Detecção imunoistoquímica de Ki67, receptores de estrogênio e de progesterona em espécime cirúrgico e biópsia percutânea de carcinoma de mama

Detecção imunoistoquímica de Ki67, receptores de estrogênio e de progesterona em espécime cirúrgico e biópsia percutânea de carcinoma de mama Nome do autor: Fabiane Silva Barbosa Nome do orientador: Prof. Dr. Cláudio O. P. Alexandre Nome do co-orientador: Prof.ª Dra. Márcia Graudenz Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção do grau de Mestre 2008

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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE I Detecção imunoistoquímica de Ki67, receptores de estrogênio e de progesterona em espécime cirúrgico e biópsia percutânea de carcinoma de mama Nome do autor: Fabiane Silva Barbosa Nome do orientador: Prof. Dr. Cláudio O. P. Alexandre Nome do co-orientador: Prof.ª Dra. Márcia Graudenz Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção do grau de Mestre 2008

II B238d Barbosa, Fabiane Silva Detecção imunoistoquímica de Ki67, receptores de estrogênio e de progesterona em espécime cirúrgico e biópsia percutânea de carcinoma de mama / Fabiane Silva Barbosa. Porto Alegre, 2008. 70 f. : il. Dissertação (mestrado) Programa de Pós-Graduação em Patologia. Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre. 2008. Orientador: Claudio O. P. Alexandre. Co-orientador: Márcia Graudenz. 1. Carcinoma de mama. 2. Ki67. 3. Imunoistoquimia. I. Alexandre, Claudio O. P. II. Graudenz, Márcia. III. Título. CDU 618.19-006 CDD 616.99449 (Bibliotecária responsável: Nádia Tanaka CRB 10/855)

II A minha mãe Solange, fonte inspiradora das minhas ações. Aos meus amigos, que fazem da minha vida cada vez mais bela.

III AGRADECIMENTOS A realização deste estudo contou com a participação e o empenho de muitas pessoas. Difícil seria mencionar todas, sem fazer jus ao real esforço de cada uma delas. Para algumas delas, expresso aqui o meu mais sincero agradecimento. Ao amigo e Prof. Dr. CLÁUDIO OSMAR PEREIRA ALEXANDRE pela constante e incansável dedicação demonstrada em todos os momentos do projeto. Pela amizade, apoio e compreensão nesses anos de convivência. Ao amigo e Prof. Dr. ANTONIO LUIZ FRASSON pela participação e colaboração indispensáveis neste projeto. Pela amizade e apoio sempre demonstrados. Ao Prof. Dr. VINÍCIUS DUVAL DA SILVA pela amizade e incansável dedicação e disponibilidade. Ao Prof. FELIPE PEREIRA ZERWES pela amizade e colaboração nesta dissertação. A Prof. Dra. MARCIA GRAUDENZ pela co-orientação desta dissertação. empenho. A Acadêmica de medicina MARCELLE MORAES DOS SANTOS pela dedicação e A funcionária do laboratório de Pós-Graduação em Patologia ROSSALVA MAUER pela amizade e colaboração com a elaboração das lâminas e ajuda com a imunoistoquímica.

IV A secretária IVONICE OLIVEIRA DOS SANTOS pelo carinho e dedicação. A estatística LUIZA COELHO pela ajuda indispensável com a análise estatística. Aos meus queridos amigos MARIA CAROLINA REY, ALINE FERREIRA CASTILHOS, THIRZÁ FRISON, ANNA LUCIA ZECCA, EDUARDO LICHTENFELS, MÁRCIA TATSCHI, ADRIANA MACHADO e FERNANDA ALAITE ZAMBELLI pelo apoio, compreensão e amizade de sempre. A MATTEO LUIGI FOLLINI pelo apoio, amizade e incentivo. A minha mãe SOLANGE SILVA BARBOSA pelo apoio incondicional em todas as decisões da minha vida.

V SUMÁRIO Lista de Abreviaturas e Símbolos... Lista de Figuras... Lista de Gráficos e Tabelas... RESUMO... VII IX X XII ABSTRACT... XIV 1. INTRODUÇÃO... 1 2. REVISÃO DA LITERATURA... 5 Câncer de Mama... 5 Epidemiologia... 5 Patogênese... 6 Técnica Imunoistoquímica... 8 Antígeno Ki67 e câncer de mama... 9 Receptores Hormonais e câncer de mama... 11 Receptores Hormonais e carcinoma ductal in situ... 18 3. JUSTIFICATIVA PARA O ESTUDO... 21 4. OBJETIVOS... 22 4.1 Objetivo Geral... 22 4.2 Objetivos Específicos... 22

