Instruções de utilização. Família Dynal SSP AllSet + e CombiSet +

Instruções de utilização Família Dynal SSP AllSet + e CombiSet + 0088

CONTEÚDO Página INDICAÇÕES DE UTILIZAÇÃO..... 3 RESUMO E EXPLICAÇÃO......... 3 PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO....... 3 REAGENTES........ 4 Fornecidos no Kit de tipagem..... 4 Conservação......... 4 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES 5 EQUIPAMENTO NECESSÁRIO MAS NÃO FOI FORNECIDO PELA DYNAL... 5 PROCEDIMENTO.......... 6 Colheita e preparação de amostras....... 6 Preparação da amplificação por PCR........ 6 Amplificação por PCR......... 8 Detecção da PCR utilizando a electroforese em gel de agarose.... 9 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO.......... 10 VALORES ESPERADOS....... 10 Controlo de Qualidade........ 10 Controlo dos testes internos.. 10 Interpretação dos resultados............... 11 Interpretação utilizando a Dynal SSPTool... 11 GUIA PARA RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS........... 12 BIBLIOGRAFIA................... 13 GARANTIA.. 14 MARCAS COMERCIAIS UTILIZADAS NESTE DOCUMENTO/PRODUTO.... 14 PATENTES UTILIZADAS NESTE DOCUMENTO/PRODUTO......... 14 INFORMAÇÃO DE CONTACTOS... 15 Página 2 de 15

Para uso em Diagnóstico In Vitro UTILIZAÇÃO INDICADA Tipagem a partir do DNA dos Alelos HLA de Classe I ou Classe II. RESOLUÇÃO DA TIPAGEM Kits de Baixa Resolução: Os alelos serão resolvidos a nível genérico ou a nível dos grupos alélicos, os quais geralmente estão em concordância com as especificações definidas serologicamente. Kits de Alta Resolução: Ou kits de subtipagem, asseguram a genotipagem de alta resolução ou a nível de alelos. RESUMO E EXPLICAÇÃO Quase todas as técnicas de tipagem de tecidos a partir do DNA utilizam a técnica da reacção de polimerização em cadeia (PCR polymerase chain reaction) 1 para amplificar o locus HLA a ser investigado. Na maior parte dos métodos de tipagem de tecidos a partir do DNA, utiliza-se a técnica de PCR como passo de amplificação pré-tipagem para aumentar a quantidade do DNA alvo. Portanto, o processo de tipagem HLA requer um passo pós-amplificação para descriminar entre os diferentes alelos. Ao contrário de outros métodos baseados na PCR, a Metodologia de SSP 2,3,4,5 utilizada pela Dynal Biotech Ltd SSP AllSet + e CombiSet +, discrimina entre os diferentes alelos durante o processo da PCR. Deste modo diminui-se o tempo de processamento de pós-amplificação para um simples passo de detecção por electroforese em gel. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO O método de Dynal SSP é uma técnica baseada na PCR, que utiliza uma Sequência de Iniciadores Específicos (Sequence Specific Primers SSP) para tipagem tecidular a partir do DNA. Os produtos de Dynal SSP consistem em painéis de misturas de iniciadores nos quais cada mistura de iniciadores contém um ou mais pares de iniciadores específicos, isto é, os iniciadores específicos de alelos e/ou de grupos de alelos, assim como um par de iniciadores de controlo que corresponde às sequências não alélicas das amostras. O par de iniciadores de controlo funciona como um controlo interno da PCR para verificar a eficiência das amplificações por PCR. Os Dynal SSP baseiam-se no princípio de que um iniciador que corresponda com perfeição será utilizado com mais eficiência na reacção de PCR do que um iniciador que possua uma ou várias correspondências deficientes na sua cadeia de extremidade 3. A especificidade do sistema de tipagem é uma parte integrante do passo de amplificação por PCR e o processamento pós-amplificação das amostras é reduzido a um mínimo. A atribuição de alelos consiste simplesmente em determinar se a amplificação ocorreu ou não, ou seja a visualização e detecção da amplificação por electroforese em gel de agarose. A técnica de PCR-SSP proporciona um alto grau de resolução porque cada par de iniciadores identifica dois locais polimórficos, de localização cis, ligados. O método assegura sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade elevadas. Página 3 de 15

