Avaliação da qualidade de produtos à base de Trichoderma

Avaliação da qualidade de produtos à base de Trichoderma 18 a 20 de setembro de 2012 Embrapa Meio Ambiente - Jaguariúna, SP

IV CURSO TEÓRICO E PRÁTICO Avaliação da qualidade de produtos à base de Trichoderma Trichoderma é o principal agente de biocontrole de doenças de plantas comercializado no Brasil. A maioria dos produtos comerciais à base de Trichoderma está em processo de registro no MAPA. Com isso, surgiu a necessidade de padronizar as metodologias para a avaliação da qualidade desses produtos, tanto para o setor de qualidade das biofábricas quanto para os órgãos de fiscalização. Assim, no âmbito do projeto Qualibio foram desenvolvidas metodologias para realizar essas avaliações, com a participação da Embrapa Meio Ambiente, Embrapa Arroz e Feijão, Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais - Epamig/Viçosa, Instituto Biológico - IB, Ceplac/Cepec e Universidade Federal de Pelotas UFPel. Essas metodologias estão sendo transferidas à sociedade por meio do Curso Teórico e Prático Avaliação da qualidade de produtos à base de Trichoderma. Até o momento foram realizados dois cursos na Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna-SP e um na Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG, com retorno positivo dos participantes, que já estão utilizando as metodologias como rotina nos laboratórios. O uso das metodologias padronizadas está auxiliando na promoção e legalização dos produtos, bem como em garantir a sua qualidade e 1

efetividade, repercutindo na melhoria dos produtos biológicos nacionais e consequentemente aumentando seu mercado consumidor. PROGRAMAÇÃO 18/09/2012 8:30h Abertura Wagner Bettiol 9:00h - Importância da padronização de metodologias para avaliação da conformidade de produtos contendo agentes de biocontrole Marcelo A. B. Morandi 9:30h Aspectos gerais sobre Trichoderma como agente biológico para o controle de doenças de plantas Cleusa M. M. Lucon 10:30h coffee break 11:00h Metodologias para quantificação de Trichoderma para formulados em pó-molhável, esporos concentrados e grânulos Zayame Vegette Pinto 12:00h - Almoço 14:00h Preparo e execução das metodologias para a análise qualiquantitativa de produtos comerciais a base de Trichoderma spp. Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely Nascimento,Patrícia E. Haddad. 15:30h- coffee break 16:00h - Continuação do preparo e execução das metodologias para a análise quali-quantitativa de produtos comerciais a base de Trichoderma spp. Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad. 19/09/2012 8:00h Leitura do número de esporos ativos e germinados ao microscópio óptico Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad. 10:30h coffe break 2

11:00h- Contagem do número de esporos ao microscópio óptico - Cleusa M. M. Lucon, Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad. 12:00h - Almoço 14:00h - Identificação molecular e morfológica de Trichoderma Ricardo HaraKava. 15:30h- coffe-break 16:00h - Preservação de isolados de Trichoderma Cleusa M. M. Lucon e Zayame V. Pinto 16:00h Avaliação de contaminantes presentes em produtos a base de Trichoderma - Cleusa M. M. Lucon e Zayame V. Pinto 20/09/2012 09:00h Avaliação do teste de microgotas - Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad. 10:00h Determinação do número de UFC de Trichoderma. Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad. 10:30h - coffe-break 11:00h Análise dos resultados e discuusão Wagner Bettiol, Marcelo A. B. Morandi, Zayame Vegette e Cleusa M. M. Lucon. 13:00h Almoço e visita a casa de vegetação onde Trichoderma é utilizado em larga escala. 17:00h - Encerramento 3

ÍNDICE I. METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-MOLHÁVEL, GRÂNULOS DISPERSÍVEIS E SUSPENSÃO CONCENTRADA. I. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS I.II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS PORCENTAGEM DE CONÍDIOS VIÁVEIS I. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA II METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-DE-ESPORO. II. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS II. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS PORCENTAGEM DE CONÍDIOS VIÁVEIS II. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA 4

I. METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-MOLHÁVEL, GRÂNULOS DISPERSÍVEIS E SUSPENSÃO CONCENTRADA. I. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS 1. PRINCÍPIO Este é um método quantitativo em que o resultado é expresso em número de conídios por massa ou volume de produto biológico formulado. Tem como base a preparação de suspensão de conídios de Trichoderma e contagem do número de conídios com auxilio de uma Câmara de Neubauer (hemacitômetro) ao microscópio óptico. 2. APLICAÇÃO Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma. 3. AMOSTRAGEM A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada, contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo, número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser analisado. 4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS - Erlenmeyer com capacidade para 250 ml; - Tubos de ensaio de 25 ml; - Estante para tubos de ensaio; 5