VI 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 23 6 ARTIGO EM INGLÊS... 32 7 ARTIGO EM PORTUGUÊS... 53 8 ANEXOS... 73 8.1 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS... 73 8.1.1 Delineamento do estudo... 73 8.1.2 População estudada... 73 8.1.3 Amostra estudada... 73 8.2 METODOLOGIA... 74 8.2.1 Avaliação clínico-patológica... 74 8.2.2 Avaliação imunoistoquímica... 78 8.2.3 Análise estatística... 79 8.2.4 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa... 80 8.2.5 Termo de Consentimento Informado Livre e Esclarecido para Pesquisa Cientifica... 80 8.3 FIGURAS... 84 8.4 GRÁFICOS E TABELAS... 87

VII Lista de abreviaturas e Símbolos CEMA Centro de Mama do Hospital São Lucas da PUCRS UFCSPA Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre CM- Carcinoma de mama IQ- imunoistoquímica BP- Biopsia percutânea EC- Espécime Cirúrgico IC Intervalo de Confiança Ki67 Marcador de proliferação tumoral PUCRS Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul RE Receptor de Estrogênio RH Receptores Hormonais RP Receptor de Progesterona TNM- classificação TNM conforme padronização da União Internacional Contra o Câncer, 6ª edição. Esse sistema é baseado no TNM, no qual o T se refere ao tamanho tumoral, N ao comprometimento de linfonodos e M à presença de metástases a distância UICC- União Internacional Contra o Câncer NSABP B-14 Estudo realizado pelo National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol B-14

VIII NSABP B-24 Estudo realizado pelo National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol B-24 EBCTCG Estudo realizado pelo The Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group ATAC Trial Estudo Clinico denominado: Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination FDA - Food and Drug Administration CDI Carcinoma Ductal Invasor CDIS Carcinoma Ductal in situ

IX Lista de Figuras Figura 1. Imunoistoquímica para RE em material de biópsia percutanea de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x)... 84 Figura 2. Imunoistoquímica para RE em material de espécime cirúrgico de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x)... 84 Figura 3. Imunoistoquímica para RP em material de biópsia percutanea de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x)... 85 Figura 4. Imunoistoquímica para RP em material de espécime cirúrgico de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x)... 85 Figura 5. Imunoistoquímica para Ki67em material de biópsia percutanea de carcinoma de mama baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% das células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x)... 86 Figura 6. Imunoistoquímica para Ki67 em material de espécime cirúrgico de carcinoma de mama baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% das células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x)... 86

X Lista de Gráficos e Tabelas Gráfico 1. Box-plot dos valores extremos observados em quartis da imunoisqoquímica do Ki67 na biópsia percutânea e no espécime cirúrgico... 87 Gráfico 2. Diferenças na avaliação imunoistoquímica de RE entre material de biópsia percutânea e espécime cirúrgico... 88 Gráfico 3. Diferenças na avaliação imonoistoquímica de RP entre material de biópsia percutânea e espécime cirúrgico... 89 Tabela 1. Dados clínicos e anátomo-patológicos... 90 Tabela 2. Graduação Bloom e Richardson (modificada por Elston e Ellis)... 92 Tabela 3: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o tipo de cirurgia... 93 Tabela 4: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o tipo de tumor... 94 Tabela 5: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o grau tumoral... 95

XI Tabela 6: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o número de linfonodos metastaticos... 96 Tabela 7: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o tempo de decurso entre biopsia percutanea e cirurgia... 97

XII RESUMO Introdução: O antígeno Ki67 é um importante marcador de proliferação celular usado, no carcinoma de mama (CM), como fator prognóstico. Da mesma forma, o estado dos receptores hormonais é fundamental no manejo de pacientes com CM, predizendo resposta à terapia e prognóstico. A terapia endócrina é considerada ineficaz em pacientes que não expressam receptores de estrogênio (RE) e/ou progesterona (RP). A avaliação do Ki67 e dos receptores hormonais é obtida, rotineiramente, por meio da técnica imunoistoquímica (IQ) utilizando o espécime cirúrgico (EC). Entretanto, em muitos casos, tais como no carcinoma de mama avançado, a amostra tumoral a partir da biópsia percutânea (BP) pode ser a única amostra de tecido disponível para a avaliação. Objetivo: Avaliar a expressão de Ki67 e receptores hormonais em espécime cirúrgico e biópsia percutânea, por meio da técnica imunoistoquímica, de pacientes com carcinoma de mama. Material e métodos: Foi realizado um estudo transversal em 90 mulheres com carcinoma de mama sem tratamento neoadjuvante e submetidos à biópsia percutânea prévia. Foi utilizado o método computadorizado de análise quantitativa para determinar a expressão do Ki67 e dos receptores hormonais detectados pela técnica imunoistoquímica. Todas as lâminas (EC e BP) foram confeccionadas e testadas no mesmo laboratório e no mesmo período de tempo. Resultados: Os percentuais observados para o Ki67 na biópsia percutânea, cuja média foi de 18,32, se mostraram significativamente superiores quando comparados aos percentuais de Ki67 no espécime cirúrgico, cuja média foi de 5,86 (p<0,001) A expressão dos RP no EC foi detectada em 58,9% (53/90) dos casos e na BP em 68,9% (62/90), esta diferença não foi estatisticamente

