CAPÍTULO 13 348 BIOLOGIA MOLECULAR DA Hb S INTRODUÇÃO A heterogeneidade das manifestações clínicas entre doentes com o genótipo SS da anemia falciforme sempre foi um enigma para os clínicos. Com o progresso da tecnologia laboratorial, que gradualmente foi introduzida em laboratórios prestadores de serviços médicos, algumas explicações sobre o desenvolvimento clínico desta doença pode ser entendido. Por exemplo, doentes com anemia falciforme que apresentam concentrações elevadas de Hb Fetal (> 5%) tem desenvolvimento físico melhor e consequências patológicas menores da doença quando comparados com doentes portadores de Hb SS associada a valores de Hb Fetal abaixo de 5%. Um outro "fator modelador" da anemia falciforme é a interação com a talassemia alfa (ou Hb SS/Tal. alfa), em que a diminuição da concentração da hemoglobina S corpuscular média induzida pela talassemia alfa minimiza os efeitos polimerizantes da Hb S e seus conseqüentes danos à estrutura e fisiologia dos eritrócitos falcêmicos. Com o advento das análises de biologia molecular surgiram as técnicas de obtenção de enzimas (endonucleases de restrição) extraídas de diferentes espécies de bactérias capazes de reconhecerem diferentes seqüências de bases nitrogenadas de moléculas de DNA. Atualmente há mais de 150 tipos diferentes dessas endonucleases que reconhecem e fragmentam diversas seqüências de bases nitrogenadas. Apesar disso, são relativamente poucas as regiões do DNA humano que são reconhecidas e fragmentadas pelas endonucleases de restrição. Especificamente com relação ao agrupamento de genes da globina beta (ver figuras 32 do capítulo 3, e 65 do capítulo 6) há várias regiões (ou sítios) polimórficos localizados entre os genes épsilon e beta, bem como nas seqüências flanqueadoras. As regiões polimórficas do DNA são definidas como aquelas que apresentam uma seqüência de nucleotídeos capazes de serem reconhecidas por uma endonuclease de restrição e que, quando mutados, perdem a capacidade de serem reconhecidos
349 por esta enzima. O conjunto dessas regiões polimórficas num cromossomo constitui o haplótipo. A primeira evidência sobre a importância do uso de endonuclease de restrição se deu em virtude da realização do diagnóstico pré-natal para identificar se o feto seria portador da Hb SS. O estudo pioneiro foi publicado em 1982 por Chang e Kan que usaram a enzima Mst II com capacidade de fragmentar o DNA ao detectar a seqüência de bases representadas por citosina-citosina-timina-qualquer base-adenina-guanina-guanina, ou simplesmente CCTnAGG (em que n pode ser qualquer uma das quatro bases: A, C, G, T). A região de ataque da Mst II é uma sequência de sete bases, que no DNA da globina beta A (Hb A) é CCTGAGG. Entretanto, na mutação que resulta a Hb S esta seqüência passa a ser CCTGTGG, fato que faz a Mst II não reconhecer a seqüência de bases nesse pedaço do DNA da globina beta S (Hb S) e, por isso, não o fragmenta, conforme mostra a exposição abaixo: DNA-Globina β A (Hb A) DNA-Globina β S (Hb S) Aminoácidos (*) PRO GLU GLU PRO VAL GLU Bases CCT GAG GAG CCT CTG GAG Ação da Mst II CCT GAG GAG CCT CTG GAG Tamanho do fragmento 1,15 Kb 1,35 Kb (*) A seqüência dos resíduos de aminoácidos se referem aos de número 5, 6 e 7. O fragmento do DNA-β A, com um tamanho correspondente a 1.150 bases nitrogenadas (ou 1,15 Kb), é menor do que o fragmento do DNA-β S, com 1.350 bases nitrogenadas (ou 1,35 Kb), e ambos são diferenciados por meio de eletroforese de DNA em gel de agarose. A busca de informações genéticas que pudessem explicar a heterogeneidade clínica da anemia falciforme levou os pesquisadores utilizarem de