REAGENTES Reagentes fornecidos em todos os Kits Dynal SSP AllSet + ou CombiSet + Item 1. Tabuleiros de PCR com misturas de iniciadores SSP secas e repartidas em alíquotas Descrição Cada poço do tabuleiro de PCR contém uma solução seca de iniciadores SSP constituída pelos iniciadores específicos de alelos e/ou de grupos de alelos, assim como por um par de iniciadores de controlo que corresponde às sequências não alélicas. O par de iniciadores de controlo amplifica um fragmento de um gene conservado que está presente em todas as amostras. 2. Tampas de PCR Tampas para fechar os Tabuleiros de PCR 3. Mistura Principal (o n.º de ampolas incluído depende do n.º de reacções de PCR por teste ver o quadro oposto) N.º de reacções de PCR por teste N.º de ampolas de Mistura Principal incluídas no kit (todas com 1,8 ml) 1-9 1 10-20 2 21-40 3 41-95 4 96 5 Pronto a usar com 1 x concentração. A Mistura Principal foi optimizada para ser utilizada com AmpliTaq DNA Polymerase (Roche Molecular Systems, Inc.) Informações sobre a formulação disponíveis em hla@dynalbiotech.com 4. Folheto de Instruções de Utilização do produto / Folheto de Informação sobre o Lote Específico do Produto 5. Folha de cálculo para interpretação Folheto de Instruções de Utilização do produto / Folheto de Informação sobre o Lote Específico do Produto. Uma folha de cálculo para determinar qual é o alelo ou grupo de alelos com que se identificam as respectivas misturas de iniciadores. Conservação 1. Os tabuleiros de PCR e a Mistura Principal devem ser conservados a 2-8 C. 2. Não congelar os reagentes 3. Se conservados nas condições correctas, estes reagentes e as misturas de iniciadores são estáveis até expirar o prazo de validade indicado no folheto de Informação sobre o Lote Específico do Produto. Página 4 de 15

AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Para Uso em Diagnóstico In Vitro 2. Todo o trabalho efectuado com Dynal SSP AllSet + e CombiSet + deve ser realizado seguindo as Boas Práticas de Laboratório e de acordo com as directrizes locais, p. ex., normas da EFI e directrizes da CPA. 3. Aviso de biorisco: Manusear todas as amostras como se fossem capazes de transmitir doença. Todo o trabalho deve ser efectuado usando luvas e protecção apropriada. 4. Aviso de biorisco: Devem utilizar-se tubos com tampas de rosca para a preparação dos espécimes a fim de prevenir salpicos do espécime e contaminação potencial. 5. Aviso de biorisco: Todos os espécimes devem ser manuseados como infecciosos utilizando procedimentos laboratoriais seguros como os descritos em Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 6 e no Documento M29-T do NCCLS 7. Limpar e desinfectar muito bem todas as superfícies de trabalho com lixívia a 1% (NaClO). Autoclavar todo o equipamento ou materiais que entraram em contacto com espécimes clínicos, antes da eliminação. 6. Aviso de biorisco: O brometo de etídio utilizado para coloração do DNA é um agente carcinogénico potencial. Usar sempre luvas de nitrilo durante o manuseamento de geles corados e de brometo de etídio. 7. Atenção: Usar protecção ocular com bloqueio do UV e não olhar directamente para uma fonte luminosa UV com os olhos não protegidos durante a observação ou a fotografia de geles. 8. Atenção: As pipetas utilizadas para manipulações pós-pcr não devem ser utilizadas para manipulações pré-pcr. 9. Atenção: Contaminação. Evitar a contaminação microbiana dos reagentes durante a extracção de alíquotas dos frascos de reagentes. Usar sempre luvas para evitar qualquer risco de contaminação das amostras. Recomenda-se a utilização de pipetas e de pontas de pipetas com filtros descartáveis. Não utilizar reagentes que se apresentem turvos ou com sinais de contaminação microbiana. 10. Atenção: Eliminação: Eliminar todos os reagentes não utilizados e os resíduos de acordo com as normas locais, estatais, federais e nacionais. 11. Folha de Dados de Segurança dos Materiais (MSDS) está disponível para descarregar em www.tissue-typing.com ou a pedido junto do escritório local da Dynal Biotech. (Ver as informações sobre contactos na última página deste folheto) EQUIPAMENTO NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO PELA DYNAL BIOTECH: 1. Dispositivos de pipetagem manual (p. ex., Eppendorf, Gilson) 2. Pontas de pipetas com filtros descartáveis para os dispositivos acima mencionados 3. Misturador Vórtex 4. Micro-centrífuga 5. Suporte de micro-tubos para os tabuleiros de PCR 6. Sistema de PCR Perkin-Elmer GeneAmp 9600 ou 9700 ou qualquer termociclador autorizado com uma especificação equivalente 7. Placa aquecida / micro-ondas para aquecimento das soluções de agarose 8. Aparelho de electroforese (p. ex., ABgene Electro-Fast Stretch 108 Complete, AB-0708) 9. Transiluminador com luz UV 10. Sistema de documentação fotográfica/de imagem em gel 11. Taq Polimerase Recombinante (Dynal recomenda a AmpliTaq ) 12. Agarose de grau electroforético 13. Brometo de etídio Página 5 de 15