XIII significativa (p=0,2144), entretanto quando evidenciados os resultados positivos e negativos concordantes, houve uma tendência a maior positividade em material de BP (p=0,108). Por outro lado, a freqüência dos RE detectada em EC e BP, não mostrou diferença estatisticamente significativa (p=0,248). Quando o critério de receptor hormonal positivo considerado foi ER ou RP positivos, não foi observada diferença entre EC e BP. Não foram observadas diferenças com relação ao tipo de cirurgia, tipos histológicos ou estadiamento do tumor. Conclusões Nossos dados indicam que a biópsia percutânea pode ser utilizada para a detecção do Ki67 e dos RH em pacientes com carcinoma de mama. Sugerimos que se deve considerar uma nova avaliação de RP, quando o espécime cirúrgico for negativo para RH, usando-se a biópsia percutânea.

XIV ABSTRACT Rationale The Ki67 antigen is an important breast cancer (BC) marker of cell proliferation, used as a prognostic marker. The status of hormonal receptors (HR) is critical in the management of BC patients, predicting responsiveness and prognosis. Endocrine therapy is considered ineffective in patients whose tumours show no expression of oestrogen receptors (ER) and progesterone receptors (PR). The assessment of Ki67 and hormonal receptors is usually done by immunohistochemistry on tissue sections from surgical specimen (SS). The core biopsy (CB) has become the method of choice for diagnosing lesions. Previous studies have shown that the CB can also be used to assess receptor status. Objectives To assess Ki67 and hormonal receptors immunohistochemistry expression differences between surgical specimens and core biopsy of breast cancer patients. Study design A transversal study was performed with 90 breast cancer women, without neoadjuvant therapy and submitted to breast surgery and, previously, core biopsy. A computer assisted quantitative scoring method was used to determinate Ki67 and hormonal receptor immunohistochemistry expression. All slides (core and surgical specimens) were stained and tested in the same laboratory at the same time. Results The percentage observed for Ki67 on the BP, where the average is 18,32, was statistically significantly higher than when compared to the Ki67 percentage in SS, where the average is 5,86 (p<0,001). PR expression in surgical specimens was 58,9% (53/90); while 68,9% (62/90) of cores were positive, this difference was not statically significance, even though when positive or negative results where evidenced, there was a positive tendency in BP material (p=0,108). The ER status of surgical specimens showed no statistical differences (p=0,248) between SS and CB. If a tumour was

XV defined as overall positive hormone receptor (ER+ or PR+), no differences in the assessment of receptor expression were found between SS and CB. No differences were observed when the type of surgery, histological type and staging were analysed. Final comments Our data suggests that core biopsy could be used to asses Ki67 and HR in breast cancer patients. We suggest that a new assessment should be done in CB when PR in surgical specimens is negative.

1 INTRODUÇÃO A expressão do antígeno Ki67 varia em intensidade durante o ciclo celular, sendo mais baixa durante a fase G1 e fase S e aumentando progressivamente até atingir a intensidade máxima durante a mitose 1. A ausência de expressão de Ki67 em células quiescentes e sua expressão universal em tecidos que estão em divisão geraram um grande interesse na sua utilização como marcador de proliferação celular 1. Atualmente, este antígeno é considerado o de maior acurácia na identificação da atividade proliferativa celular e existem evidências que é capaz de predizer prognóstico em pacientes com câncer de mama e linfonodos negativos, quando utilizado como única variável 2;3. A técnica imunoistoquímica é utilizada rotineiramente para a sua avaliação 3. As terapias endócrinas e a quimioterapia são opções de tratamento para pacientes com carcinoma de mama e o conhecimento do estado dos receptores hormonais é fundamental para predizer resposta e prognóstico 4. Nas pacientes que não expressam receptores hormonais no tumor, as terapias endócrinas são consideradas ineficazes e o estado dos receptores hormonais é útil na escolha do tipo de quimioterapia e na avaliação do grau de responsividade 4. A análise da expressão dos receptores hormonais por meio da técnica imunoistoquímica é considerada como um padrão para a avaliação da resposta à terapia oncológica no câncer de mama. As terapias endócrinas são recomendadas para a maioria dos pacientes com receptores hormonais positivos, de estrogênio e/ou progesterona, pela eficácia e menor

