Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologias Manipulação de Gametas e Embriões 5ª Aula: Criopreservação de Oócitose Embriões Priscila Marques Moura de Leon Doutoranda PPGB, Médica Veterinária Outubro, 2011
Criopreservação Conceito: Criopreservação é um processo onde células ou tecidos biológicos são preservados através do congelamento a temperaturas muito baixas, geralmente 196 C. Objetivo: suspensão do metabolismo e a manutenção das características biológicas por um longo período de tempo, mantendo a viabilidade celular; Este processo requer a adição de substâncias que protegem as células durante o congelamento e descongelamento, os Criprotetores; * A Criobiologia estuda os efeitos de baixas temperaturas em células, tecidos e organismos vivos.
Criopreservação Histórico: Polge et al., 1949: congelamento de sêmen utilizando glicerol; Audrey Smith, 1952: estudo da exposição de oócitos mamíferos a baixas temperaturas; Whittingham et al., 1972: realizaram os primeiros estudos mostrando que o congelamento lento de embriões de camundongo nas fases iniciais de clivagem, na presença de dimetil-sulfóxido (DMSO), seguido de um processo lento de descongelamento, não afetava a sobrevida dos embriões e seu futuro desenvolvimento. Whittingham, 1977: descrição de alterações estruturais de membrana durante o congelamento; Trounson& Mohr, 1983: gestação após criopreservação de embriões humanos. Chen, 1986: gestação proveniente de oócito humano criopreservado; Vajta et al., 1998: criopreservação ultra-rápida(vitrificação) de oócitos bovinos;
Aplicações da Criopreservação de Oócitos e Embriões Armazenamento de material genético Biobancos Comercialização Nacional e Internacional de Oócitos e Embriões Auxilia Programas de Melhoramento Genético Animal Aplicação na Produção in vitro de Embriões Aplicação em Programas de Transferência de Embriões Coadjuvantes no Tratamento da Infertilidade Preservar espécies em extinção * Medicina Infer lidade e Reprodução * Veterinária Melhoramento Gené co e Reprodução
Métodos de Criopreservação Resfriamento: é um método simples, onde se mantém os embriões a temperatura entre 0 e 4 C durante 24 a 72 horas antes da transferência: Utilizado em alevinos a fim de transporte e comercialização; Utilizado em embriões bovinos para transporte e transferência; Congelamento:método de conservação a -196 C durante um período indeterminado. Técnicas são classificação de acordo com a taxa de resfriamento: Congelamento lento: taxa de resfriamento entre 0,5 1,6 C/min Congelamento Rápido: taxa de resfriamento entre 17 30 C/min Congelamento Ultra-rápido: Vitrificação(mais utilizado atualmente)
Exemplos de Protocolos de Criopreservação: Congelamento Lento: a velocidade de congelamento é de 0.3 C por minuto do "seeding" até aproximadamente -80 C, antes de mergulhar o material em nitrogênio líquido. A duração do congelamento variará de 3,5 a 4 horas. O descongelamento é feito na velocidade de 10 C por minuto. Congelamento Rápido: a velocidade de congelamento é de 0.3 C do"seeding" até-30 C. A duração do congelamento situa-se entre 2 a 2,5 horas. O descongelamento é feito na velocidade de 30 C por minuto. O equipamento usado nestes procedimentos é um "freezing" programável. Congelamento Ultra-rápido e Vitrificação: a velocidade de congelamento será de 2500 C por minuto. A duração do congelamento ficará entre 2 a 3 minutos, e a velocidade de descongelamento > 300 C por minuto.