- Autoclave; - Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g; - Agitador de tubo de ensaio; - Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 khz; - Agitador orbital para Erlenmeyer; - Micropipeta de 10 ml e 1000 µl; - Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 ml e 1000 µl; - Câmara de Neubauer (ou hemacitômetro); - Microscópio óptico; - Contador manual; - Agitador magnético; - Barra magnética. 5. SOLUÇÕES Solução salina com Tween 80 (diluente): Ingredientes: - NaCl P.A.: 9,0 g; - Água destilada: 1000 ml; -Tween 80: 1 ml. Preparo: Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 ml de água destilada e acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e 1 atm por 20 minutos. Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes de serem utilizadas. 6. PROCEDIMENTO 6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a 40 minutos antes do início da análise. 6.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 ml e completar com 90 g do diluente (corresponde à diluição 10-1 ). Devem ser realizadas duas pesagens para cada amostra e uma série de diluição para cada pesagem. A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratação. 6

6.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90 rpm. 6.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no Erlenmeyer. 6.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das passagens. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos. 6.6 Transferir 1,0 ml da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1 ), com auxílio de micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 ml de diluente (10-2 ). Descartar a ponteira em seguida. 6.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das passagens. 6.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 6.6 e 6.7 (diluição seriada), utilizando o tubo da diluição anterior (10-2 ). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a ponteira da micropipeta. Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o contagem do número de conídios, de acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto. Concentração de conídios* Diluição para contagem 10 9 10-4 10 8 10-3 *Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas diluições e escolher para contagem a que apresentar mais do que 10 conídios por subcompartimento da câmera de Neubauer, conforme observação ao microscópio óptico. 6.9 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o turbilhonamento; 6.10 Retirar imediatamente uma alíquota representativa da suspensão com auxílio de uma micropipeta; 7

6.11 Colocar a suspensão na canaleta da câmara de Neubauer, já coberta com a lamínula, até o preenchimento de todo o espaço existente entre a lamínula e a câmara de Neubauer; 6.12 Antes de iniciar a contagem, deixar a câmara de Neubauer com a suspensão de conídios em repouso por 5 minutos, para que os conídios precipitem, facilitando a contagem e reduzindo erros; 6.13 Realizar a contagem de conídios ao microscópio óptico, no aumento de 250X ou 400X, nos campos 1 e 2 da câmara de Neubauer (Figura 1), nos cinco quadrados (subcompartimentos) como demarcados na Figura 2, totalizando cinco contagens por campo da câmara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5). Observação: Muitos conídios ficam exatamente sobre as linhas de demarcação internas dos subcompartimentos. Recomenda-se contar apenas os conídios que estiverem nas linhas da esquerda e superior do mesmo campo da observação para evitar que eles sejam contados duas vezes. Campo 1 Campo 2 Figura 1. Localização dos campo 1 e 2 na câmara de Neubauer. 8

E1 E2 E5 E3 E4 Figura 2. Área dentro dos subcompartimentos vermelhos para contagem de conídios de Trichoderma- E1, E2, E3, E4 e E5. 7. CÁLCULO DO NÚMERO DE CONÍDIOS Para determinar o número de conídios utilizar a fórmula a seguir para cada repetição: Conídios/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 10 5 } Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 Quando utilizada a diluição 10-3, multiplica-se o resultado por 10 3 e, quando utilizada a diluição 10-4, por 10 4. Observação: O software CALIBRA, desenvolvido no âmbito do projeto Qualibio, está disponível para cópia no site www.cnpma.embrapa.br. Esse software realiza os cálculos e armazena as informações para a emissão de laudos. A sugestão é que o software seja sempre utilizado, para uma maior facilidade e precisão nas análises. 8. REPETIÇÃO 9

Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser realizada uma série de diluição seriada. A diluição selecionada, deve-se colocar na câmara de Neubauer para contagem. Figura 3. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade de produtos à base de Trichoderma. 9. PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas. 10. LIMPEZA Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%. 10

I. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS PORCENTAGEM DE CONÍDIOS VIÁVEIS 1. PRINCÍPIO Este é um método quantitativo onde o resultado é expresso em porcentagem de conídios viáveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alíquota da suspensão de conídios de Trichoderma em áreas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata, Dextrose e Agar (BDA), incubação em temperatura adequada para a germinação dos conídios e contagem do número de conídios viáveis ao microscópio óptico. 2 APLICAÇÃO Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma. 3 AMOSTRAGEM A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada, contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo, número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser analisado. 4 EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS - Erlenmeyer com capacidade para 250 ml; - Tubos de ensaio de 25 ml; - Estante para tubos de ensaio; - Autoclave; - Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g; - Agitador de tubo de ensaio; - Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 khz; - Agitador orbital para Erlenmeyer; - Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD); - Micropipeta de 10 ml, 15 µl e 1000 µl; - Ponteiras esterilizadas para micropipeta de 10 ml, 15 µl e 1000 µl; 11