2 quantidade de efeitos colaterais 5-7 Tamoxifeno, inibidores da aromatase e ablação ovariana fazem parte da terapêutica hormonal 5;7. O uso de tamoxifeno na adjuvância é um dos maiores progressos da oncologia mundial, sendo utilizado desde 1970, e, para mulheres com tumores que apresentam receptor hormonal positivo, seu uso por 5 anos está associado com 50% na redução do risco de recidiva e 28% de redução no risco de morte pela doença em 10 anos 8 Recentemente, o uso de inibidores da aromatase de terceira geração (anastrozol; letrozol) vem sendo comparado ao tamoxifeno na adjuvância em mulheres na pósmenopausa, sendo que dados preliminares mostram que podem ser uma alternativa tão eficiente, e com menores índices de efeitos colaterais cardiovasculares 9. A terapia adjuvante seqüencial, com o uso de letrozol após 5 anos de tamoxifeno, mostrou um importante benefício na sobrevida livre de doença após 4 anos, com um índice aceitável de efeitos colaterais, e diversos estudos ainda estão em aberto, tentando encontrar o tempo ideal de tratamento 10-12. A hormonioterapia com tamoxifeno (com ou sem ablação ovariana) mostrou-se tão benéfica quanto a quimioterapia com CMF oral ou regime baseado em antraciclina em mulheres com receptor hormonal positivo, linfonodo positivo na pré-menopausa, sendo uma alternativa bem mais cômoda e barata, quando se computam os gastos com a infusão das drogas e com as intercorrências do tratamento citotóxico 13. A determinação da expressão dos receptores hormonais, de estrogênio e de progesterona, pode ser realizada por meio do método quantitativo ou semiquantitativo 4 a partir da avaliação imunoistoquímica (IQ); geralmente utilizando o espécime cirúrgico 14. A biópsia percutânea é utilizada, pré-operatoriamente, para o diagnóstico

3 das lesões mamárias e proporciona uma amostra de tecido tumoral capaz de fornecer informações sobre o estado dos receptores hormonais 14. Em muitos casos, tais como no carcinoma de mama avançado, a amostra tumoral a partir da biópsia percutânea pode ser a única amostra de tecido disponível para a avaliação destes receptores 15. Entretanto, estudos recentes mostram resultados controversos com relação a detecção dos RH a partir de material de espécimes cirúrgicos e de biópsia percutânea 16. Divergências têm surgido na literatura, sobre qual o melhor material a ser utilizado para se realizar a avaliação imunoistoquímica. Até o momento, o fator de decisão tem sido a comodidade clínica. Não há recomendações de consenso ou alguma norma que determine se a decisão terapêutica adjuvante será baseada nos resultados da IQ de biópsia percutânea ou de espécime cirúrgico. No estudo desenvolvido por Mann e colaboradores, onde 100 pacientes foram avaliados pela técnica imunoistoquímica utilizando material de biópsia percutânea e de excisão tumoral, 9% das pacientes (IC 95%, 4,2-16,4%) apresentaram biópsia percutânea positiva para receptores hormonais e resultado negativo quando a avaliação foi realizada no espécime cirúrgico 16. É importante salientar que, se a decisão terapêutica fosse baseada somente na avaliação do espécime cirúrgico, estas pacientes seriam consideradas receptores hormonais negativos e não receberiam terapia hormonal complementar. Essa discordância de resultados, apontada na literatura internacional, justifica a avaliação em nosso meio dos resultados obtidos com a IQ de biópsia percutânea e de excisão tumoral, uma vez que não apresentamos uma rotina estabelecida. O presente estudo tem como objetivo principal avaliar a expressão do antígeno Ki67 e dos receptores hormonais em espécime cirúrgico e biópsia percutânea de

4 pacientes com carcinoma de mama, utilizando a técnica imunoistoquímica, buscando contribuir para a definição da melhor opção para a detecção destes marcadores.

5 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Câncer de mama 2.1.1 Epidemiologia O carcinoma mamário é uma das neoplasias mais freqüente no mundo e a mais comum entre as mulheres 17 A cada ano, cerca de 22% dos novos casos de câncer, em mulheres, são de mama. Quando diagnosticado e tratado precocemente, o carcinoma mamário é considerado de relativo bom prognóstico. No entanto, as taxas de mortalidade por câncer de mama continuam elevadas no Brasil, muito provavelmente porque a doença ainda é diagnosticada em estádios avançados. Na população mundial, a sobrevida média após cinco anos é de 61%. No Brasil, o número de casos novos de câncer de mama esperados no ano de 2008, é de 49.400, com um risco estimado de 51 casos a cada 100 mil mulheres 17. Porém, a distribuição dos casos novos deste carcinoma varia significativamente entre os estados e capitais do país. Na região Sudeste, o câncer de mama é o mais incidente entre as mulheres, com um risco estimado de 68 casos novos por 100 mil. Sem considerar os tumores de pele não melanoma, esse tipo de câncer também é o mais freqüente nas mulheres das regiões Sul (67/100.000), Centro-Oeste (38/100.000) e Nordeste (28/100.000). Na região Norte, é o segundo tumor mais incidente (16/100.000) 17. O Rio Grande do Sul, em particular, apresenta uma incidência bastante elevada, 88,5 casos por 100.000 mulheres no estado e de 119,5 casos por 100.000 mulheres na

