Aula 2: Estrutura e Função de Proteínas

Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas Curso de Ciências Biológicas Aula 2: Estrutura e Função de Proteínas Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

Aminoácidos Classificação baseada no grupo R: Apolares, alifáticos (hidrofóbicos) Aromáticos (hidrofóbicos) Polares, não-carregados Carregados positivamente Carregados negativamente

Aminoácidos Apolares, alifáticos (hidrofóbicos)

Aminoácidos Aromáticos (hidrofóbicos) Polares, não carregados

Aminoácidos Carregados positivamente Carregados negativamente

Bases ou ácidos? Aminoácidos

aminoácido + aminoácido + aminoácido = peptídeo (proteína)

Proteínas

Proteínas A ligação peptídica é rígida e planar

Proteínas Estrutura secundária: Conformação local de alguma parte do polipeptídeo Padrões de enovelamentos mais regulares do esqueleto polipeptídico α-hélices conformação β dobras β

Proteínas Estrutura secundária: α-helices

Proteínas Estrutura secundária: folhas β

Proteínas Estrutura secundária: dobras β

Proteínas Bernstein et al. PNAS 2004;101:8575-8580

Proteínas Estrutura terciária e quaternária

Proteínas Fibrosas queratina

Proteínas Fibrosas

Proteínas Fibrosas Prolina ou Hidroxiprolina G-X-Y colágeno

Proteínas Fibrosas colágeno

Proteínas Fibrosas escorbuto

Proteínas Fibrosas fibroína da seda

Proteínas Fibrosas resumo

Proteínas Globulares

Proteínas Globulares mioglobina

Proteínas Globulares protoporfirina + Fe 2+ = heme

Proteínas Globulares mioglobina

Proteínas Globulares motivos estruturais

Estrutura Quaternária múltiplas subunidades = multímero poucas subunidades = oligômero dímeros, trímeros, tetrâmeros, etc...

Desnaturação Protéica

Renaturação Protéica

Problemas de Dobramento Prion

Interação Proteína-Ligante

Interação Proteína-Ligante mioglobina

Interação Proteína-Ligante concentração do ligante porcentagem dos sítios de ligação ocupados concentração constante da proteína

Interação Proteína-Ligante a mioglobina e o oxigênio

Interação Proteína-Ligante a mioglobina e o oxigênio Complete a frase: um K d alto indica

Interação Proteína- Ligante

Interação Proteína-Ligante hemoglobina (desoxihemoglobina)

Interação Proteína- Ligante ligação cooperativa

Interação Proteína-Ligante afinidade dependente de ph

Anemia falciforme

Enzimas GRANDE maioria formada por proteínas (algumas enzimas são formadas por RNA) Função: CATALIZADORES de reações químicas (aceleração das reações químicas, especificidade pelo substrato, funcionam em diversas condições de temperatura e ph)

Enzimas + +

Enzimas apoenzima holoenzima Enzima holozima Parte Não proteica (cofator) metal coenzima. Apoenzima parte proteica

Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos químicos para a reação

Enzimas

Como Enzimas Funcionam... sítio ativo (catalítico) substrato enzima

Como Enzimas Funcionam... mudança de energia durante a reação como a reação progride

Como Enzimas Funcionam... energias de ativação variação de energia livre padrão (bioquímica)

Como Enzimas Funcionam... É aqui que as enzimas agem!!!... e não aqui!

Como Enzimas Funcionam... energia de ativação SEM catalizador energia de ativação COM catalizador

Como Enzimas Funcionam... intermediários da reação

Como Enzimas Funcionam... passo limitante da reação

Enzimas A energia de ativação é monstruosa!!! + +

Como Enzimas Funcionam... Compare esses números! Enzima Velocidade na ausência de enzima Reações/segundo Velocidade da reação catalisada Reações/segundo Poder catalítico Anidrase carbônica 1.3 X 10 1 1.0 X 10 6 7.7 X 10 6 Triosefosfato isomerase 4.3 X 10 6 4.300 1.0 X 10 9 Carboxipeptidase A 3.0 X 10 9 578 1.9X 10 11 AMP nucleosidase 1.0 X 10 11 60 6.0 X 10 12 Nuclease de estafilococos 1.7 X 10-13 95 5.6 X 10 14