- Placas de Petri descartável esterilizadas; - Agitador magnético; - Barra magnética. 5 SOLUÇÕES Solução salina com Tween 80 (diluente): Ingredientes: - NaCl P.A.: 9,0 g; - Água destilada: 1.000 ml; -Tween 80: 1 ml Preparo: Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 ml de água destilada e acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e a 1 atm por 20 minutos. Azul de Lactofenol Ingredientes: - Fenol: 20 g; - Ácido lático: 20 g; - Água destilada: 20 g; - Glicerol: 40 g; - Azul de metila (ou azul de algodão ou azul de Trypan): 0,1 g Preparo: Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador magnético dentro de capela de exaustão de gases. 6. MEIO DE CULTURA Meio de Batata Dextrose Agar (BDA): Ingredientes: -Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante; -Água destilada: 1000 ml; Preparo: Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 ml do meio por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condição de 12

esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8 C) por sete dias. Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes de serem utilizadas. 7. PROCEDIMENTO 7.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a 40 minutos antes do início da análise. 7.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 ml e completar com 90 g do diluente (corresponde à diluição 10-1 ). Devem ser realizadas duas pesagens para cada amostra e uma série de diluição para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratação. 7.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90 rpm. 7.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no Erlenmeyer. 7.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos. 7.6 Transferir 1,0 ml da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1 ), com auxílio de micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 ml de diluente (10-2 ). Descartar a ponteira em seguida. 7.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das passagens. 7.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 7.6 e 7.7 (diluição seriada), utilizando o tubo da diluição anterior (10-2 ). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a ponteira da micropipeta. 13

Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o teste de viabilidade de conídios, de acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto. Concentração de conídios Diluição 10 9 10-4 10 8 10-3 *Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas diluições e escolher para contagem a que obtiver melhor visualização dos conídios, conforme observação ao microscópio óptico. 7.9 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o turbilhonamento. 7.10 Pipetar imediatamente cinco vezes de 15 µl da diluição apropriada em placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar (Figura 1). Repetir este passo para mais uma placa. Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcações e os 15 µl da suspensão para análise da viabilidade porcentagem de conídios viáveis. 7.11 Transferir as placas em BOD a 25 ± 2º C, no escuro. 7.12 Após iniciar a germinação (apresenta variação de 9 a 20 h após o plaqueamento em função do produto) em uma das placas, colocar uma gota de azul de lactofenol (8 µl) em cada ponto (local onde foi colocada a diluição apropriada) com a suspensão (cinco pontos por placa) (Figura 1). 14

7.13 Avaliar a viabilidade usando microscópio óptico no aumento de pelo menos 400x. 7.14 O conídio é considerado viável, quando estiver ativo ou germinado (Figura 2 - Glossário). 7.15 Contar os conídios viáveis e não viáveis nos cinco pontos. Contar pelo menos 100 conídios por ponto. 7.16 Se necessário, fazer nova avaliação na segunda placa, seguindo o item 7.10 a 7.13. 7.17 Calcular a taxa média de viabilidade utilizando a fórmula: Viabilidade (%)=(média do número de conídios viáveis das pesagens/total de conídios) X 100 Deve ser realizado o cálculo para cada gota de cada pesagem de cada diluição, separadamente. Posteriormente, obter a média aritmética de cada pesagem. Conídio germinado Conídio ativo não germinado Conídio inativo Figura 2. Vista dos conídios de Trichoderma viáveis (germinados e ativos não germinados) ou inativos em microscópio óptico, após 14 horas de incubação. 8. REPETIÇÃO Devem ser feitas duas pesagens do produto (7.2), sendo que de cada pesagem deve ser realizada uma diluição seriada (itens 7.6 e 7.8). Da diluição selecionada, deve-se colocar cinco gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.10 e Figura 1). 15

Figura 3. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade de produtos à base de Trichoderma. 9. PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas. 10. LIMPEZA Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%. 11. GLOSSÁRIO Conídio: estrutura não sexual de reprodução de fungos. Conídio ativo ou em processo de germinação: o conídio que aumentou de tamanho em relação ao não germinado, mas que ainda não emitiu tubo germinativo. 16