6 capital 17. As estimativa para o ano de 2008 são, no estado, 4.880 novos casos e na capital, Porto Alegre, 950 17. 2.1.2 Patogênese O carcinoma de mama tem uma patogênese bastante complexa. A maioria dos carcinomas de mama se origina das células que revestem o segmento dúctulo terminal da árvore mamária, na transição entre a porção ductular e acinar 18. Do ponto de vista morfológico, a maioria dos tumores malignos da mama é classificada como carcinoma ductal infiltrante. Com relação a graduação histológica, aplicada por Bloom e Richardson e modificada por Elston e Ellis 19 (Tabela 2), existe uma forte associação entre graus histológicos e prognóstico, onde o grau I tem sobrevida melhor que grau II e III 20. Os fatores de risco para o desenvolvimento do carcinoma de mama dividem-se em maiores e menores. Os fatores de risco maiores compreendem sexo feminino, idade avançada, historia familiar (CM no período pré-menopáusico em mãe, irmã, filha ou CM bilateral) 21, história pessoal de CM contra-lateral, prévio carcinoma mamário não infiltrante e alterações proliferativas mamárias benignas com atipias 22;23. Os fatores de risco menores são menarca precoce (antes dos 11 anos), menopausa tardia (após os 54 anos), obesidade após a menopausa, nuliparidade, idade da primeira gestação a termo acima dos 30 anos e exposição a radiação no tórax ou na mama 24;25. Muitos desses fatores estão relacionados à exposição de estrogênios endógenos 26, especialmente a terapia de reposição hormonal prolongada com estrogênios e progesterona (período superior a 5 anos) 27.

7 A fonte de estrogênios nas mulheres pré-menopáusicas são os ovários 28. A produção ovariana de estrogênios e progesterona diminui após a menopausa, os ovários e a camada cortical da glândula supra-renal passam a secretar basicamente androgênios. Os androgênios são convertidos em estrogênios nos tecidos periféricos (como tecido adiposo, pele, fígado, músculos e cérebro). Os níveis circulantes de estrogênio diminuem após a menopausa, entretanto a síntese periférica é aumentada e a concentração de estrogênio no tecido mamário das mulheres pós-menopáusicas pode ser tão elevada quanto aquela observada em mulheres pré-menopáusicas 28;29. Nos tumores de mama, a maior concentração de estrogênio localiza-se na gordura mamária. Este fato é parcialmente explicado pela síntese local e gradientes favoráveis que captação sérica de androgênios e estrogênio pelo tecido mamário 30. O sultafo de estrona, pode ainda ser convertido em estrogênio em tumores 31. Ressalta-se ainda que a sensibilidade do câncer de mama ao estrogênio aumenta com a idade da paciente 11. A idade continua sendo um dos mais importantes fatores de risco. As taxas de incidência aumentam rapidamente até os 50 anos, e posteriormente o mesmo se dá de forma mais lenta. Essa mudança no comportamento da taxa é conhecida na literatura como Clemmesen s hook, e tem sido atribuída à menopausa 17. Recentes avanços no campo da biologia molecular permitiram um melhor entendimento da gênese desta neoplasia. Seu desenvolvimento decorre da alteração na expressão de um conjunto de genes que controlam a proliferação celular. A maioria das mutações, nestes genes, ocorre de forma esporádica. No entanto, alguns genes, como BRCA1 e BRCA2 são classicamente envolvidos no desenvolvimento de tumores de mama com incidência familiar 32;33. Estes genes são responsáveis por 3 a 8% de todos os

8 carcinomas de mama esporádicos, mas estão presentes em até 80% dos CM familiares 34 Mulheres portadoras de mutações no BRCA1 apresentam um risco cumulativo de desenvolver câncer de mama e ovário de 87% (IC 95%, 72-95%) e 44% (IC 95%, 28-52%), respectivamente, a 70 anos de idade 35. Entre as portadoras de mutações no BRCA2, o risco é de 84% (IC 95%, 43-95%) e 27% (IC 95%, 0-47%), respectivamente 36. 2.2 Técnica Imunoistoquímica A técnica de imunoistoquímica, desenvolvida por Coons e cols. 37 em 1941, foi baseada na marcação de anticorpos com produtos fluorescentes, tais como o isocianato de fluoresceína, para a detecção de antígenos teciduais. Em 1966, Nakane e cols., substituem o isocianato de fluoresceína pela enzima peroxidase 38. Na década seguinte, com o desenvolvimento da técnica de peroxidase anti-peroxidase e o emprego de anticorpos monoclonais, observou-se um rápido e espetacular incremento no uso da imunoistoquímica nas rotinas de laboratório 39;40. Taylor e colaboradores 41 contribuíram decisivamente para a maior aplicabilidade desta técnica, demonstrando a possibilidade de detecção de alguns antígenos a partir de tecidos rotineiramente processados e emblocados em parafina. A imunoistoquímica é uma técnica fundamentalmente qualitativa, entretanto aplicações quantitativas podem ser realizadas. Seu objetivo principal é o de localizar topograficamente o antígeno na célula ou no tecido 45. Esta técnica, principalmente após o desenvolvimento de anticorpos capazes de reconhecer epítopos que não se degradam durante o processamento histológico, vem, gradativamente, substituído o método bioquímico, antes tido como o padrão-ouro, para