Princípios da Criobiologia * Para manter a viabilidade celular após longo período de estocagem em baixas temperaturas, as células vivas são submetidas a um estado de redução do metabolismo, permanecendo por um período de tempo indefinido, e após são resgatadas com viabilidade. Fatores essenciais para a sobrevivência celular: tipo e concentração dos agentes crioprotetores (desidratação celular, baixam ponto de congelamento e estabilidade de membrana); taxa de resfriamento da temperatura durante o congelamento; manutenção da temperatura de estocagem; procedimento de descongelamento; remoção de crioprotetores após descongelamento;
Agentes Crioprotetores * Agentes crioprotetoressão solventes orgânicos utilizados nas soluções crioprotetoras e são compostos muito hidrófilos; Propriedades: alta solubilidade em soluções salinas aquosas baixo peso molecular para rápida e completa penetração na célula baixa toxicidade alta estabilidade em temperaturas reduzidas Estão divididos em: 1) Penetrantes ou Intracelulares: crioprotetoresde baixo peso molecular, como: dimetilsulfóxido(dmso), propanodiol, etilenoglicol, glicerol, metanol e butanodiol; 2) Não-penetrantes ou Extracelulares: crioprotetoresde maior peso molecular, como: galactose, glicose, sacarose e trealose, polivinilpirrolidona (PVP), álcool polivinílico(pva) e albumina sérica bovina (BSA)
Agentes CrioprotetoresIntracelulares Mecanismo de ação: Interagem com as modificações da membrana que ocorrem durante o processo de criopreservação, penetram na membrana celular e estabilizam proteínas intracelulares, evitando o rompimento da membrana celular durante o congelamento; baixamopontodecongelamentodasolução,situaçãoemqueascélulas sofrem formação letal de gelo intracelular; aliviam o efeito das altas concentrações de solutos (eletrólitos), intra e extracelular; atuam como um tampão hiperosmótico, diminuindo os efeitos de altas concentrações de moléculas nas células desidratadas;
Agentes CrioprotetoresIntracelulares O Etilenoglicol (EG) tem sido utilizado em diversos protocolos para a criopreservação de oócitos e embriões em várias espécies, devido ao seu baixo peso molecular quando comparado a outros crioprotetores. Proporciona rápida entrada e saída na célula durante o período de equilíbrio e rehidratação. *OEGpossuiavantagemdesermenostóxicodoqueoutroscrioprotetores. DMSO composto orgânico que possui uma elevada capacidade higroscópica decorrente de sua afinidade pelo hidrogênio. *ODMSOvemsendoutilizadocomsucessonacriopreservaçãodeoócitose embriões. A formação de gelo intracelular ocorre entre-40 C e-50 C; A adição de 20% de Soro Fetal Bovino (SFB) ao meio de criopreservação de oócitos e embriões previne e minimiza os efeitos tóxicos dos crioprotetores.
Agentes Crioprotetores Extracelulares Mecanismo de ação: atuam por meio de mecanismo osmótico, promovendo a desidratação celular e impedindo a formação de cristais de gelo no interior da célula Bloqueiamaformaçãodecristaisdegelo Exemplos: Sacarose Copolímero X-1000 Copolímero Z-1000 SUPERCOOL X-1000 ICE BLOCKER * Sacarose atua como um tampão osmótico, mantém constante a concentração do meio extracelular, regula a velocidade de entrada da água e saída do crioprotetor, evitando o choque osmótico. * Citocalasina-B(micotoxina que se liga às proteínas) é utilizada para estabilizar componentes do citoesqueleto, tornando-os mais flexíveis e menos susceptíveis à crioinjúrias, torna também a membrana plasmática menos rígida e mais elástica.
Soluções Crioprotetoras O sucesso da criopreservação da célula depende da velocidade do congelamento e da composição da solução crioprotetora; Quanto mais rápido for o congelamento mais concentrada são as soluções Crioprotetoras; Protocolos utilizam 1, 2 ou 3 soluções em concentração crescente de crioprotetores; Exemplo de composição: Etilenoglicol DMSO Sacarose Soro Fetal Bovino PBS ou TCM-199
Vitrificação Conceito: A vitrificação é uma técnica de criopreservação que envolve rápidas taxas de resfriamento e aquecimento em presença de concentrações muito altas de crioprotetores, prevenindo assim a formação de cristais de gelo, e diminuindo as crioinjúrias causadas a célula; EstemétodoéaplicadoàOócitoseEmbriões; Apesar da breve exposição dos oócitos as soluções de vitrificação, as altas concentrações de crioprotetores podem causar danos às células devido a sua toxicidade química; Protocolo é baseado na breve exposição à soluções com alta concentração de crioprotetor (aumentadas em 40% na relação peso/volume) seguida da imersão direta em nitrogênio líquido.
