 1 primer 2 primer 3 amplicon primer 4 amplicon
Tipos de PCR MULTIPLEX-PCR vários pares de primers 1 PCR DNA alvo 2 primer 2a primer 2b amplicon primer 1a DNA alvo 1 primer 1b amplicon primer 3a DNA alvo 3 primer 3b amplicon
Tipos de PCR RT-PCR 1 primer anti-sense 1 PCR RNA alvo primer 1 cdna
Testes Realizados no LACEN Quantificação de Carga Viral HIV-1 PCR Qualitativo para HCV PCR Quantitativo para HCV PCR Qualitativo para HBV PCR para Herpes Simplex virus PCR para Herpes virus 6 PCR para Cytomegalovírus PCR para Epstein Baar vírus (tipo 1 e 2) PCR para Parvo vírus B19 PCR para Varicella zoster PCR para Mycobacterium avium PCR para Mycobacterium tuberculosis PCR para leptospira sp PCR para Toxoplasmose PCR Quantitativo para HBV pela técnica