9 a avaliação dos receptores hormonais. O custo e a complexidade do método bioquímico são fatores que contribuíram para esta decisão 42-44. Entretanto, convém ressaltar que os resultados obtidos a partir da técnica imunoistoquímica estão fortemente associados a variáveis como o tipo de fixador utilizado, o tempo de fixação do material, a temperatura de processamento e o método de recuperação antigênica utilizado 42;43. Estas variáveis, caso não sejam criteriosamente estabelecidas, podem ser as responsáveis pela principal desvantagem da técnica que reside na discordância de resultados obtidos tanto inter-observador quanto interlaboratorial 45. Por outro lado, a atividade de enzimas endógenas, a ligação inespecífica de anticorpos a componentes teciduais se constituem também em fatores que podem afetar a especificidade da técnica. 2.3 Antigeno Ki67 e câncer de mama O antígeno Ki67 foi identificado por Gerdes e colaboradores em 1991 na cidade de Kiel (portanto Ki ), como uma proteína nuclear não histona, após a imunização de ratos com linfoma de Hodking da linhagem celular L428 (67 se refere ao número do clone) 468. Esta proteína pode ser expressa como duas isoformas de peso molecular de 320kD e 359kD, respectivamente. Este marcador de proliferação celular está presente em células de todas as fases ativas do ciclo celular, tendo relação direta com a fração de crescimento da população celular. O percentual de núcleos corados é o índice de proliferação celular. Um baixo

10 índice de proliferação celular está associado a um menor crescimento tumoral e melhor prognóstico. 47 A expressão do Ki67 pode ser detectada a partir de tecido fresco ou fixado e incluído em bloco de parafina. Utiliza-se como referência a porcentagem de núcleos de células tumorais positivamente coradas pelo anticorpo 48. Acredita-se que o ponto de corte para avaliar valor prognóstico do Ki67 no carcinoma de mama inicial varie entre 15 a 22% 49. A expressão do Ki67 é significativamente maior no carcinoma de mama ductal invasor que no carcinoma ductal invasor com componente intraductal 50. Martínez-Arribas e colaboradores avaliaram a proliferação tumoral no carcinoma de mama por meio da citometria de fluxo e da técnica imunoistoquímica (Ki67) para determinar o método que melhor avalia tumores com alta e baixa proliferação celular em relação a parâmetros clínicos e biológicos 51. Os autores concluiram que apesar da citometria de fluxo fornecer dados que podem ser correlacionados com a invasão linfonodal, a determinação da expressão do Ki67 pela técnica imunoistoquímica é um método mais simples, rápido, de pouco custo e fidedigno no estudo da proliferação celular no carcinoma de mama 51. Diferentes estudos mostra evidências sobre o potencial da expressão do Ki67 em discriminar grupos de bom e mau prognóstico, entre as pacientes com carcinoma de mama e linfonodos negativos, quando considerado como única variável 2;52-56. A associação da expressão do Ki67 e a resposta ao tratamento médico no carcinoma de mama parece ser clara 48. Alguns estudos relatam a capacidade de altos valores do Ki67 em predizer melhor resposta (clínica e patológica) à quimioterapia 57;58.

11 Jones e colaboradores 59 compararam a expressão do Ki67 no carcinoma de mama e o significado prognóstico, antes e após a quimioterapia neodjuvante. Neste estudo, o Ki67 mostrou-se um fator prognóstico de desfecho (recidiva e sobrevida livre de doença) nos casos em que não houve resposta tumoral completa. No entanto, existem controvérsias com relação ao valor preditivo do Ki67 e a resposta a quimioterapia neoadjuvante 60 61-64. 2.4 Receptores Hormonais e câncer de mama No início da década de 70 os receptores de estrogênio foram identificados e foi postulada a teoria que os tumores de mama que contivessem grande quantidade de receptores de estrogênio responderiam a terapia endócrina, entretanto, na época havia pouca evidência clínica que embasasse esta hipótese 65. Hoje, no entanto, a importância dos receptores hormonais (estrogênio e progesterona) é reconhecida na biologia do câncer de mama. Cerca de 60% dos tumores de mama expressam esses receptores 28;66;67. Estrógenos são necessários para o crescimento e sobrevida do epitélio mamário 68. Efeitos estrogênicos são mediados pela ligação do hormônio a fatores transcricionais chamados de receptores de estrogênio. Estes receptores são proteínas que se dimerizam e ligam-se a seqüências no DNA denominadas elementos responsivos ao estrogênio na região promotora dos genes-alvo aumentando a transcrição destes genes, os quais incluem o receptor de progesterona 65;69.