Conídio germinado: o conídio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do conídio. Conídios inativos: conídios não viáveis. Conídios não germinados: conídios que podem ou não estar viáveis, porém não formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do conídio. Conídios viáveis: são os conídios ativos e os germinados. Conidióforo: estrutura do fungo produtora de conídios. Grânulos: tipo de formulação de produto biológico em forma de grânulos que se desfazem na presença de água. Pó-molhável: tipo de formulação de produto biológico composta pelo ingrediente ativo e inerte que permita a mistura com água, formando suspensões dotadas de grande estabilidade. I. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA 1 PRINCÍPIO Este é um método quantitativo, onde o resultado é expresso em unidades formadoras de colônia (UFC/mL). Tem como base a homogeneização do produto biológico com o diluente esterilizado (solução salina com adição de Tween 80). A partir dela é realizado diluições decimais, as quais são distribuídas em placas sobre meio BDA com Triton e incubadas a 25 ± 2 C no escuro para posterior contagem do número de colônias formadas pelo Trichoderma. 2 APLICAÇÃO Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma. 3 AMOSTRAGEM A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada, contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo, número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem 17

ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser analisado. 4 EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS - Erlenmeyer com capacidade para 250 ml; - Tubos de ensaio de 25 ml; - Estante para tubos de ensaio; - Autoclave; - Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g; - Agitador de tubo de ensaio; - Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 khz; - Agitador orbital para Erlenmeyer; - Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD); - Micropipeta para 10 ml, 20 µl, 100 µl e 1000 µl; - Ponteiras estéreis para micropipeta de 10 ml, 20 µl, 100 µl e 1000 µl; - Placas de Petri descartável esterilizada; - Alça de Drigalski esterilizada; - Agitador magnético; - Barra magnética; - Microscópio óptico; - Lâmina de microscopia e fita adesiva transparente. 5 SOLUÇÕES Solução salina com Tween 80 (diluente): Ingredientes: - NaCl P.A.: 9,0 g; - Água destilada: 1000mL; -Tween 80: 1mL. Preparo: Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 ml de água destilada e acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e 1 atm por 20 minutos. 6 - MEIO DE CULTURA Meio de Batata Dextrose Agar (BDA): Ingredientes: 18

-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante; -Água destilada: 1000 ml; Preparo: Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 ml do meio por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8 C) por sete dias. Meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton (BDA + T): Ingredientes: -Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante; -Água destilada: 1000 ml; -Triton X-100: 25 g; Preparo: O modo de preparo do meio deve seguir a recomendação do fabricante. Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada e Triton X-100 (redutor de colônia) ao meio de Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 20 ml por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8 C) por sete dias. Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes de serem utilizadas. 7 PROCEDIMENTO 7.1 TESTE DE MICROGOTAS: 7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a 40 minutos antes do início da análise. 7.1.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 ml e completar com 90 g do diluente (corresponde à diluição 10-1 ). Devem ser realizadas duas pesagens para cada amostra e duas séries de diluições para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratação. 19

7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90 rpm. 7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no Erlenmeyer. 7.1.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos. 7.1.6 Transferir 1,0 ml da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1 ), com auxílio de micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 ml de diluente (10-2 ). Descartar a ponteira em seguida. 7.1.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das passagens. 7.1.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 7.1.6 e 7.1.7 (diluição seriada), utilizando o tubo da diluição anterior (10-2 ). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a ponteira da micropipeta. Tabela 1. Máximo de diluição seriada que deve ser realizado para obtenção da diluição apropriada. Informação do fabricante Diluir até 10 5 10-6 10 6 10-7 10 7 10-8 10 8 10-9 10 9 10-10 10 10 10-11 10 11 10-12 10 12 10-13 7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA, dividindo-as em 4 quadrantes. 7.1.10 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o turbilhonamento. 20

7.1.11 Pipetar imediatamente três alíquotas de 20 µl de cada diluição preparada para a superfície do meio de BDA de cada um dos quadrantes, conforme representado na Figura 1. Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes com três alíquotas de 20µL da diluição seriada referente a marcação da placa. 7.1.12 Os tubos com as diluições devem ser guardados sobre refrigeração (2-8 C) por no máximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colônia; 7.1.13 Esperar para que os 20µL de cada diluição sejam absorvidos no meio de cultura e transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 ± 2 C, no escuro, antes de continuar o procedimento; 7.1.14 Observar quais as diluições houve o crescimento de colônias de Trichoderma e selecionar as três últimas diluições que apresentaram o crescimento do fungo nas três gotas das duas pesagens realizadas para a realização do teste de unidade formadora de colônia. 7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA (UFC): 7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluições seriadas da refrigeração por 30 a 40 minutos antes do início da análise. 7.2.2 Misturar o conteúdo dos tubos de cultura com as diluições escolhidas em agitador para tubos de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o turbilhonamento; 7.2.3 Transferir de cada diluição apropriada, com uma micropipeta estéril, 100µL para a superfície de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton; 7.2.4 A diluição é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio com uma alça de Drigalski esterilizada, imediatamente após a transferência. Para cada grupo de cinco placas utilizar uma alça de Drigalski. 21

