Kit de Clonagem Flex-C Instruções de Uso DESCRIÇÃO O Kit de Clonagem Flex-C é altamente eficiente, rápido e de fácil uso para clonagem por PCR. A enzima Flex-C permite a clonagem direta de qualquer fragmento de PCR em qualquer vetor de expressão linearizado, em qualquer local e em uma única reação de 20 minutos. A aplicação do protocolo é simples. Os fragmentos de PCR podem ser gerados por polimerases de PCR (por exemplo, DNA Taq Polimerase) com primers que foram projetados para ter, pelo menos, 10 bases homólogas com as extremidades lineares dos vetores. Não é necessário tratamento adicional para o fragmento de PCR (como digestão de restrição, ligação, fosforilação, ou polimento das extremidades cegas). O vetor linearizado pode ser gerado pela PCR ou enzimas de restrição (simples ou dupla digestão). As enzimas do Flex-C unem precisamente e eficientemente os fragmentos de PCR aos vetores linearizados reconhecendo a sobreposição de 10bp (pares de bases) em suas extremidades. Este método permite a clonagem de múltiplos fragmentos em um único vetor em uma única reação, não necessitando subclonagem para criar a fusão de proteínas, para apagar e repor as sequências de DNA ou para inserir pontos de mutações. O Kit de Clonagem Flex-C é altamente eficiente, com taxa de inserção de 95%. O Kit de Clonagem Flex-C também contém a Taq DNA Polimerase e tampões de reação, bem como dntps para posterior rastreamento de clones de PCR. CARACTERTÍSTICAS PRINCIPAIS Clona qualquer inserção, em qualquer local e vetor Enzimas de restrição, fosfatase e sistema de ligase livre Junção de múltiplos fragmentos de uma só vez Amplo tamanho de PCRde até 10kb Bom para extremidades 5, extremidades 3, extremidades cegas Inserção precisa na orientação desejada Altamente eficiente, com >95% de clones positivos Aplicações múltiplas: o Adição de adaptador, vinculador e marcador antes ou depois da inserção o Geração de mutação o Síntese de gene Aplicação de alto rendimento Componentes MEPL01 MEPL01-S Enzima de Clonagem Flex-C 20 app (40μl) 5app (10μl) Taq DNA Polimerase 500u 50u Tampão Vi A 10X 2ml 1ml Tampão Vi S 10X 1ml 1ml MgCl 2 50nM 1ml 1ml dntps mix 10nM 0,25ml 0,025ml Água livre de nuclease 1ml 1ml 1
Armazenamento: armazenar a -20 C Armazenamento do Tampão Taq DNA polimerase: 20mM Tris-HCl (ph8.0 a 22 C), 100mM KCl, 0,5% Tween TM 20, 0,5% Nonidet-P40, EDTA0,1mM EDTA, 1mM DTT e 50% glicerol. Tampão Vi A 10X:500mM KCL, 100mM Tris-HCl (ph9,2 a 20 C) e 0,1% Triton TM X-100. Tampão Vi S 10X: (NH4)2SO4160mM (NH4)2SO4, 500mM Tris-HCl (ph9,2 a 22 C), 17,5mM MgCl 2 e 0,1% Triton TM X-100. Itens adicionais (não fornecidos com o kit): Primers de genes específicos com 10bp homólogas às extremidades do vetor. Vetor linearizado. Células competentes. Placas LB contendo antibiótico apropriado. VISÃO GERAL DO PROTOCOLO PREPARO DO VETOR LINEARIZADO Um vetor linearizado pode ser gerado por PCR ou pela digestão da enzima de restrição (digestão única ou dupla). A digestão completa de um vetor é essencial para conseguir alta eficiência de clonagem. É recomendada a purificação do vetor linearizado pelo método de recuperação de DNA em gel. Devido às diferenças na eficiência das digestões, diferentes enzimas de restrição irão gerar diferentes montantes de impurezas. É recomendado que o usuário realize dupla digestão 2
para reduzir a oportunidade de autoligação do vetor. O usuário pode aumentar o tempo de incubação (para 4 horas ou da noite para o dia, dependendo das propriedades das enzimas) para uma reação de digestão mais completa. O usuário pode testar a impureza, transformando 10-50ng de vetor purificado e linearizado em células competentes. Se a impureza for alta, realizar a digestão usando mais enzimas de restrição ou prolongando o período de incubação. PROJETO DO PRIMER O projeto do primer é crucial para o sucesso da reação de clonagem. O usuário pode clonar dois ou mais fragmentos em qualquer vetor linearizado, contanto que compartilhem 10 bases homólogas em cada extremidade. Os primers devem ser projetados de acordo com o seguinte: 1. A extremidade 5 do primer DEVE conter 10 bases homólogas para 10 bases na extremidade do fragmento de DNA ao qual ele irá se juntar (não incluindo o sítio de restrição). Isso pode ser o vetor ou outra inserção. 2. A extremidade 3 do primer DEVE conter a sequência específica do gene. Pode ser projetado para usar de 18-20 bases com conteúdo GC 40-60% 3. A temperatura de fusão é calculada com base na sequência 3 gene específica do primer ao invés da sequência inteira do primer. 4. Evitar sequências complementares dentro e entre os primers. Ter como referência os desenhos abaixo para projetar os primers. 1. Vetor linearizado com a extremidade 5 Figura 1: Projeto de primer com sítio de enzimas de restrição gerando extremidades 5. 3