12 A estrutura do receptor de estrogênio é importante para a sua função, além de um domínio que se liga ao estrogênio e outro que se liga ao DNA após a dimerização, apresenta duas regiões de de transativação, uma no sítio de binding (AF2) e outra no domínio N-terminal (AF-1). Esta transativação consiste na ligação das regiões AF a fatores gerais de transcrição aumentando a velocidade basal de transcrição e que se dá através do recrutamento de co-ativadores que são moléculas adaptadoras 70. Estes ativadores não só trabalham por ligações aos fatores gerais de transcrição do TATA box, mas têm atividade enzimática de acetilase que modifica histonas e estrutura cromatínica, facilitando o acesso ao promotor. Portanto, podemos postular um mecanismo de dois passos para a ativação gênica por receptores esteróides: 1) receptor/co-ativador induzem remodelação da cromatina que permite um acesso maior dos fatores de transcrição gerais ao promotor, e 2) estabilização dos fatores gerais de transcrição ao promotor via interação proteína-proteína com complexo receptor/coativador 65;69. Outro receptor de estrógeno, o ER β, foi recentemente descrito em próstata e células granulosa do ovário e o clássico receptor de estrogênio passou a ser identificado como RE α. Ambos ligam-se a elementos responsivos ao estrogênio e aos mesmos ligantes, mas com diferentes afinidades 71. Estes receptores tem uma grande similaridade no domínio de ligação ao DNA (96%) e são muito diferentes no domínio de ligação ao hormônio (58%), as regiões AF também não são homólogas. RE α e ER β são coexpressos em vários tumores de mama, mas sua distribuição tissular parece ser bastante variável 71;72.

13 As propriedades físico-químicas de ambos os subtipos são discretamente diferentes na dependência dos ligantes 73. A existência de dois subtipos indica duas possíveis vias de sinalização estrogênica: via subtipo beta, em tecidos exclusivamente expressando esse subtipo, e via formação de heterodímeros, em tecidos expressando ambos os subtipos 74. Uma vez que a expressão do receptor de progesterona é induzida pelo receptor de estrogênio, o RP tem sido estudado como um marcador substituto de atividade do RE e tem sido utilizado como um fator preditivo adicional para a terapia hormonal no carcinoma de mama. A análise de estudos clínicos randomizados em carcinoma de mama mostram que os receptores de progesterona possam aumentar o poder preditivo de resposta a endocrinoterapia dos receptores de estrogênio 8. O receptor de progesterona também prediz resposta a terapia endócrina no carcinoma de mama metastático 75. O RP sozinho tem sido associado com fraco fator prognóstico e preditivo quando comparado ao receptor de estrogênio 8. A avaliação dos receptores hormonais de estrogênio e progesterona em tumores de mama tem sido utilizada na pratica clínica há 25 anos para determinar prognóstico e predizer resposta a hormonioterapia 76. Entretanto, somente no início da década de 1990 ocorre o uso difuso da determinação imunoistoquímica para a avaliação de RE e RP no carcinoma de mama, quando os anticorpos monoclonais se disponibilizam amplamente no comércio 47. O ensaio bioquímico, até então muito utilizado, foi quase totalmente substituído pela imunoistoquímica na determinação dos receptores hormonais quando estudos evidenciaram que as duas técnicas apresentavam resultados concordantes 77.

14 Na prática clínica, dúvidas surgem sobre como melhor avaliar a coloração dos RE e RP 47. Ambos Barnes e colaboradores 78 e Fisher e colaboradores 79 compararam a habilidade de múltiplos sistemas de escores em predizer resposta a tratamento e encontraram que todos apresentaram correlação estatisticamente significativa com desfecho. O Grupo Internacional de Estudos de Câncer de Mama dividiu as células em três categorias de acordo com a coloração imunoistoquímica e a resposta ao tratamento hormonal adjuvante: ausência de coloração, baixa coloração (1 a 9% das células coradas) e elevada coloração ( superior a 10% das células coradas) 80. A maioria dos tumores apresenta ou ausência de coloração (22%) ou elevada coloração (75%), apenas 3% dos tumores pertencem ao grupo com 1-9% das células coradas. 80 O estrógeno desempenha um papel mitogênico no desenvolvimento do câncer de mama. Desta forma, a inibição de sua síntese ou bloqueio de sua ação são estratégias importantes no tratamento da neoplasia de mama. A terapia endócrina adjuvante é recomendada a mulheres com tumores de mama expressam receptores de estrogênio ou progesterona. Nas mulheres pré-menopáusicas, as opções endócrinas incluem tamoxifeno, ablação ou supressão ovariana ou uma combinação de ambos. O tamoxifeno age ligando-se competitivamente ao receptor de estrógeno no tecido tumoral e em outros tecidos, formando um complexo nuclear que diminui a síntese de DNA, inibe os efeitos do estrógeno e acarreta a parada de crescimento celular, sendo considerado um forte antagonista do estrógeno. Foi aprovado pela FDA (Food and Drug Administration) em 1977 para o tratamento do carcinoma de mama avançado e anos mais tarde foi aprovado para o tratamento adjuvante do carcinoma de mama primário 81.