7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100µL da solução salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton com alça de Drigalski esterilizada; 7.2.6 Incubar as culturas a 25 ± 2º C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o número de colônias crescidas; 7.2.7 Incubar em BOD a 25 ± 2º C, no escuro, novamente as culturas até 7 dias para verificar se as colônias formadas são realmente de Trichoderma, por meio da visualização da colônia na placa e das estruturas do fungo em microscópio óptico. 7.2.8 Para observar em microscópio óptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colônia desenvolvida na placa de Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lâmina de microscopia, com o lado adesivo sobre a lâmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidióforos e conídios) em microscópio óptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a estrutura observada é de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificação de fungos, como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS Press, 1998. 8 - REPETIÇÃO Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem deve ser realizada uma diluição seriada (item 7.1.6). Das três diluições selecionadas, deve-se plaquear no mínimo cinco repetições por diluição (7.2.3). 22

Figura 2. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade de produtos à base de Trichoderma. 9 CONTAGEM DE COLÔNIAS Fazer a contagem do número de unidades formadoras de colônias, por placa, no tempo de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a fórmula: UFC/mL= número médio de colônias nas placas X diluição escolhida da amostra X 10* * este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100µL de suspensão. Observação: Ideal é que cada placa tenha de 30 a 300 colônias. 10 - PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas. 11. LIMPEZA 23

Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%. 24

II METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-DE-ESPORO. II. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS 1. PRINCÍPIO Este é um método quantitativo em que o resultado é expresso em número de conídios por massa ou volume de produto biológico formulado. Tem como base a preparação de suspensão de conídios de Trichoderma e contagem do número de conídios com auxilio de uma Câmara de Neubauer (hemacitômetro) ao microscópio óptico. 2. APLICAÇÃO Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma. 3. AMOSTRAGEM A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada, contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo, número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser analisado. 4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS - Erlenmeyer com capacidade para 250 ml; - Tubos de ensaio de 25 ml; - Estante para tubos de ensaio; - Autoclave; 25

- Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g; - Agitador de tubo de ensaio; - Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 khz; - Agitador orbital para Erlenmeyer; - Micropipeta de 10 ml e 1000 µl; - Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 ml e 1000 µl; - Câmara de Neubauer (ou hemacitômetro); - Microscópio óptico; - Contador manual; - Agitador magnético; - Barra magnética. 5. SOLUÇÕES Solução salina com Tween 80 (diluente): Ingredientes: - NaCl P.A.: 9,0 g; - Água destilada: 1000 ml; -Tween 80: 1 ml. Preparo: Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 ml de água destilada e acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e 1 atm por 20 minutos. Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes de serem utilizadas. 6. PROCEDIMENTO 6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a 40 minutos antes do início da análise. 6.2 Pesar 0,1g do produto em erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9 g com solução salina com Tween a 0,1 % (corresponde às diluição 10-3 ). Devem ser realizadas duas pesagens para cada amostra e uma série de diluição para cada pesagem. A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratação. 6.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90 rpm. 26

6.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no Erlenmeyer. 6.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das passagens. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos. 6.6 Transferir 1,0 ml da suspensão contida no Erlenmeyer (10-3 ), com auxílio de micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 ml de diluente (obter a suspensão 10-4 ). Descartar a ponteira em seguida. Utilizar para a contagem a diluição apropriada segundo a Tabela 1. 6.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das passagens. Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o contagem do número de conídios, de acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto. Concentração de conídios* Diluição para contagem 10 9 10-4 < 10 8 10-3 *Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas diluições e escolher para contagem a que apresentar mais do que 10 conídios por subcompartimento da câmera de Neubauer, conforme observação ao microscópio óptico. 6.8 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o turbilhonamento; 6.9 Retirar imediatamente uma alíquota representativa da suspensão com auxílio de uma micropipeta; 6.10 Colocar a suspensão na canaleta da câmara de Neubauer, já coberta com a lamínula, até o preenchimento de todo o espaço existente entre a lamínula e a câmara de Neubauer; 6.11 Antes de iniciar a contagem, deixar a câmara de Neubauer com a suspensão de conídios em repouso por 5 minutos, para que os conídios precipitem, facilitando a contagem e reduzindo erros; 27

6.12 Realizar a contagem de conídios ao microscópio óptico, no aumento de 250X ou 400X, nos campos 1 e 2 da câmara de Neubauer (Figura 1), nos cinco quadrados (subcompartimentos) como demarcados na Figura 2, totalizando cinco contagens por campo da câmara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5). Observação: Muitos conídios ficam exatamente sobre as linhas de demarcação internas dos subcompartimentos. Recomenda-se contar apenas os conídios que estiverem nas linhas da esquerda e superior do mesmo campo da observação para evitar que eles sejam contados duas vezes. Campo 1 Campo 2 Figura 1. Localização dos campo 1 e 2 na câmara de Neubauer. E1 E2 E5 E3 E4 Figura 2. Área dentro dos subcompartimentos vermelhos para contagem de conídios de Trichoderma- E1, E2, E3, E4 e E5. 28