PROCEDIMENTO NOTA: Este procedimento deve ser efectuado em duas áreas separadas do laboratório (Amplificação pré- PCR e Amplificação pós-pcr) tal como indicado nas instruções seguintes. COLHEITA E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS Cuidado: Manusear todos os espécimes como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos. a) NÃO SE RECOMENDA A UTILIZAÇÃO DE SANGUE HEPARINIZADO 8. b) O DNA pode ser extraído de qualquer tipo de células humanas nucleadas utilizando o método preferido. c) Para obtenção de resultados óptimos de amplificação e tipagem com PCR-SSP, utilizar DNA de alta pureza (OD 260:280 razão 1,6-1,8). d) A concentração final do DNA antes da PCR-SSP deve ser aproximadamente de 50 ng/µl. e) O DNA extraído deve ser diluído em dh 2 0. f) O DNA pode ser conservado a -20 C ou a temperaturas inferiores durante períodos prolongados (> 1 ano) sem efeitos adversos nos resultados. O DNA conservado a +4 durante períodos prolongados sofrerá uma degradação, dando origem a mais artefactos, por exemplo amplificações não específicas. PREPARAÇÃO DA AMPLIFICAÇÃO POR PCR (Efectuada na área pré-pcr) Para efectuar uma tipagem simples fazer a seguinte mistura de PCR. Consultar a tabela da página seguinte para obtenção dos volumes necessários (em função do n.º de reacções de PCR por teste) Mistura Principal DNA da amostra (a 50 ng/µl) DNA polimerase AmpliTaq (a 5 i.u./µl ) Misturar bem. Distribuir 10 µl da mistura acima de PCR em cada poço do tabuleiro Dynal SSP AllSet + ou CombiSet +. Colocar as tampas de PCR e fechar bem para garantir que os tubos ficam bem vedados. Pode utilizar-se uma ferramenta de fecho. Também se podem utilizar lâminas adesivas de vedação compatíveis com PCR. Neste momento as amostras estão prontas para a amplificação por PCR Conservar os reagentes restantes do kit a 2-8 C. Página 6 de 15

Tabela de cálculo para Misturas de PCR: Reacções de PCR por teste Solução da MP (µl ) DNA da amostra (µl ) AmpliTaq (µl ) 1 32 7,6 0,32 4 48 11,4 0,48 6 64 15,2 0,64 8 80 19,0 0,80 10 96 22,8 0,96 12 112 26,6 1,12 14 128 30,4 1,28 16 144 34,2 1,44 18 160 38,0 1,60 20 176 41,8 1,76 22 208 49,4 2,08 24 224 53,2 2,24 26 240 57,0 2,40 28 256 60,8 2,56 30 272 64,6 2,72 40 352 83,6 3,52 42 384 91,2 3,84 44 400 95,0 4,00 46 416 98,8 4,16 48 432 102,6 4,32 96 864 206,0 9,00 NOTA: Para números ímpares de reacções de PCR não indicados na tabela acima, basear-se no número par mais elevado seguinte (p.ex., no caso de 13 reacções de PCR por teste, consultar os cálculos relativos a 14 reacções de PCR). Página 7 de 15

