CONTROLE DE QUALIDADE DE MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA ENSAIOS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS J.M. Tibola 1, R.S. Castro 1, F.M.S. Godinho 1, E.M.M. Rossoni 1 1- Fundação de Ciência e Tecnologia CIENTEC - Departamento de Alimentos Laboratório de Microbiologia Rua Washington Luiz, 675 CEP: 90010-460 Porto Alegre RS Brasil, Telefone: (55-51) 3287-2190 Fax: (55-51) 3287-2080 e-mail: (fernanda-godinho@cientec.rs.gov.br) RESUMO - No presente trabalho realizou-se o controle de qualidade tomando como referência a ISO 11133:2014 de dezesseis meios de cultura sólidos e líquidos. O desempenho foi avaliado quanto à produtividade e seletividade, utilizando microrganismos específicos para cada meio de cultura. As culturas de trabalho de cada microrganismo foram produzidas a partir de subculturas de cepas de referência obtidas diretamente de coleções de culturas oficiais. Além de fazer o controle de qualidade dos meios de cultura, o presente trabalho também analisou o desempenho e a viabilidade depois de um tempo de armazenamento de três meses, de seis meios de cultura selecionados entre os dezesseis. Os resultados demonstraram que todos os meios analisados apresentaram produtividade e seletividade satisfatórias, tanto logo após a produção quanto depois de estocados por três meses. ABSTRACT - In the present work the quality control of sixteen solid and liquid culture media was performed with reference to ISO 11133: 2014. The performance was evaluated for productivity and selectivity, using specific micro-organisms for each medium. The working culture of each microorganism was produced from subcultures of reference strains obtained directly from official collections of cultures. In addition to making the quality control of culture media, this paper also analyzed the performance and viability after a storage period of three months of six of total sixteen culture media. Results demonstrated that all analyzed media showed satisfactory productivity and selectivity, both immediately after production and after stored for three months. PALAVRAS-CHAVE: microbiologia; meios de cultura; controle de qualidade; alimentos. KEYWORDS: microbiology; culture media; quality control; foods. 1. INTRODUÇÃO A contaminação dos alimentos por microrganismos patogênicos é uma questão de saúde pública e os ensaios microbiológicos fornecem dados importantes para garantir a segurança e a qualidade dos alimentos que chegam à população. Diante disso, o controle de qualidade dos meios de cultura utilizados nos ensaios microbiológicas é de máxima importância para garantir maior confiabilidade dos resultados. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a produtividade e seletividade de dezesseis meios de cultura base, sólidos e líquidos, produzidos recentemente, após armazenamento de três meses e, no caso de meios sólidos distribuídos em placas de Petri, mês a mês durante três meses. A ISO 11133 (2014) recomenda a estocagem máxima de três a seis meses em refrigeração (meios base) e, no caso de meios distribuídos em placas, de no máximo quatro semanas. 2. METODOLOGIA Os meios seletivos, sólidos e líquidos, foram avaliados quanto à seletividade e à produtividade. Os meios não seletivos líquidos foram avaliados quanto à produtividade. Para meios seletivos utilizados
para isolamento e contagem de microrganismos utilizou-se o método semiquantitativo; para meios de detecção e isolamento utilizou-se o método qualitativo. Os microrganismos utilizados foram adquiridos de coleções de cultura ATCC American Type Culture Collection e NCTC National Collection of Type Cultures. A concentração aproximada de microrganismos foi ajustada até o ponto 0,5 da escala Nefelométrica de McFarland (aproximadamente 1,5 x 10 8 unidades formadoras de colônias por mililitro - UFC/mL). 2.1 Método semiquantitativo para meios sólidos baseado na ecometria Para verificar a produtividade e seletividade inoculou-se cepas alvo e não alvo no meio não seletivo ágar Triptona de Soja (TSA) e nos meios seletivos agares Baird Parker (BP), Bile Vermelho Violeta (VRBL), Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) e Manitol Gema de Ovo (MYP). As placas foram divididas em quadrantes. A suspensão bacteriana (entre 10 4 e 10 5 UFC), foi inoculada em cinco estrias paralelas, distantes 0,5 cm, no quadrante 1 e, em seguida, com o mesmo inóculo, nos quadrantes 2, 3 e 4, terminando com uma estria final em diagonal (Figura 1). Figura 1 - Estriamento para método semiquantitativo baseado na ecometria O Índice de Crescimento Absoluto (ICA) foi calculado