7. CÁLCULO DO NÚMERO DE CONÍDIOS Para determinar o número de conídios utilizar a fórmula a seguir para cada repetição: Conídios/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 10 5 } Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 Para obter a concentração do produto original, o resultado obtido deve ser multiplicado pela diluição utilizada. Quando utilizada a diluição 10-3, multiplica-se o resultado por 10 3 e, quando utilizada a diluição 10-4, por 10 4. O resultado final será a média das 4 repetições. Observação: O software CALIBRA, desenvolvido no âmbito do projeto Qualibio, está disponível para cópia no site www.cnpma.embrapa.br. Esse software realiza os cálculos e armazena as informações para a emissão de laudos. A sugestão é que o software seja sempre utilizado, para uma maior facilidade e precisão nas análises. 8. REPETIÇÃO Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser realizada uma série de diluição seriada. A diluição selecionada, deve-se colocar na câmara de Neubauer para contagem. 29

Figura 3. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade de produtos à base de Trichoderma. 9. PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas. 10. LIMPEZA Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%. II. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS PORCENTAGEM DE CONÍDIOS VIÁVEIS 30

1. PRINCÍPIO Este é um método quantitativo onde o resultado é expresso em porcentagem de conídios viáveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alíquota da suspensão de conídios de Trichoderma em áreas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata, Dextrose e Agar (BDA), incubação em temperatura adequada para a germinação dos conídios e contagem do número de conídios viáveis ao microscópio óptico. 2 APLICAÇÃO Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma. 3 AMOSTRAGEM A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada, contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo, número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser analisado. 4 EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS - Erlenmeyer com capacidade para 250 ml; - Tubos de ensaio de 25 ml; - Estante para tubos de ensaio; - Autoclave; - Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g; - Agitador de tubo de ensaio; - Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 khz; - Agitador orbital para Erlenmeyer; - Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD); - Micropipeta de 10 ml, 15 µl e 1000 µl; - Ponteiras esterilizadas para micropipeta de 10 ml, 15 µl e 1000 µl; - Placas de Petri descartável esterilizadas; - Agitador magnético; 31

- Barra magnética. 5 SOLUÇÕES Solução salina com Tween 80 (diluente): Ingredientes: - NaCl P.A.: 9,0 g; - Água destilada: 1.000 ml; -Tween 80: 1 ml Preparo: Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 ml de água destilada e acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e a 1 atm por 20 minutos. Azul de Lactofenol Ingredientes: - Fenol: 20 g; - Ácido lático: 20 g; - Água destilada: 20 g; - Glicerol: 40 g; - Azul de metila (ou azul de algodão ou azul de Trypan): 0,1 g Preparo: Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador magnético dentro de capela de exaustão de gases. 6 - MEIO DE CULTURA Meio de Batata Dextrose Agar (BDA): Ingredientes: -Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante; -Água destilada: 1000 ml; Preparo: Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 ml do meio por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8 C) por sete dias. 32

Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes de serem utilizadas. 7 PROCEDIMENTO 7.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a 40 minutos antes do início da análise. 7.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9 g com solução salina com 0,1% (corresponde às diluições 10-3 ). Devem ser realizadas duas pesagens para cada amostra e duas séries de diluições para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratação. 7.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90 rpm. 7.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no Erlenmeyer. 7.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos. 7.6 Transferir 1,0 ml da suspensão contida no Erlenmeyer (10-3 ), com auxílio de micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 ml de diluente (10-4 ). Descartar a ponteira em seguida. Escolher a diluição apropriada segundo a Tabela 1. 7.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das passagens. Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o teste de viabilidade de conídios, de acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto. Concentração de conídios Diluição 10 9 10-4 < 10 8 10-3 *Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas diluições e escolher para contagem a que obtiver melhor visualização dos conídios, conforme observação ao microscópio óptico. 33