DISPOSIÇÃO NO TABULEIRO A orientação do tabuleiro é assegurada pela mistura de iniciadores no poço número um (também identificado pelo uso de um corante azul), que é marcado com o número do lote impresso na face lateral. 1 2 3 4 5 6 7 8 e.g HLA-X 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 QUALQUER OUTRO NÚMERO MOLDADO NO TABULEIRO DE PLÁSTICO, P. EX. 1,2,3 DEVE SER IGNORADO PREPARAÇÃO DA AMPLIFICAÇÃO POR PCR (Efectuada na área pós-pcr) 1. Colocar o tabuleiro de SSP AllSet + ou CombiSet + no termociclador Programar o termociclador utilizando os parâmetros seguintes: Passos Um passo de desnaturação 10 ciclos 96 65 20 ciclos 96 61 72 Temperatura Tempo(s) Acção ( C) 96 120 Desnaturação 15 60 10 50 30 Desnaturação Hibridação Elongação Desnaturação Hibridação Elongação Para informações específicas do termociclador, consultar o manual do fabricante. 2. Iniciar o programa 3. Quando o programa estiver terminado, retirar as amostras do termociclador NOTA: Não levar DNA amplificado para a área de amplificação pré-pcr Página 8 de 15

DETECÇÃO DA PCR UTILIZANDO ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE Nota: Recomenda-se que seja utilizado o mesmo tampão para fazer o gel e como tampão de migração, isto é, caso se utilize 0,5 x TBE no gel, utilizar também 0,5 TBE como tampão de migração. 1. Preparar um gel de agarose a 2% (p/v) (ABgene MultiABgarose, AG-0100c) em tampão 0,5 x TBE a) Dissolver a agarose (2 g/100 ml de tampão 0,5 x TBE) fervendo num forno de microondas até à dissolução completa. Arrefecer a 60 C. Adicionar o brometo de etídio até perfazer uma concentração final de 0,5 µg/ml de gel. b) Moldar o gel com uma espessura de 3-4 mm com poços com 3 mm de largura. Deixar solidificar durante pelo menos 15 minutos. 2. a) Transferir o gel de agarose para uma unidade submersa de electroforese em gel. Cobrir o gel com 0,5 x TBE até uma profundidade de 1-2 mm. Retirar cuidadosamente o pente. Carregar todo o produto da PCR em sequência directa e cuidadosamente no gel. 3. Fazer migrar os geles em tampão 0,5 x TBE. Migrar os minigeles (um gel a menos de 10 cm entre eléctrodos) durante 10 minutos a 15 V/cm e os geles maiores durante 15 minutos a 10 V/cm. Para calcular a tensão, medir a distância (em centímetros) entre os ELÉCTRODOS na tina de electroforese; o comprimento do gel NÃO É IMPORTANTE). 4. Examinar o gel sob iluminação UV e documentar com fotografia. 1. O mesmo tampão 0,5 x TBE pode ser utilizado várias vezes, mas o desempenho pode ser melhorado utilizando um tampão recente. ADVERTÊNCIA: O brometo de etídio é um potente agente mutagénico. Usar luvas de nitrilo e protecção ocular sempre que manusear geles ou soluções contendo brometo de etídio. Página 9 de 15