350 várias endonucleases de restrições para atuarem no DNA da globina β S. Essas enzimas passaram a ter importância como marcadores antropológicos relacionados à origem da Hb S (ver capítulo 6) fato que resultou na identificação dos haplótipos Benin, Senegal, Bantu (CAR), Camarões e Árabe-Indiano. Essas contribuições obtidas por estudos em biologia molecular na identificação dos haplótipos de globinas do agrupamento de genes beta (5' ε, γ A, γ G, βδ e β 3') fortaleceu suposição de que a mutação da Hb S teve origem multicêntrica. CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DOS HAPLÓTIPOS DO GENE β S Haplótipo Benin O sequenciamento de bases nitrogenadas das regiões polimórficas do agrupamento de genes da globina beta foi realizado no sentido de tentar descobrir as causas das variações quantitativas das concentrações de Hb Fetal entre pacientes falcêmicos com um mesmo haplótipo, e entre pacientes com haplótipos diferentes. Quatro regiões do agrupamento de genes da globina beta foram analisadas: regiões flanqueadoras e regiões dos introns IVS II (Intron II do gene da globina) dos genes Gama A e Gama G. A região IVS II do gene Gama A apresenta grande variabilidade entre os cinco haplótipos, entretanto no haplótipo Benin há mutações específicas fato que o torna diferente dos demais. A região de controle dos locus (RCG), entre 5' ao gene épsilon, inicialmente descrita pela sua hipersensibilidade à atividade da Dnase, poderia estar envolvida na expressão dos genes Gama em alguns indivíduos com o haplótipo Benin (ver figura 32, capítulo 3). Alguns rearranjos nesta região do haplótipo Benin foram observados em alguns pacientes com anemia falciforme associada a altos níveis de Hb Fetal. Estudos antropológicos efetuados na região de Benin no continente africano mostraram que há pouquíssimos haplótipos atípicos, fato que caracteriza a alta freqüência deste haplótipo na população normal. Haplótipo Senegal A região flanqueadora localizada entre 5' ao gene Gama G tem seis bases nitrogenadas em posição polimórfica. Este arranjo é encontrado em todos os haplótipos ligados ao gene da globina β S e é compatível
351 com uma pequena conversão gênica em um cromossomo africano ancestral, anterior ao aparecimento da mutação β S. As diferenças entre as seqüências de referência na região flanqueadora 5' ao gene Gama A se apresentam de forma variável nos vários haplótipos β S, fato que demonstra maior heterogeneidade do gene Gama A em relação ao Gama G. Haplótipo Bantú (ou CAR) Estudos realizados na determinação deste haplótipo demonstraram a importância da região 5' na regulação do gene da globina Gama. O sequenciamento das regiões do gene Gama do haplótipo Bantu e da mutação β S revelaram uma conversão gênica 5' ao gene Gama A. Os limites incertos desta conversão gênica se fundamentam na homologia da seqüência de bases nitrogenadas dos dois genes Gama. A conversão gênica ligada ao haplótipo Bantu deve ter ocorrido há cerca de um milhão de anos, e se fixou entre os habitantes do sudeste africano. Esta conversão que está associada ao haplótipo Bantu da Hb S aparece em freqüências baixas ou nulas nos outros haplótipos. Como a maioria dos portadores do haplótipo Bantu apresentam a mesma conversão gênica, a variabilidade na expressão do gene Gama G dentro deste grupo não está relacionado à mudança nesta região do DNA. No entanto mutações de ponto na porção 5' de cada um dos genes Gama podem modular sua expressão. O sequenciamento da região montante do gene Gama ligado ao haplótipo Bantu revelou uma deleção de 6 pares de bases. Análises posteriores mostraram que esta mutação está presente, em média, em 1/3 dos pacientes com anemia falciforme portadores do haplótipo Bantu, e está ausente nos outros haplótipos ligados ao gene β S, assim como na maioria dos genes da globina β A. Esse fato pode ser indicativo de que a deleção deve ter ocorrido recentemente (milhares de anos) num subgrupo de cromossomos de pessoas da região do sudeste africano. Sua presença nos cromossomos β S deve estar relacionada a um "crossing-over" entre o cromossomo β S Bantu e um cromossomo β A Bantu. Os cromossomos com haplótipo Bantu podem ser classificados em três categorias: sem conversão gênica e sem deleção; com conversão gênica e sem deleção; com conversão gênica + deleção. Este haplótipo é, portanto, o mais heterogêneo em relação ao gene Gama G. Assim, a presença de haplótipos atípicos entre pessoas africanas, onde há predomínio de haplótipo Bantu, é muito alta. Esse