7.8 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o turbilhonamento. 7.9 Pipetar imediatamente cinco vezes de 15 µl da diluição apropriada em placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar (Figura 1). Repetir este passo para mais uma placa. Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcações e os 15 µl da suspensão para análise da viabilidade porcentagem de conídios viáveis. 7.10 Transferir as placas em BOD a 25 ± 2º C, no escuro. 7.11 Após iniciar a germinação (apresenta variação de 9 a 20 h após o plaqueamento em função do produto) em uma das placas, colocar uma gota de azul de lactofenol (8 µl) em cada ponto (local onde foi colocada a diluição apropriada) com a suspensão (cinco pontos por placa) (Figura 1). 7.12 Avaliar a viabilidade usando microscópio óptico no aumento de pelo menos 400x. 7.13 O conídio é considerado viável, quando estiver ativo ou germinado (Figura 2 - Glossário). 7.14 Contar os conídios viáveis e não viáveis nos cinco pontos. Contar pelo menos 100 conídios por ponto. 7.15 Se necessário, fazer nova avaliação na segunda placa, seguindo o item 7.10 a 7.13. 7.16 Calcular a taxa média de viabilidade utilizando a fórmula: 34

Viabilidade (%)=(média do número de conídios viáveis das pesagens/total de conídios) X 100 Deve ser realizado o cálculo para cada gota de cada pesagem de cada diluição, separadamente. Posteriormente, obter a média aritmética de cada pesagem. Conídio germinado Conídio ativo não germinado Conídio inativo Figura 2. Vista dos conídios de Trichoderma viáveis (germinados e ativos não germinados) ou inativos em microscópio óptico, após 14 horas de incubação. 8 - REPETIÇÃO Devem ser feitas duas pesagens do produto (7.2), sendo que de cada pesagem deve ser realizada uma diluição seriada (itens 7.6). Da diluição selecionada, deve-se colocar cinco gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.9 e Figura 1). 35

Figura 3. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade de produtos à base de Trichoderma. 9 - PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas. 10. LIMPEZA Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%. 11. GLOSSÁRIO Conídio: estrutura não sexual de reprodução de fungos. Conídio ativo ou em processo de germinação: o conídio que aumentou de tamanho em relação ao não germinado, mas que ainda não emitiu tubo germinativo. 36

Conídio germinado: o conídio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do conídio. Conídios inativos: conídios não viáveis. Conídios não germinados: conídios que podem ou não estar viáveis, porém não formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do conídio. Conídios viáveis: são os conídios ativos e os germinados. Conidióforo: estrutura do fungo produtora de conídios. Grânulos: tipo de formulação de produto biológico em forma de grânulos que se desfazem na presença de água. Pó-molhável: tipo de formulação de produto biológico composta pelo ingrediente ativo e inerte que permita a mistura com água, formando suspensões dotadas de grande estabilidade. II. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA 1 PRINCÍPIO Este é um método quantitativo, onde o resultado é expresso em unidades formadoras de colônia (UFC/mL). Tem como base a homogeneização do produto biológico com o diluente esterilizado (solução salina com adição de Tween 80). A partir dela é realizado diluições decimais, as quais são distribuídas em placas sobre meio BDA com Triton e incubadas a 25 ± 2 C no escuro para posterior contagem do número de colônias formadas pelo Trichoderma. 2 APLICAÇÃO Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma. 3 AMOSTRAGEM A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada, contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo, número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura 37

ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser analisado. 4 EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS - Erlenmeyer com capacidade para 250 ml; - Tubos de ensaio de 25 ml; - Estante para tubos de ensaio; - Autoclave; - Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g; - Agitador de tubo de ensaio; - Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 khz; - Agitador orbital para Erlenmeyer; - Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD); - Micropipeta para 10 ml, 20 µl, 100 µl e 1000 µl; - Ponteiras estéreis para micropipeta de 10 ml, 20 µl, 100 µl e 1000 µl; - Placas de Petri descartável esterilizada; - Alça de Drigalski esterilizada; - Agitador magnético; - Barra magnética; - Microscópio óptico; - Lâmina de microscopia e fita adesiva transparente. 5 SOLUÇÕES Solução salina com Tween 80 (diluente): Ingredientes: - NaCl P.A.: 9,0 g; - Água destilada: 1000mL; -Tween 80: 1mL. Preparo: Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 ml de água destilada e acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e 1 atm por 20 minutos. 6 - MEIO DE CULTURA Meio de Batata Dextrose Agar (BDA): 38

Ingredientes: -Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante; -Água destilada: 1000 ml; Preparo: Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 ml do meio por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8 C) por sete dias. Meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton (BDA + T): Ingredientes: -Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante; -Água destilada: 1000 ml; -Triton X-100: 25 g; Preparo: O modo de preparo do meio deve seguir a recomendação do fabricante. Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada e Triton X-100 (redutor de colônia) ao meio de Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 20 ml por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8 C) por sete dias. Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes de serem utilizadas. 7 PROCEDIMENTO 7.1 TESTE DE MICROGOTAS: 7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a 40 minutos antes do início da análise. 7.1.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9 g com solução salina com 0,1% (corresponde às diluições 10-3 ). Devem ser realizadas duas pesagens para cada amostra e duas séries de diluições para cada 39