designando o valor de 0,2 para cada estria na qual se observou crescimento e 1 para a estria central. O índice de crescimento absoluto é de, no máximo, 5. O Índice de crescimento relativo (ICR) para uma cepa é a razão entre o índice de crescimento absoluto do meio teste (ICA T ) e do meio de referência (ICA R ), ou seja, ICR= ICA T / ICA R 2.2 Método qualitativo para meios sólidos baseado no esgotamento Inoculou -se entre 10 5 e 10 6 UFC das cepas alvo e não alvo, estriando nos quatro quadrantes da placa contendo o ágar solidificado. Os meios testados foram: Levine Eosina Azul de Metileno (L-EMB), Oxford, MacConkey, Listeria Ottaviani & Agosti (ALOA), Rambach e Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). 2.3 Método semiquantitativo para meios líquidos seletivos Foram utilizados dois tubos com 10 ml do meio a ser testado. O tubo 1 foi inoculado com 10 1 a 10 2 UFC do microrganismo alvo e entre 10³ e 10 4 UFC do microrganismo não alvo. O tubo 2 foi inoculado com entre 10³ e 10 4 UFC do microrganismo não alvo. Os meios testados foram: Caldo E.coli (EC), Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB), Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) e Caldo Tetrationato Muller Kauffmann Novobiocina (MKTTn). Após a incubação, o crescimento foi avaliado inoculando-se 10 L do tubo 1 em placa contendo o meio de cultura seletivo para a cepa alvo e 10 L do tubo 2 em placa com o meio TSA. 2.4 Método qualitativo para meios líquidos não seletivos Inoculou-se entre 10 4 e 10 5 UFC da cepa alvo diretamente no meio líquido. O objetivo foi avaliar apenas a produtividade dos meios não seletivos Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI) e Tioglicolato (TGM), utilizados para o isolamento e conservação de microrganismos. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Avaliação dos meios logo após a produção
Método semiquantitativo para meios sólidos baseado na ecometria A seletividade e produtividade dos meios de cultura foram avaliadas pelo método da ecometria através do ICA e ICR. O critério de avaliação (Mossel, 1995) foi: Produtividade: para todas as cepas em um meio não seletivo o ICA R deve ser 3,5. Seletividade: para as cepas desejadas no meio seletivo o ICA T deve ser 3. O ICR deve ser 0,7 Todos os meios de cultura testados apresentaram boa produtividade e seletividade com os microrganismos utilizados. Os resultados obtidos são mostrados na tabela 1. Tabela 1 - Avaliação da produtividade e seletividade através do ICA e ICR Meio Microrganismo alvo ICA T ICA R (TSA) ICR BP Staphylococcus aureus 4,8 5 0,96 VRBL Escherichia coli 5 5 1 MYP Bacillus cereus 5 5 1 TSC Clostridium perfringens 4,6 4,8 0,95 O crescimento obtido nos meios MYP e TSA é mostrado na Figura 2. Figura 2 - B. cereus em meio de cultura TSA (esquerda) e MYP (direita) Método qualitativo para meios sólidos baseado no esgotamento A produtividade foi avaliada através do crescimento da cepa alvo e a seletividade pela inibição total ou parcial da cepa não alvo. O critério de avaliação (ISO 11133:2014) foi: 0 (zero) corresponde à inibição total (ausência de crescimento em todos os quadrantes); 1 corresponde a pouco crescimento (crescimento em dois quadrantes pelo menos); 2 corresponde a um bom crescimento (crescimento nos quatro quadrantes). Os meios de cultura ALOA, Oxford, MacConkey, L-EMB, Rambach e XLD apresentaram boa produtividade com crescimento nos quatro quadrantes. Em relação à seletividade, os microrganismos não alvo apresentaram inibição total no meio seletivo. Os resultados constam na tabela 2. Tabela 2 - Avaliação da produtividade e seletividade pelo método de esgotamento. Meio Microrganismo alvo N de Microrganismo não N de quadrantes alvo quadrantes ALOA Listeria monocytogenes 4 E. coli (0) Oxford L.monocytogenes 4 E. coli (0) MacConkey Escherichia coli 4 Enterococcus faecalis (0) L-EMB Escherichia coli 4 Bacillus cereus (0) Rambach Salmonella typhimurium 4 Staphylococcus aureus (0) XLD Salmonella typhimurium 4 Enterococcus faecalis (0) Método semiquantitativo para meios líquidos A produtividade foi indicada pela turvação e/ou formação de gás (meios utilizados com tubo de Durham) com os microrganismos alvo, e confirmada pelo crescimento após plaqueamento em meio seletivo, devendo apresentar crescimento de mais de 10 colônias características (ISO 11122:2014). A seletividade foi verificada através da não turvação e/ou liberação de gás nos tubos inoculados com microrganismo não alvo, e confirmada pela ausência de crescimento (inibição total) após plaqueamento em meio não seletivo (TSA), conforme mostrado na Tabela 3.