Como Enzimas Funcionam... sítio ativo (catalítico) formação de ligações covalentes transientes com o substrato! enzima substrato

Como Enzimas Funcionam... Intermediário ES (E e S ligados covalentemente)

Como Enzimas Funcionam... sítio de ligação sítio ativo (catalítico) formação de várias ligações fracas dão especificidade para ES! enzima substrato

Como Enzimas Funcionam... energia de ligação Maior fonte de energia livre usada por enzimas para abaixar as energias de ativação das reações

Como Enzimas Funcionam...

Como Enzimas Funcionam... + formação de várias ligações fracas dão especificidade para ES!

Como as Enzimas Funcionam... Modelo Chave-Fechadura Modelo chave-fechadura Nesse modelo, o sítio ativo da enzima é pre-formado e tem a forma complementar à molécula do Substrato, de modo que outras moléculas não teriam acesso a ela. Modelo de encaixe induzido Modelo de encaixe induzido Nesse modelo, o contacto com a molécula do substrato induz mudanças conformacio-nais na enzima, que otimizam as intera-ções com os resíduos do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje em dia.

Exemplo do modelo de encaixe induxido (Carbopeptidase) Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr 248 (acima, à direita) e de Glu 270 (centro), e um átomo de Zn 2+, que está acima do Glu 270. A B Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-l-tirosina (em verde) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.

Como Enzimas Funcionam...

Como Enzimas Funcionam... substrato estado de transição

Cinética Enzimática Determinar a taxa (velocidade) da reação e como esta muda em resposta a mudanças nos parâmetros experimentais abordagem central para estudar o mecanismo de reações catalisadas por enzimas.

Praticamente linear; ou seja, quanto mais substrato, maior a V 0 Cinética Enzimática Saturação! Não adianta adicionar substrato, a V 0 não muda significativamente.

Cinética Enzimática Equação de Michaelis-Menten: V 0 = V max [S] K m + [S]

Cinética Enzimática

Cinética Enzimática K m = k -1 = K d k 1 Nesta condição, K m mede a afinidade da enzima pelo substrato

Cinética Enzimática k cat descreve a taxa do passo limitante da reação equivalente ao número de moléculas de substrato convertidas a produto em uma unidade de tempo em uma molécula de enzima, quando a enzima está saturada com substrato

Cinética Enzimática Número de turnover = moles de S catalisado por segundo moles de enzima

Eficiência catalítica k cat /K m Parâmetro mais adequado para comparações cinéticas

% atividade enzimática máxima Fatores que afetam a atividade enzimática Condições do meio que afetam estabilidade protéica ph temperatura O ph ótimo de uma enzima reflete variações no estado de ionização de resíduos de aminoácidos do sítio ativo. ph ótimo=1,5 ph ótimo=6,8 ph ótimo=9,9

% atividade enzimática máxima Fatores que afetam a atividade enzimática 1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas Variações de ph: ph ótimo Variações de temperatura: temperatura ótima 100- Temperatura ótima Desnaturação térmica da proteína 50-0- Pouca energia para a reação acontecer Ao contrário da curva em forma de sino no caso da atividade enzimática versus ph, a enzima só está desnaturada em temperaturas acima da temperatura ótima.

Enzimas Reguladoras geralmente possuem subunidades múltiplas... sítio ativo e sítio(s) regulador(es) em subunidades separadas

Enzimas Alostéricas formas mais ou menos ativas são geradas por alterações de conformação induzidas por um ou mais moduladores...

Enzimas Alostéricas X sigmóide hiperbólica

Enzimas Alostéricas alteração no K 0.5 alteração na V max

Modificações Covalentes Reversíveis

Proproteínas, Proenzimas e Zimogênios precursor inativo que precisa ser clivado para gerar a forma ativa... modificações irreversíveis pró-colágeno colágeno fibrogênio fibrina protrombina trombina pró-insulina insulina quimotripsinogênio quimotripsina tripsinogênio tripsina

Proproteínas, Proenzimas e Zimogênios

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