CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ( CCD) Bruno Henrique Ferreira José Roberto Ambrósio Jr.

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ( CCD) Bruno Henrique Ferreira José Roberto Ambrósio Jr.

CROMATOGRAFIA Método usado para separar, identificar e quantificar componentes de uma mistura; Método físico-químico que utiliza distribuição dos componemtes em duas fases em contato íntimo: fase estacionária: sólido, líquido ou gel; pode ser: introduzida numa coluna ou espalhada como um filme (suporte cromatográfico); fase móvel: líquido ou gás;

Tipos de Cromatografia Em Papel; Em Camada Delgada; Por Adsorção; Por Troca Iônica; Por Exclusão; Gasosa; Líquida de Alta Eficiência.

Cromatografia em Papel Utiliza pequena quantidade de amostra; Aplicada na separação e identificação de compostos polares; antibióticos hidrossolúveis; ácidos orgânicos; íons metálicos. Classifica-se como: por partição ou planar líquido-líquido.

Cromatografia por Adsorção Método cromatográfico líquido-sólido; Utiliza-se uma coluna recheada com um sólido (fase estacionária) e uma fase líquida, onde a sorção isotérmica refere-se a um aumento da concentração do material (que está em excesso na fase móvel) entre as superfícies das fases móvel e estacionária.

Cromatografia Por Troca Iônica Cromatografia em coluna recheada; Utilizada para suavizar a dureza da água; Cromatografia Por Exclusão Distribuição seletiva e dinâmica das moléculas do soluto entre duas fases líquidas separadas, dependentes de uma estrutura estacionária contendo poros de tamanho controlado; o recheio é constituído por macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes

Cromatografia Gasosa Separação de Gases ou substâncias volatilizáveis; Baseia-se na diferente distribuição das substâncias da amostra entre as fases. A amostra é introduzida por injeção na coluna contendo a fase estacionária.

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ( HPLC) Cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, cheias de material especiais e fase móvel que é eluida sob altas pressões. Realiza separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos. Alta resolução, eficiência e sensibilidade.

ADSORVENTES Importância na sua eficiência: tamanho e área superficial das partículas, sendo estes fatores determinantes na fixação do adsorvente na placa cromatográfica. Tipos: sílica, alumina, pó de celulose, pó de poliamida, etc.

SÍLICA GEL adsorvente mais utilizado; preparada pela polimerização de sílica desidratada; poros de 10-1500 ângstrons de diâmetro; área superficial de 200-1000 m 2 /g; temperatura de ativação de 150-200ºC; usado para separar aminoácidos, alcalóides, açúcares, ácidos graxos, lipídeos, óleos essenciais, cátions e ânions inorgânicos, esteróides

ALUMINA apresenta-se em várias formas que diferem entre si pela área superficial, energia da superfície, tamanho dos poros e, conseqüentemente, em suas propriedades cromatográficas; área superficial: 50-250 m 2 /g; usado para separar: alcalóides, fenóis, esteróides, vitaminas, carotenos e aminoácidos.

VANTAGENS CCD insuperável flexibilidade dos sistemas cromatográficos: irrestritas mudanças de solventes, otimizando a seletividade; as análises de várias amostras podem ser feitas simultaneamente; pode-se especiar a análise para um determinado componente de interesse;

VANTAGENS CCD a análise pode ser feita sob diferentes condições; baixo custo: pequena quantidade de amostra; rápido: análises simultâneas.

DESVANTAGENS CCD poder de resolução limitado; por constituir um sistema aberto, depende de fatores ambientais: influência da umidade relativa na camada hidrofílica, podendo haver contaminação por impurezas do ar, volatilização, oxidação e fotossensibilidade.

PREPARAÇÃO DAS CROMATOPLACAS limpeza: água e detergente; secagem: em estufa; aplicação do adsorvente: em suspensão do adsorvente com solvente volátil: espalhamento da suspensão com bastão de vidro (camada não uniforme); uso de espalhadores (camada uniforme)

PREPARAÇÃO DAS CROMATOPLACAS por imersão na suspensão (camada uniforme) placas pré-fabricadas: custo elevado; Obs: camada uniforme: menores quantidades de amostra e maior rapidez no desenvolvimento dos cromatogramas.

ATIVAÇÃO DAS PLACAS temperaturas e tempos elevados tornam adsorventes mais ativos. sílica, alumina: 105-110ºC por 30-60min. Este processo promove a remoção de vapor d água e outros resíduos possivelmente adsorvidos na placa.

SELEÇÃO DA FASE MÓVEL O solvente ou mistura de solventes: não deve reagir com o adsorvente; deve interagir de forma diferente com cada componente da mistura (diferente força de eluição), levando-se em conta sua polaridade, dentre outras propriedades.

APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS amostras na forma de soluções em solventes bastante voláteis; utilizando-se uma micropipeta, aplica-se 1 gota de amostra a 1,5-2cm acima do nível inicial do solvente. distância entre as amostras: 1-1,5cm faz-se uma marca a 1-1,5 cm da borda superior da cromatoplaca.

PREPARAÇÃO DA CUBA introduz-se solvente até altura de 0,5-1cm: colocar papel de filtro nas paredes e tampar a cuba para haver mais eficiente saturação da cuba com os vapores do solvente.

DESENVOLVIMENTO introduz-se a cromatoplaca levemente inclinada, com as amostras aplicadas, já secas, na cuba saturada de vapor de solvente, tampando-a em seguida; observa-se o deslocamento do solvente, o qual elui as amostras, finalizando-se o processo quando o solvente atingir a marca estabelecida próxima à borda superior da cromatoplaca, retirando-a da cuba rapidamente e secando-a.

REVELAÇÃO Tornar visíveis as substâncias incolores presentes nas amostras: luz UV, tornando as manchas fluorescentes; adsorventes impregnados com reagentes fluorescentes; borrifação com H 2 SO 4 ou H 2 SO 4 /KMnO 4 e aquecimento a 100-120ºC; exposição a vapores de I 2 em recipiente fechado.

FATOR DE CAPACIDADE OU RETENÇÃO (k ) Razão da distância percorrida pelo analito entre FE/FM. Quanto maior seu valor, maior afinidade do analito pela FE em relação à FM.

FATOR DE SELETIVIDADE (ALFA) é a razão entre o fator de retenção de 2 analitos. quanto maior seu valor, mais fácil a separação. alfa=1, não há separação

FATOR DE EFICIÊNCIA (N) relação entre o tempo de permanência do analito no sistema e o alargamento da banda cromatográfica. quanto mais difícil a separação (alfa pequeno), maior o N necessário para realizar a separação.

Características da mancha A mancha deve ser: Compacta, redonda ou oval. As causas das manchas assimétricas (caudas) são: Insolubilidade na Fase Móvel. Adsorção forte na Fase Estacionária. Aplicação de quantidade muito grande da amostra. Dissociação.

Para Aumentar a Reprodutibilidade Saturação da cuba cromatográfica; Qualidade e quantidade da Fase Móvel; Atividade da Fase Estacionária; Qualidade da Fase Estacionária; Espessura da camada delgada; Técnica e condição da Fase móvel (desenvolvimento, temperatura, distância percorrida pela Fase Móvel, quantidade da amostra).

DOCUMENTAÇÃO Fotografia; Scaneamento; Xerox; Determinação dos valores de R s e R f.