Vitrificação Trounson & Sjöblom, 1988: descreveram a obtenção de gestações após a transferência de embriões humanos criopreservados em altas concentrações de DMSO (3.5M) e sucrose (0.25M), por 2 a 3 minutos, com subseqüente conservação em nitrogênio líquido. O descongelamento foi rápido na temperatura de 37 C. * A alta velocidade de resfriamento/aquecimento resulta em uma rápida passagem através da temperatura perigosa (redor de 0 C), minimizando as crioinjúrias; Vantagens da Vitrificação: não requer o uso da aparelhagem de congelamento; alta velocidade na execução; metodologia é simples e barata; tem sido relatada melhores taxas de sobrevivência, principalmente para a criopreservação de oócitos e embriões em estágios iniciais de desenvolvimento;
Equipamentos para a Criopreservação Congelador programável Bio-Cool Geladeira: meios, soluções e hormônios Botijão de nitrogênio líquido Microscópio e Estereomicorcópio Capela de fluxo laminar Micropipetas e ponteiras Palhetas e seladores Placas de cultivo
Bio-Cool Controlled Rate Freezer DB1 Embryofreeze- The Ultimate Embryo Freezer
Botijão de Nitrogênio Líquido Palhetas para envase de oócitos e embriões
Kit Vitrificação de Embriões Bovinos Kit Vitrificação de Embriões Equinos Vitrificação de Embriões Equinos Kit Vitrificação de Oócitos e Embriões
Laboratório de Criopreservação de Oócitos e Embriões
Etapas da Criopreservação O processo de criopreservação envolve as seguintes etapas: 1) Adição de Agentes Crioprotetores; 2) Resfriamento, indução da formação de gelo e Congelamento; 3) Estocagem em Nitrogênio Líquido (-196 C); 4) Descongelamento; 5) Remoção das Soluções Crioprotetoras;
Etapas da Criopreservação 1) Adição de Agentes Crioprotetores: O período de exposição aos agentes crioprotetores é uma etapa extremamente importante no processo de criopreservação, pois permite que a célula entre em equilíbrio em relação as concentrações extra e intracelulares; O tempo de exposição deve ser suficiente para causar a desidratação e sem provocar toxicidade celular;
Etapas da Criopreservação 2) Resfriamento e indução da formação de gelo e congelamento: Durante o resfriamento, à medida que a temperatura decresce da fisiológica 37-39 C para 0 C, a célula atinge um estado de super-resfriamento, ocorrendoa formação de gelo no meio extracelular. No congelamento lento: a célula super-resfriada perde água devido a pressão de vapor da água na célula exceder àquela do exterior celular congelado. Com a progressiva redução da temperatura, a água se difunde do interior das células para a solução extracelular e é convertida em gelo na superfície das células. A célula pode sofrer choque osmótico. * Quando o potencial hídrico das células parcialmente desidratadas iguala-se àquele do gelo extracelular, um equilíbrio é estabelecido e uma desidratação adicional não ocorrerá. No congelamento rápido:a desidratação por congelamento não ocorre, as células se tornam cada vez mais super-resfriadas e a solução intracelular congela-se, formando cristais de gelo intracelulares; * Seeding: indução da formação extracelular de gelo, evitando o super-resfriamento. Utilizado no congelamento lento, com objeto de metal a -196 C;
* A desidratação celular continua durante o processo de resfriamento até o congelamento na temperatura de 30 C.
Etapas da Criopreservação 3) Estocagem em nitrogênio líquido: Terminado o processo de congelamento o material biológico será armazenado em nitrogênio líquido (-196 C) Nesta etapa não são observados efeitos deletérios se mantida a temperatura constante. 4) Descongelamento: A taxa de aquecimento utilizada para o descongelamento é um ponto crítico do processo de criopreservação, pois pode a recristalização com formação de gelo intracelular, reduzindo a viabilidade celular; O descongelamento deve ocorrer o mais rápido possível (275 C/min), em banho-maria a 37 C ; O gelo extracelular derrete e penetra na membrana celular reidratando a célula;
Etapas da Criopreservação 5) Remoção das soluções crioprotetoras: Os crioprotetores são removidos através de sucessivas lavagens após o descongelamento; A solução crioprotetora deve ser removida devido a toxicidade celular dos agentes crioprotetores a temperatura ambiente; Deve ser evitado o descongelamento em meio com baixa concentração de cioprotetor ou na sua ausência, pois irá causar rompimento celular devido a entrada brusca de água no interior da célula;
Água extracelular congela, no momento em que a célula se aproxima do ponto de congelamento, removendo o líquido extracelular. A formação de cristais de gelo extracelular acarreta um aumento de osmolaridade Com o desiquilíbrio osmótico, a água é retirada da célula para o compartimento extracelular, ocasionando uma diminuição do volume celular por desidratação. Uma adequada desidratação celular depende da velocidade do congelamento de forma a não provocar uma lise da célula.
