MF-0407.R-2 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE COLÔNIAS DE BACTÉRIAS QUE PRECIPITAM O FERRO (FERROBACTÉRIAS), PELA TÉCNICA "POUR PLATE" Notas: Aprovado pela Deliberação CECA n 3.966, de 16 de janeiro de 2001 Publicado no DOERJ de 02 de abril de 2001 1 OBJETIVO Definir o método de determinação de colônias de bactérias que precipitam o ferro (ferrobactérias), em amostras de águas ou de efluentes líquidos, pela técnica "Pour Plate". 2 DOCUMENTO DE REFERÊNCIA MN-707 - MANUAL DE AMOSTRAGEM DE QUALIDADE DE ÁGUA. 3 DEFINIÇÃO Para os efeitos deste método adota-se a seguinte definição: FERROBACTÉRIAS - grupo de bactérias morfológica e fisiologicamente heterogêneo, com algumas espécies cultivadas em laboratório, que são capazes de metabolizar o ferro reduzido e os compostos orgânicos de ferro solúveis, presente no seu habitat aquoso, e depositar o ferro, na forma de hidróxido férrico hidratado, em suas secreções mucilaginosas. Entre as ferrobactérias de grande interesse em microbiologia da água, por causarem algumas alterações em sua qualidade, pode-se citar: Sphaerotilus, Leptothrix e Gallionella. 4 PRINCÍPIO As ferrobactérias, sob determinadas condições de nutrição, temperatura e tempo de incubação em presença de compostos orgânicos de ferro solúveis, formam colônias com coloração ferruginosa típica. Há evidências de que as ferrobactérias metabolizam a parte orgânica dos compostos orgânicos de ferro, eliminando o ferro, que é depositado em suas secreções mucilaginosas, na forma de hidróxido de ferro.
5 RESUMO DA TÉCNICA A técnica "pour plate" para determinação de ferrobactérias consiste na adição do meio de cultura, em estado líquido e estabilizado à temperatura de 45 ( 1) ºC, ao inóculo da amostra. Alíquotas adequadas de diluições decimais sucessivas da amostra são inoculadas em placas de Petri, em duplicatas, adicionando-se, a seguir, o meio de cultura agar citrato férrico amoniacal, previamente fundido e estabilizado. Após determinado período de incubação é feita a contagem das colônias, utilizando-se um contador de colônias tipo Quebec. 6 APLICABILIDADE Aplicável a amostras de água doce ou salgada e de efluentes líquidos. 7 INTERFERÊNCIAS Para evitar interferências, a amostra deve ser coletada e preservada de acordo com o MN-707. 8 APARELHAGEM E MATERIAL 8.1 Autoclave 8.2 Incubadora bacteriológica regulada para 20 ºC 8.3 Balança com precisão de 0,1 mg e 0,1 g 8.4 Medidor de ph 8.5 Contador de colônias tipo Quebec 8.6 Banho-maria regulado para 45 ( 1) ºC 8.7 Pipetas tipo Mohr de 5 ml e 10 ml 8.8 Placas de Petri de 100 x 15 mm 8.9 Tubos de ensaio de 18x 180 mm
8.10 Frascos para água de diluição de borosilicato com capacidade para conter 90 ml, deixando espaço para permitir boa homogeneização 8.11 Estante para tubos de ensaio Obs: Todo material que entre em contato com a amostra deve ser quimicamente inerte, preferencialmente de vidro. Todo o material deve ser esterilizado a seco, antes do uso. 9 REAGENTES E SOLUÇÕES 9.1 ÁGUA DESTILADA ESTÉRIL Água destilada autoclavada. 9.2 SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE SÓDIO 1 N Pesar 40 g de hidróxido de sódio (NaOH) p.a, dissolver em pequena quantidade de água destilada estéril, transferir para balão volumétrico e completar o volume a 1 000 ml. Guardar em frasco apropriado. 9.3 AGAR CITRATO FÉRRICO AMONIACAL Pesar e transferir para béquer de 2 litros os seguintes sais: 0,5 g de sulfato de amônia [(NH 4 ) 2.SO 4 ] p.a; 0,5 g de nitrato de sódio (NaNO 3 ) p.a; 0,3 g de fosfato dibásico de potássio (K 2 HPO 4 ) p.a; 0,5 g de sulfato de magnésio (MgSO 4.7H 2 O) p.a; 0,2 g de cloreto de cálcio (CaCl 2.6H 2 O) p.a; 10,0 g de citrato férrico amoniacal; e 15,0 g de agar puríssimo. Acrescentar 1 000 ml de água destilada fria, deixando em repouso durante aproximadamente 15 minutos. Aquecer em banho-maria agitando freqüentemente até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Distribuir volumes de 15 ml em tubos de ensaio de tamanho adequado. Tampar com bucha de algodão recoberta com gaze e esterilizar em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 6,6 ( 0,1).