pesagem (item 8). A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratação. 7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90 rpm. 7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no Erlenmeyer. 7.1.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos. 7.1.6 Transferir 1,0 ml da suspensão contida no Erlenmeyer (10-3 ), com auxílio de micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 ml de diluente (10-4 ). Descartar a ponteira em seguida. 7.1.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das passagens. 7.1.8 Para obter a diluição 10-5 repetir os itens 7.1.6 e 7.1.7 (diluição seriada), utilizando o tubo da diluição anterior (10-4 ). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a ponteira da micropipeta. Tabela 1. Máximo de diluição seriada que deve ser realizado para obtenção da diluição apropriada. Informação do fabricante Diluir até 10 5 10-6 10 6 10-7 10 7 10-8 10 8 10-9 10 9 10-10 10 10 10-11 10 11 10-12 10 12 10-13 7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA, dividindo-as em 4 quadrantes. 40

7.1.10 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o turbilhonamento. 7.1.11 Pipetar imediatamente três alíquotas de 20 µl de cada diluição preparada para a superfície do meio de BDA de cada um dos quadrantes, conforme representado na Figura 1. Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes com três alíquotas de 20µL da diluição seriada referente a marcação da placa. 7.1.12 Os tubos com as diluições devem ser guardados sobre refrigeração (2-8 C) por no máximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colônia; 7.1.13 Esperar para que os 20µL de cada diluição sejam absorvidos no meio de cultura e transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 ± 2 C, no escuro, antes de continuar o procedimento; 7.1.14 Observar quais as diluições houve o crescimento de colônias de Trichoderma e selecionar as três últimas diluições que apresentaram o crescimento do fungo nas três gotas das duas pesagens realizadas para a realização do teste de unidade formadora de colônia. 7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA (UFC): 7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluições seriadas da refrigeração por 30 a 40 minutos antes do início da análise. 7.2.2 Misturar o conteúdo dos tubos de cultura com as diluições escolhidas em agitador para tubos de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o turbilhonamento; 7.2.3 Transferir de cada diluição apropriada, com uma micropipeta estéril, 100µL para a superfície de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton; 41

7.2.4 A diluição é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio com uma alça de Drigalski esterilizada, imediatamente após a transferência. Para cada grupo de cinco placas utilizar uma alça de Drigalski. 7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100µL da solução salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton com alça de Drigalski esterilizada; 7.2.6 Incubar as culturas a 25 ± 2º C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o número de colônias crescidas; 7.2.7 Incubar em BOD a 25 ± 2º C, no escuro, novamente as culturas até 7 dias para verificar se as colônias formadas são realmente de Trichoderma, por meio da visualização da colônia na placa e das estruturas do fungo em microscópio óptico. 7.2.8 Para observar em microscópio óptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colônia desenvolvida na placa de Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lâmina de microscopia, com o lado adesivo sobre a lâmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidióforos e conídios) em microscópio óptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a estrutura observada é de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificação de fungos, como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS Press, 1998. 8 - REPETIÇÃO Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem deve ser realizada uma diluição seriada (item 7.1.6). Das três diluições selecionadas, deve-se plaquear no mínimo cinco repetições por diluição (7.2.3). 42

Figura 2. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade de produtos à base de Trichoderma. 9 CONTAGEM DE COLÔNIAS Fazer a contagem do número de unidades formadoras de colônias, por placa, no tempo de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a fórmula: UFC/mL= número médio de colônias nas placas X diluição escolhida da amostra X 10* * este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100µL de suspensão. Observação: Ideal é que cada placa tenha de 30 a 300 colônias. 10 - PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas. 43

11. LIMPEZA Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%. 44

Wagner Bettiol Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 - Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000 Jaguariúna, SP. bettiol@cnpma.embrapa.br Marcelo Augusto Boechat Morandi Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 - Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000 Jaguariúna, SP. mmorandi@cnpma.embrapa.br Zayame Vegette Pinto Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 - Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000 Jaguariúna, SP. zayame@cnpma.embrapa.br Rosely Nascimento Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 - Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000 Jaguariúna, SP. rosely@cnpma.embrapa.br Elen Ribeiro dos Santos Agostini Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 - Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000 Jaguariúna, SP. elen@cnpma.embrapa.br Cleusa Maria Mantovanello Lucon Instituto Biológico de São Paulo, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, 04014-002, São Paulo, SP. mantova@biologico.sp.gov.br Ricardo Harakava Instituto Biológico de São Paulo, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, 04014-002, São Paulo, SP. harakava@biologico.sp.gov.br Patrícia E. Haddad Instituto Biológico de São Paulo, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, 04014-002, São Paulo, SP. patriciaehaddad@yahoo.com.br 45