2. Vetor linearizado com a extremidade 3 Figura 2: Projeto de primer com sítio de enzimas de restrição gerando extremidades 3. 3. Vetor linearizado com extremidades cegas Figura 3: Projeto de primer com sítio de restrição das enzimas de restrição gerando extremidades cegas. Os primers acima são projetados com um sítio de restrição das enzimas de restrição gerando extremidades 5 (figura1), extremidades 3 (figura2) e extremidades cegas (figura 3). 4
Os sítios de restrição estão destacados em vermelho e X representa as bases correspondentes às sequências de genes específicas. As 10 bases homólogas referem-se à sequência de vetores que são adjacentes aos sítios de restrição. CONSIDERAÇÕES SOBRE O PRODUTO DA PCR 1. Recomendamos autilização da Taq DNA Polimerase ou de polimerase com alta fidelidade semelhante para a amplificação do gene de interesse. 2. Purificar o produto da PCR pelo método de recuperação de DNA em gel para remover bandas indesejadas. PROCEDIMENTO DE CLONAGEM 1. Preparar a mistura de reação como segue: Vetorlinearizado (50-200ng) 2µl Produto de PCR purificado (20-200ng) µl* Mix de enzimaflex-c 2µl Agua livre de nuclease Completaraté 10µl Volume total 10µl *A Razão molar recomendada para o vetor é de 1:3. Em geral, 1:5 para 3:1 da relação vetor e insertoproduz bons resultados. 2. Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos e depois no gelo por 10 minutos. 3. Proceder para a transformação. Recomenda-se o uso de células competentes comerciais. 4. Plaquear as células em placas LB contendo antibióticos apropriados para a clonagem do vetor, incubando todas as placas durante a noite a 37 C 5. Realizar o rastreamento por PCR ou com enzima de restrição para determinar a presença da inserção. 5
SOLUÇÃO DE PROBLEMAS Problema Causa possível Solução Poucas ou nenhuma colônia obtida pela transformação. Colônias não possuem inserções. Colônias que contêm inserções incorretas. Baixa qualidade das células competentes. Sequência incorreta do primer. Antibióticos errados foram usados, ou excesso dos antibióticos. Baixa qualidade de produto da PCR. Contaminantes inibidores do produto da PCR ou do vetor linearizado. Transformação com excesso de mistura de reação. Linearização do vetor incompleta. Contaminação de outros plasmídios com a mesma resistência ao antibiótico. A inserção contém sequências inespecíficas. Testar a eficiência da transformação usando um plasmídio de DNA superenrolado. Verificaras sequências de primers que incluam 10 bases homólogas nas extremidades do vetor. Usar placas com a quantidade apropriada de antibióticos. Usar diferentes métodos de purificação. Ambos o produto da PCR e o vetor linearizado devem ser purificados. Não adicionar mais de que 10µl de uma reação de mistura para 50µl de células competentes. Mistura de reação em excesso inibe a transformação. Certificar-se de que o vetor está completamente digerido e purificado pelo método de recuperação de DNA em gel. Refazer o processo, se necessário. Se a inserção foi amplificada de um plasmídio, pode ter sido carregado o DNA circular através da purificação,contaminando a reação de clonagem. É recomendado purificar o produto da PCR ou DNA molde linearizado por gel. Se o produto da PCR não for uma banda única, purifique a inserção correta por gel. 6
INFORMAÇÕES E CONTATOS DO DISTRIBUIDOR Biometrix Rua Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba - PR - CEP: 82840-360 Tel.: (41) 2108-5250 Fax: (41) 2108-5252 DDG: 0800 726 0504 E-mail: biometrix@biometrix.com.br Site: www.biometrix.com.br INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Vivantis Technologies SdnBhd 587389-D Revongen Corporation Center Nº 12A, Jalan TP5, Taman Perindustrian UEP 47600 Subang Jaya, Selangor Darul Ehsan, Malaysia E-mail: info@vivantechnologies.com Site: www.vivantechnologies.com Tel.: +6 03 8025 1603 Fax: +6 03 8025 1637/1354 RESPONSÁVEL TÉCNICA Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR: 09302336 Aprovação: 21/01/2014 X Renata Morishita Laboratório Assinado por: Renata Morishita 7