Avaliação da Criopreservação Para a avaliação da eficiência dos protocolos de congelação, diferentes técnicas podem ser empregadas isoladamente ou em associação: Morfologia; Microscopia eletrônica e análise ultra estrutural; Viabilidade e Desenvolvimento no Cultivo in vitro; Coloração para Viabilidade de Membrana (Live/Dead; Iodeto de Propídeo, Diacetato de Fluoresceína e Hoescht 33342) Teste de TUNEL (detecção de apoptose) ROS (Espécies Reativas de Oxigênio)
Avaliação Morfológica:
Avaliação da Criopreservação A técnica de TUNEL: terminal deoxynucleotidil tranferase-mediated deoxyuridine triphosphate biotin nick end-labeling Esta técnica é utilizada para avaliar a fragmentação do DNA e detecção do grau de apoptose Técnica emprega uma enzima (transferase deoxynucleotidil terminal) para adicionar nucleotídeos aos fragmentos das fitas de DNA quebradas nas células apoptóticas.
Teste de TUNEL:
Reactive Oxygen Species (ROS):
Viabilidade Celular: * Determina presença de lesões de membrana
Métodos de Vitrificação As técnicas de congelamento de embriões diferem pelas seguintes variações: 1. tipo e concentração dos crioprotetores utilizados; 2. velocidades de congelamento; 3. tempo de exposição a solução crioprotetora; 4. tipo de envase ou suporte físico; 5. velocidade de descongelamento.
Métodos de Vitrificação Técnica Convencional em palhetas de 0,25mL: Esse método de vitrificaçãoutiliza palhetas francesas de 0,25ml. O padrão máximo de congelamento/aquecimento é 2000 C/min; * 67% de re-expansãoe 53% de eclosão em embriões bovinos; Método de OPS: Vajtaet al., 1997:chamada de Open PulledStrawfoi desenvolvida para embriões bovinos e suínos; Nesta técnica as palhetas de 0,25ml são esticadas e cortadas ao meio, produzindo duas OPS. Atualmente: 2-3 µl contendo os oócitos(2 a 4) ou embriões (1 a2); Neste método a taxa de resfriamento é de 20.000 C/min; O aquecimento é realizado pela colocação da ponta aberta diretamente na placa contendo o meio aquecido (1 a 2 seg.); * São descritas taxas de 25% de produção de blastocistos a partir de oócitos vitrificados, e 70% e 94% de embriões bovinos viáveis nos dias 6 e 7,
OPS:
Cryoloop: Métodos de Vitrificação este método consistiu em usar como suporte físico para congelar os embriões mamíferos, um pequeno laço de náilon de aproximadamente 20 µm de largura e 0,05 0,07 mm de diâmetro, permitindo a adição de um volume de aproximadamente 1 a 2 µl de solução crioprotetora. A descongelação foi realizada colocando-se o Cryoloop na placa de petriem contato com a solução de desvitrificação e reidratação previamente aquecida. Técnica de vitrificaçãoem grades de microscopia eletrônica de transmissão: Consistiu na utilização de grades de microscopia eletrônica de transmissão como suporte físico para os embriões ou oócitos, mantendo as estruturas em um pequeno volume de solução crioprotetora. As grades foram mergulhadas diretamente em nitrogênio líquido, atingindo taxas de resfriamento superiores a 20.000 C por minuto. A desvitrificação e a reidratação dos embriões foram feitas em cinco etapas. As grades saiam diretamente do nitrogênio líquido para uma placa de petri contendo meio de cultivo com 0,5 M de sacarose, a uma temperatura de 37 C.