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO 1. Devido à sensibilidade analítica elevada da PCR, deve ter-se extremo cuidado para conservar a pureza dos reagentes do kit ou das misturas de amplificação. Assegurar que o curso do trabalho no laboratório prossegue de maneira unidireccional e que o amplicon da PCR não é levado para a área de preparação da PCR. A pureza dos reagentes só é mantida seguindo as boas práticas de laboratório e o desempenho do teste só pode ser garantido pela adesão rigorosa aos procedimentos especificados no folheto incluído nesta embalagem. 2. Os testes Dynal AllSet + e CombiSet + foram desenvolvidos utilizando apenas espécimes de sangue inteiro não heparinizado e espécimes de DNA purificado. Não se avaliou o desempenho com outros espécimes. 3. A amostra de DNA fornece o molde para o processo de amplificação por PCR e a sua qualidade tanto no que respeita à pureza como à concentração deve estar dentro dos limites especificados neste procedimento. 4. Com este produto pode ser utilizado qualquer termociclador autorizado, desde que as especificações do instrumento sejam equivalentes às dos Sistemas Perkin-Elmer GeneAmp PCR 9600 ou 9700. 5. Assegurar que todos os instrumentos e equipamento são calibrados de acordo com as recomendações do fabricante. VALORES ESPERADOS Controlo de qualidade O controlo de qualidade e a actualização dos produtos de tipagem de tecidos a partir do DNA é muito importante. Os oligonucleótidos sintetizados devem ser extensivamente testados em relação a DNAs de linhas celulares conhecidas. As soluções de iniciadores necessitam de ser testadas em relação a DNAs positivos e a DNAs negativos com uma sequência de alta similaridade. O procedimento de controlo de qualidade consiste no seguinte: Teste da síntese de iniciadores em relação a um painel de DNAs de linhas celulares bem caracterizadas. Teste de soluções de um iniciador específico em relação a um painel de DNAs negativos e positivos. Teste de um conjunto completo de SSP. Teste do produto final. Controlo positivo interno da PCR O par de iniciadores de controlo 9 encontra-se incluído para verificar a eficiência da reacção de PCR. A sua presença confirma que a ausência de uma amplificação específica em qualquer reacção dada é efectivamente devida à ausência de polimorfismo na amostra de DNA e não resultante de uma falha da amplificação por PCR. Devido às diferentes concentrações e temperaturas de hibridação dos pares de iniciadores específicos em comparação com o par de iniciadores de controlo interno: - A intensidade da banda de controlo diminui muitas vezes na presença de uma amplificação específica e - os iniciadores de controlo interno são mais sensíveis a condições não óptimas da PCR e podem ser utilizados para monitorizar a eficiência da PCR. A amplificação sem sucesso dos fragmentos de controlo interno em sequências sem amplificações específicas deve ser considerada como sinal de um sistema não óptimo. Consultar a secção sobre resolução de problemas para as causas possíveis e as acções correctas. O folheto de informações Específicas sobre cada lote de produto, incluído com cada kit, inclui informações específicas relacionadas com o controlo positive interno. Página 10 de 15

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Os alelos são atribuídos através da presença de um produto específico da PCR. Uma amplificação específica numa sequência indica que a amostra de DNA contém o alelo ou um alelo no grupo de alelos, definido pelo par de iniciadores naquela reacção de PCR. A tabela de interpretação fornecida com cada lote pode ser utilizada para atribuir o alelo ou grupo de alelos identificado pelas respectivas soluções de iniciadores. Não em todos, mas em muitos dos Kits de Dynal SSP AllSet + ou CombiSet +, cada alelo ou grupo de alelos é amplificado por mais do que uma solução de iniciadores. É importante verificar se todas as outras soluções de iniciadores, que devem ser positivas por conterem aquele alelo ou grupo de alelos, são de facto positivas. Embora os alelos sejam atribuídos pela presença do produto da PCR, os tamanhos relativos dos produtos da PCR podem ser úteis na interpretação das tipagens por SSP. Os tamanhos aproximados dos produtos específicos da PCR podem ser utilizados para distinguir entre uma amplificação realmente positiva e: - artefactos resultantes de oligómeros iniciadores (dímeros iniciadores) - contaminação a partir de poços adjacentes - amplificações não específicas Na tabela de interpretação fornecida com cada Kits de Dynal SSP AllSet + ou CombiSet + é dada a sequência para os três nucleótidos mais terminais que determinam a especificidade da extremidade 3 dos iniciadores directo e reverso. Para os produtos HLA de Classe I, é dada a posição do nucleótido no 2.º, 3.º ou 4.º exão que corresponde à extremidade 3 dos iniciadores. Nos casos dos Kits de SSP AllSet + HLA de Classe II, é dada a posição do codão correspondente à extremidade 3 dos iniciadores. Se existir a sequência de um novo alelo não incluído na tabela de interpretação, a informação da sequência do iniciador pode ser utilizada para determinar o padrão de amplificação do novo alelo. Neste caso, contactar o departamento de Serviços Técnicos pelo correio electrónico: hla@dynalbiotech.com ou envie um fax para: +44 151 346 1223. Interpretação utilizando Dynal SSPTool Dynal SSPTool é um software especialmente concebido para auxiliar na interpretação dos resultados. A tabela de interpretação específica de cada lote individual dos kits de SSP AllSet + e CombiSet + é introduzida na base de dados do software. A base de dados é actualizada continuamente sempre que são lançados novos lotes de produtos. Para ajuda e informação sobre a introdução de resultados e utilização do software, consultar a secção de Ajuda de SSPTool. Para encomenda de uma cópia gratuita de Dynal SSPTool (código do produto 990.80), contactar o representante local da Dynal Biotech. Página 11 de 15