Tabela 3 - Avaliação da produtividade e seletividade de meios líquidos Meio Função Microrganismo Avaliação Crescimento MKTTn Produtividade Salmonella typhimurium Turvação XLD: >10 UFC Seletividade Enterococcus faecalis Sem turvação TSA: inibição total EC Seletividade Pseudomonas aeruginosa Sem turvação e gás TSA: inibição total VB Seletividade Enterococcus faecalis Sem turvação e gás TSA: inibição total LST Seletividade Enterococcus faecalis Sem turvação e gás TSA inibição total Método qualitativo para meios líquidos O critério de produtividade é a presença de turvação. A produtividade foi satisfatória nos meios BHI e TGM. A tabela 4 apresenta os resultados obtidos. Tabela 4 - Avaliação qualitativa da produtividade para meio líquidos Meio Função Microrganismo Avaliação BHI Produtividade S. aureus Turvação TGM Produtividade C. perfringens Turvação 3.2 Avaliação da produtividade e seletividade dos meios após estocagem A produtividade e seletividade dos meios sólidos seletivos utilizados para contagem BP, VRBL e MYP foram avaliadas pelo método da ecometria por três meses. Apresentaram boa produtividade: ICA maior que 3,5 e ICR maior que 0,7 (ver tabela 5). Meio Tabela 5 - Avaliação da produtividade através de ICA e ICR Microrganismo 1 mês 2 meses 3 meses alvo ICA T ICA R ICR ICA T ICA R ICR ICA T ICA R ICR BP S. aureus 5 5 1 4,8 5 0,96 4,8 4,8 1 VRBL E. coli 4,8 5 0,96 5 5 1 4 4,4 0,90 MYP B. cereus 5 5 1 4 4 1 3,2 3,6 0,89 *Meio de referência utilizado: TSA. A produtividade e a seletividade dos meios ALOA, OXFORD e L-EMB foram avaliadas pelo método de esgotamento por um período de três meses. Apresentaram boa produtividade (crescimento em todos os quadrantes estriados) e seletividade. Os resultados constam na Tabela 6. Tabela 6 Avaliação da produtividade e seletividade pelo método de esgotamento Meio N de quadrantes N de quadrantes com Microrganismo Microrganismo com crescimento crescimento alvo não alvo 1 m 2 m 3m 1 m 2 m 3m ALOA L. monocytogenes 4 4 4 E. coli (0) (0) (0) Oxford L. monocytogenes 4 4 3 E. coli (0) (0) (0) L-EMB E. coli 4 4 4 B. cereus (0) (0) (0) 4. CONCLUSÕES Na primeira etapa deste trabalho, concluiu-se através do controle de qualidade realizado em dezesseis meios de cultura, que os mesmos apresentaram um resultado final satisfatório quanto aos critérios de produtividade e seletividade. Na segunda etapa deste trabalho, conclui-se que, tanto os três meios avaliados pelo método da ecometria (BP, VRBL e MYP) quanto os três avaliados analisados pelo método de esgotamento (ALOA, Oxford e L-EMB), apresentaram boa produtividade e seletividade após três meses de estocagem.
5. REFERÊNCIAS INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of food, animal feed and water: Preparation, production, storage and performance testing of culture media, ISO 11133. Geneva, 2014. 93p. MOSSEL, D.A.A; CORRY, J.E.L; STRUIJK, C.B; BAIRD, R.M. Essentials of the Microbiology of Foods.1.ed. New York: Britsh Library, 1995. 699p.