9.4 SOLUÇÃO ESTOQUE A Dissolver 34,0 g de fosfato monobásico de potássio (KH 2 PO 4 ) p.a em 500 ml de água destilada estéril. Ajustar o ph para 7,2 ( 0,1) com solução de hidróxido de sódio normal (NaOH 1 N) e completar o volume para 1 000 ml com água destilada estéril. Colocar em frasco adequado e guardar em geladeira. 9.5 SOLUÇÃO ESTOQUE B Dissolver 81,1 g de cloreto de magnésio (MgCl 2.6H 2 O) p.a em água destilada estéril e completar o volume a 1 000 ml. Colocar em frasco adequado e guardar em geladeira. 9.6 ÁGUA DE DILUIÇÃO FOSFATADA Pipetar 1,25 ml da solução estoque A e 5,0 ml da solução estoque B e diluir em água destilada, completando o volume a 1 000 ml. Distribuir em frascos de diluição quantidades que assegurem, após esterilização em autoclave a 121 ºC durante 20 minutos, volume de 90 ( 2) ml. 10 PROCEDIMENTO DO MÉTODO 10.1 Antes de iniciar o trabalho, desinfetar as bancadas com desinfetante que não deixe resíduo. 10.2 Preparar as placas de Petri em duplicatas para cada alíquota de amostra a ser inoculada e proceder as suas identificações com o número dado pelo laboratório. 10.3 Homogeneizar a amostra, agitando vigorosamente o frasco, no mínimo 25 vezes. 10.4 Preparar diluições da amostra em água de diluição fosfatada. 10.5 Com pipeta esterilizada de 1 ml e com os cuidados de assepsia, transferir 1 ml da amostra e das diluições, em duplicata para as placas de Petri correspondentes. 10.6 Após inoculação e em espaço de tempo inferior a 20 minutos, entreabrir cada placa e acrescentar 15 ml do agar citrato férrico amoniacal, previamente fundido e estabilizado em banho-maria a 45 ( 1) ºC, tendo o cuidado de flambar a boca do tubo antes de verter o meio às placas.
10.7 Homogeneizar o inóculo com o meio contido na placa, com movimentos circulares moderados, para evitar a projeção do conteúdo para fora da placa. 10.8 Após a solidificação do meio, incubar as placas em posição invertida, a 20 ºC durante 20 dias. 10.9 Após o período de incubação, selecionar duas placas correspondentes à mesma diluição que tenham entre 30 e 300 colônias com coloração ferruginosa e efetuar a contagem com o auxílio de um contador de colônia tipo Quebec. 11 RESULTADO 11.1 Calcular a média aritmética das contagens obtidas nas placas em duplicata selecionadas e multiplicar o resultado pela diluição utilizada nessas placas. 11.2 Expressar o resultado em número de colônias de bactérias que precipitam o ferro por 1 ml da amostra original. 12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 12.1 AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water and wastewater - 16th ed. Washington D.C., 1985. 12.2 STARKEY, R.L. - Transformation of iron by bacteria in Bater. J.Am. Water Works Assoc. 37-963-984, 1945.