GUIA PARA RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS PROBLEMA CAUSA ACÇÃO Ausência de amplificação (não houve amplificação dos fragmentos de controlo interno nem amplificação específica) DNA em muito pouca quantidade O DNA contém inibidores da PCR, p.ex., proteínas, etanol (dos passos de precipitação). O DNA foi extraído de sangue heparinizado Falha aleatória da amplificação As tampas dos tubos de PCR que não foram bem fechadas dão origem a evaporação e subsequente falha da amplificação Verificar se o volume e a concentração de DNA adicionado estavam correctos Determinar a qualidade do DNA. Siga exactamente o método de extracção do DNA dos fornecedores. Tentar um método de extracção do DNA alternativo Tornar a extrair o DNA Utilizar sangue não heparinizado ou tentar um tratamento com heparinase (Ver Ref 8) O DNA é dissolvido num tampão contendo EDTA Repetir a extracção do DNA e dissolver o DNA em água estéril Verificar que todas as tampas estão bem fechadas Usar a ferramenta de fecho Erros na carga do gel Fragmentos do controlo interno fracos Amplificação não específica (em escada ou com manchas) Sinais de amplificação mais fracos com o decorrer do tempo Uso de pipetas não calibradas Erros de pipetagem O DNA da amostra, a Taq polimerase ou as pré-misturas da PCR não foram bem misturadas antes da utilização DNA impuro Pouca quantidade de DNA Temperatura de hibridação demasiado alta. O termociclador não está calibrado A quantidade de DNA polimerase termoestável é pouca. A DNA polimerase termoestável é de má qualidade. DNA impuro (Algumas misturas de iniciadores têm uma tendência mais elevada de originar uma amplificação não específica, ver as notas de rodapé em cada tabela de especificidade específica) A solução de coloração de brometo de etídio do gel de agarose é antiga Verificar se foi carregado o número correcto de poços e se cada poço contém aproximadamente o mesmo volume de mistura de PCR Calibrar por rotina todas as pipetas de acordo com as recomendações dos fornecedores Efectuar a pipetagem com mais cuidado Misturar rapidamente no Vórtex antes da utilização Determinar a qualidade do DNA. Repetir a extracção do DNA com soluções recentemente preparadas. Determinar a concentração do DNA e ajustá-la para 50 ng/µl Calibrar o termociclador e verificar o programa da PCR. Um termociclador utilizador para PCR-SSP de rotina deve ser calibrado de 6 em 6 meses. Utilizar mais enzima nas reacções de PCR Utilizar Amplitaq da Perkin-Elmer Todos os fragmentos maiores do que o fragmento do controlo interno podem ser desprezados Verificar a qualidade do DNA Repetir a extracção do DNA A ausência de DNA também pode causar manchas Preparar uma nova solução de brometo de etídio para obter uma melhor coloração do gel. Uma das lâmpadas de UV está partida Verificar o equipamento de iluminação UV. Amplificações positivas falsas Padrões de amplificação estranhos Temperatura de hibridação demasiado alta, o termociclador não está calibrado Pode ser causado por Contaminação DNA impuro Temperatura de hibridação demasiado alta. O termociclador não está calibrado. É utilizada a tabela de interpretação incorrecta O padrão de amplificação contém um falso positivo Novo alelo, não incluído na tabela de interpretação Bandas indistintas, esbatidas O tampão de electroforese pode estar quente O pente utilizado tem fendas muito espessas Utilizar pentes finos (4x1 mm) Amplicon não carrega correctamente Tampão de migração com concentração diferente do tampão do gel utilizado Tampão de migração incompatível com o amplicon da PCR Bolhas de ar na pipeta Calibrar o termociclador e verifique o programa da PCR. Um termociclador utilizador para PCR-SSP de rotina deve ser calibrado de 6 em 6 meses. Usar luvas e pontas de pipeta contendo tampões de filtração. Utilizar áreas separadas para a pré e pós-pcr. Manusear correctamente as amostras em todos os passos. Verificar quanto a sinais de contaminação utilizando iniciadores de controlo da contaminação da Dynal (código do produto 990.05) Determinar a qualidade do DNA. Repetir a extracção do DNA com soluções recentemente preparadas. Calibrar o termociclador e verificar o programa da PCR. Um termociclador utilizador para PCR-SSP de rotina deve ser calibrado de 6 em 6 meses. Verificar se o número de lote do produto utilizado é o mesmo da tabela de interpretação utilizada. Verificar se todas as amplificações específicas são correctas ou se um artefacto (contaminação, dímero iniciador) pode ter sido mal interpretado como uma amplificação. Repetir a tipagem. Se o novo padrão de amplificação for reprodutível, contactar o representante local da Dynal Biotech para informações respeitantes ao padrão de amplificação dos alelos recentemente descritos. Utilizar o tampão TBE recomendado. Efectuar a migração numa tensão inferior Utilizar o mesmo tampão como tampão do gel e de migração 0,5 x TBE é recomendado Pipetar correctamente Página 12 de 15