Métodos de Vitrificação Vitrificação em Superfície Sólida(SSV): A superfície sólida serve de base para a vitrificação, formada por um cubo oco de metal que tem sua superfície forrada por uma folha de papel alumínio. O cubo foi colocado dentro de uma caixa de isopor contendo nitrogênio líquido para que ficasse parcialmente submerso, para atingir temperaturas entre - 150 e -180 C. Em seguida, os oócitos foram depositados juntamente com a solução de vitrificação na superfície, formando uma gota de 1 a 2 µl de solução, sendo a gota vitrificada instantaneamente; Para serem armazenadas por longos períodos, as gotas vitrificadas foram colocadas em criotubos de 1 ml previamente resfriados em nitrogênio; A taxa de sobrevivência de embriões caprinos foi de 39%; Método de vitrificação em micropipetas de vidro- GMP: teve como objetivo substituir a palheta de OPS por uma palheta que não flutuasse em nitrogênio líquido e que tivesse os diâmetros interno e externo menores, melhorando as taxas de condutividade de temperatura durante o resfriamento.
Solid Surface Vitrification
Métodos de Vitrificação Método de vitrificação em Microgotas: Os oócitos e a solução de vitrificação foram depositados em uma pipeta de Pasteur inclinada e a cerca de 15 cm do nitrogênio líquido. O conteúdo da pipeta formou uma gota de aproximadamente 6 µl, que caiu diretamente em nitrogênio líquido e foi vitrificada. Depois as gotas foram retiradas, com o auxílio de uma pinça e colocadas em criotubos previamente resfriados. * Após a desvitrificação e cultivo, 83% dos embriões de camundongos atingiram o estágio de blastocisto. Método de vitrificação em hemi-palhetas( Hemi Straw ): Foi desenvolvido para criopreservar blastocistos humanos produzidos in vitro. A técnica consistiu na utilização de uma palheta de 0,25mL cortada ao meio no sentido longitudinal, como suporte físico para os embriões. no máximo 2 blastocistos e 0,3 µl de meio foram transferidos e mergulhados em nitrogênio líquido. Após a imersão, a hemi palheta foi colocada no interior de uma palheta previamente resfriada, lacrada e retornada para o nitrogênio líquido; A descongelação dos embriões foi realizada em soluções contendo concentrações decrescentes de sacarose(0,5; 0,25 e 0,125 M)
Hemi Straw:
Criopreservação de Embriões Técnicas de criopreservação tem sido aplicadas a embriões: humanos, bovinos, ovinos, caprinos, suínos, equinos e murinos; Os embriões de melhor qualidade devem ser selecionados para a criopreservação : Embrião perfeito para o estágio considerado, blastômeros são uniformes quanto ao tamanho e coloração, citoplasma não é granular, zona pelúcida é regular; Vantagens: O embrião já contém o genoma completo, podendo ser diretamente transferido para uma receptora; Permite armazenar embriões excedentes da produção in vitro de embriões; Forma barata de exportar e importar alto padrão genético;
Criopreservação de Embriões: Eldridge-Panuska et a., 2005. Forma de envase do embrião para congelamento.
Criopreservação de Oócitos Oócitos maturos x Imaturos; Acredita-se que o fuso tubular do oócitomaduro é sensível para as mudanças de temperatura e não disjunções de cromátides podem ocorrer durante o processo de congelamento, resultando em aneuploidias após a fertilização; Liberação de grânulos corticais que levariam a um endurecimento da zona pelúcida; * Oócitoshumanos criopreservadoscom "cumulus" possuiammaior sobrevidade(54%) do que aqueles sem essa camada celular (27%), sendo os níveis de fertilização de 44% versus 25%, respectivamente para com e sem cumulus;
Criopreservação de Oócitos Fatores Complicantes na Vitrificação: Complexidade Estrutural COC; Baixa proporção área de Superfície:Volume; Baixa permeabilidade da Membrana Plasmática; Quantidade de Lipídio do oócito(equino e suíno); Consequências da Vitrificação: Danos ao DNA; Ruptura do Citoesqueleto, microtúbulos e microfilamentos; Diminuição do nível de GSH; Endurecimento e fraturas da Zona Pelúcida; Danificação Mitoncodrial e Enzimática; Ruptura das junções GAP das células do cumulus;
Variáveis que afetam o sucesso da criopreservação idade das doadoras; qualidade dos embriões; Método de Criopreservação; Solução Criprotetora; Fatores espécie-específicos; Relação Superfície:Volume; Oócitos: estágio de maturação e presença das células do cumulus;
Vídeo VitrificaçãoOócitosem Hemi-Palhetas http://www.youtube.com/watch?v=lhyig3nekrc