352 fato determinou a presença de onze haplótipos atípicos dentro do haplótipo Bantu, fato que dificulta a presença de indivíduos homozigotos para este haplótipo. Haplótipo Camarões Este haplótipo está ligado ao gene Gama A-Treonina e é idêntico ao haplótipo II que está associado a um subgrupo de talassemia beta na região do mar Mediterrâneo. Os alelos Gama A-Isoleucina e Gama A-Treonina diferem no códon 75, onde há base nitrogenada ATT correspondente ao aminoácido isoleucina, ou ACT que sintetiza a treonina. Haplótipo Árabe-Indiano As principais características do haplótipo Árabe-Indiano incluem a presença da mutação C T no gene Gama G, fato que pode explicar a elevada concentração de Hb Fetal entre portadores deste haplótipo. Essas características foram postuladas como influenciadoras da baixa concentração de Hb S no traço falcêmico. O haplótipo Árabe-Indiano representa mais de 90% dos haplótipos associados ao gene β S na Índia e é o mais prevalente entre habitantes da Arábia Saudita. OS HAPLÓTIPOS DE Hb S E SUAS INFLUÊNCIAS Apesar de estar bem esclarecido a presença de cinco haplótipos no agrupamento do gene da globina beta, além de um grupo de haplótipos atípicos que não se classificam entre os haplótipos Benin, Senegal, Bantu, Camarões e Árabe- Indiano, é importante destacar que há muita heterozigose entre os haplótipos. Estudos realizados na cidade de Salvador (BA) em 82 pacientes com anemia falciforme resultou que 22% eram homozigotos Bantu/Bantu, 21% Benin/Benin, 46% Bantu/Benin, 1% Benin/Senegal e 10% atípicos. No Rio de Janeiro, Fleury em 2000 obteve o seguinte resultado em relação à diversidade de haplótipos: 63% de heterozigotos Bantu/Benin, 22% Bantu/Bantu, 12% Benin/Benin, 1,5% Benin/Senegal e 1,5% Bantu/Senegal. Sob o ponto de vista hematológico o haplótipo Bantu quando em homozigose é clinicamente o mais grave, com Hb Fetal abaixo de 5%. O haplótipo Benin homozigoto também é clinicamente grave, porém com menos intensidade ao ser comparado com o haplótipo anterior, e o nível de Hb Fetal também está abaixo de 5%. Na seqüência de gravidade clínica, o haplótipo Camarões se coloca em
353 terceiro lugar, com níveis de Hb Fetal também inferiores a 5%. O haplótipo Senegal se apresenta clinicamente com gravidade moderada em relação aos anteriores, e os níveis médios de Hb Fetal situam-se entre 8 e 9%. O haplótipo Árabe-Indiano tem manifestações clínicas típicas da anemia falciforme que podem ser classificados entre os graus leve a moderado, e o nível de Hb Fetal é superior a 15%. Por esses informes observa-se que o nível elevado de Hb Fetal é um moderador da gravidade clínica da anemia falciforme, fato descrito nos anos 50 do século passado, e motivado principalmente pela persistência hereditária da Hb Fetal (PHHF). Não há dúvida de que os haplótipos Bantu/Bantu, Bantu/Benin, e Benin/Benin, coincidem com os casos mais graves da anemia falciforme. Entretanto, múltiplos fatores tem influência na gravidade de uma doença grave e crônica como é o caso da anemia falciforme, com destaque principalmente para as situações econômica, social, cultural e ambiental do paciente. Assim, a aplicação da biologia molecular na determinação dos haplótipos relacionados à doença das células falciformes, no estágio atual de sua tecnologia, se mostra útil aos estudos antropológicos relacionados principalmente aos fluxos imigratórios.