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GARANTIA Os produtos são garantidos ao primeiro comprador apenas como estando em conformidade com a quantidade e conteúdo declarados nas ampolas e nos rótulos exteriores durante o prazo de validade declarado. A obrigação da Dynal Biotech e o recurso exclusivo do comprador ao abrigo desta garantia estão limitados a substituição, à custa da Dynal Biotech, de quaisquer produtos que possam ter defeitos de fabrico e que deverão ser devolvidos à Dynal Biotech, com transporte pré-pago, ou segundo o critério da Dynal Biotech, ao reembolso do preço de compra. Reclamações relativas a mercadoria danificada em trânsito devem ser apresentadas à empresa de transporte. Esta garantia não se aplicará a produtos que possam ter sido alterados fora da Dynal Biotech, nem se aplicará a produtos que foram sujeitos a má utilização ou manipulação incorrecta. TODAS AS OUTRAS GARANTIAS, EXPRESSAS, IMPLÍCITAS OU ESTATUTÁRIAS, SÃO PELA PRESENTE ESPECIFICAMENTE EXCLUÍDAS, INCLUINDO, MAS NÃO LIMITADAS A, QUALQUER GARANTIA DE COMERCIALIZAÇÃO OU ADEQUAÇÃO A UM DETERMINADO FIM. A responsabilidade máxima da Dynal Biotech está limitada em todas as circunstâncias ao preço dos produtos vendidos pela Dynal Biotech. EM CIRCUNSTÂNCIA ALGUMA A DYNAL BIOTECH SERÁ RESPONSÁVEL POR QUAISQUER DANOS ESPECIAIS, ACIDENTAIS OU INDIRECTOS. Alguns estados não permitem limites em garantias ou em recursos por violação em determinadas transacções. Em alguns estados, podem não se aplicar os limites acima descritos. Este produto não pode ser reembalado, reformulado ou novamente vendido sem o consentimento por escrito da Dynal Biotech Ltd., U.K. MARCAS COMERCIAIS UTILIZADAS NESTE DOCUMENTO/PRODUTO Dynal é uma marca registada da DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Noruega AllSet e AllSet + são marcas comerciais da DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Noruega DynaMix é uma marca comercial da DYNAL BIOTECH Ltd., R.U. CombiSet e CombiSet + são marcas comerciais da DYNAL BIOTECH., R.U. SSPTool é uma marca comercial da DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Noruega AmpliTaq é uma marca registada da Roche Molecular Systems, Inc. E.U.A. Electro-Fast é uma marca registada da Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene ) GeneAmp é uma marca comercial da Roche Molecular Systems, Inc. E.U.A. PATENTES UTILIZADAS NESTE DOCUMENTO/PRODUTO * Os produtos Dynal SSP são vendidos sob licença de ARMS da ZENECA Ltd. com respeito à Patente Europeia N.º 0332435 e propriedade internacional de patentes correspondente. ARMS é uma marca comercial da ZENECA Ltd. ** Este produto foi optimizado para utilização no Processo da Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR ) que é coberto por patentes pertencentes à Roche Molecular Systems Inc. e à F. Hoffmann-La Roche Ltd. (Roche ). Nenhuma licença, ao abrigo destas patentes, para utilização do Processo da PCR é transferido expressamente ou por inferência para o comprador aquando da aquisição deste produto. Outras informações sobre licenças de aquisição para utilizar o Processo da PCR podem ser obtidas contactando, nos Estados Unidos, o Director de Concessão de Licenças na Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, Califórnia, 94501, e fora dos Estados Unidos, o Director de Concessão de Licenças da PCR, F. Hoffman-La Roche Ltd, Grenzacherstr. 124, DH-4070 Basileia, Suíça. Fabricado pela Dynal Biotech Ltd., R.U. Desenvolvido pela Dynal Biotech Ltd., R.U. Página 14 de 15