15 O uso do tamoxifeno por cinco anos em pacientes com receptores hormonais positivos reduz a recorrência local e contralateral de 47% e a mortalidade de 26% quando comparado a placebo 8. Entretanto, sua utilização não evidenciou benefício além dos cinco anos de uso, pelo contrário. O estudo NSABP B-14 (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol B-14) mostrou que seu uso por um total de dez anos acarretou um decréscimo na sobrevida livre de doença. É possível que isso se deva ao desenvolvimento de ação agonista do tamoxifeno na mama após um determinado período 82. O EBCTCG (The Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group) confirma o benefício da ablação da função ovariana em mulheres com idade inferior a 50 anos na sobrevida global e sobrevida livre de doença 83. De fato, um dos efeitos benéficos observados após quimioterapia adjuvante em mulheres com tumores que expressam receptores hormonais é atribuído aos efeitos citotóxicos no ovário, que induzem a sua supressão. E a indução de amenorréia após quimioterapia em tais pacientes prediz aumento da sobrevida 84. Mulheres pós menopáusicas apresentam um quantidade maior de receptores estrogênio positivos que pré-menopausicas. Entretanto, a relação entre receptores de progesterona e a idade não é significativa 85. A expressão de receptores hormonais confere características próprias a estes tumores, caracterizada por uma boa resposta ao tratamento hormonal, com baixas toxicidade e custo. Essas características ocorrem independente da idade, do estado menopausal e do comprometimento linfonodal 8. Estima-se que cerca de 50-60% das mulheres com tumores receptor hormonal positivo

16 respondam à hormonioterapia, sendo que a taxa de resposta é proporcional à concentração do receptor 75. Nas mulheres pós-menopáusicas o tamoxifeno era o único tratamento disponível, até a introdução dos inibidores da aromatase Arimidex após o estudo ATAC em 2002 (Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination) 9. Os inibidores da aromatase (IA) são moléculas que atuam inibindo a enzima (aromatase) responsável pela conversão periférica de androstenediona e testosterona em estradiol e estrona. Ao contrário do tamoxifeno, os IA não possuem atividade agonista 12. Existem várias gerações de IA disponíveis no mercado atualmente, sendo classificados em geração, de acordo com a sua ordem de desenvolvimento clínico e em tipos, de acordo com o mecanismo de ação. Os do tipo 1 são análogos esteroidais da androstenediona, ligandose irreversivelmente à mesma. Os do tipo 2 são não-esteroidais e se ligam de forma reversível à enzimana mama e possui efeitos agonistas fracos em diferentes tecidos, como o endométrio 42 Existem duas formas de incorporação dos inibidores da aromatase na adjuvância do câncer de mama: substituindo o tamoxifeno ou seqüencialmente ao tamoxifeno. O primeiro estudo desenhado para avaliar se um IA poderia substituir ou complementar o tamoxifeno com eficácia foi o estudo ATAC 9. As pacientes foram randomizadas após a cirurgia para cinco anos de adjuvância com tamoxifeno isolado, anastrozol isolado ou a combinação das duas drogas. O estudo mostrou uma diferença pequena, porém estatisticamente significativa favorável ao anastrozol. A sobrevida livre de doença em três anos foi de 89,4% no braço do anastrozol e de 87,4% no tamoxifeno, com risco relativo (RR) de 0,83 (p = 0,005). A combinação dos dois medicamentos não mostrou diferenças estatisticamente significativas.

17 O anastrozol também foi superior ao tamoxifeno em termos de recorrência, com RR de 0,74 (p = 0,0002) e incidência de câncer contralateral, RR de 0,47 (p = 0,001). Houve uma tendência a um maior tempo para recidiva a distância com o IA com RR 0,84 (p = 0,06). Entretanto, não houve nenhuma diferença significativa em termos de sobrevida global e específica, porém o número destes eventos em cinco anos ainda é pequeno. Em todos os subgrupos de pacientes com receptores hormonais positivos, o benefício em termos de tempo de recorrência foi mantido, tanto em linfonodos positivos e negativos e naquelas pacientes que receberam quimioterapia prévia ou não. Esta diferença foi ainda maior nas pacientes com RE+/RP-, quando comparado ao grupo RE+/RP+ 9. O uso de anastrozol após dois a três anos de tamoxifeno trouxe benefício em termos de sobrevida livre de doença com RR 0,60 (p = 0,0009), em um seguimento de 28 meses. Este benefício foi observado independentemente do status nodal ou grau tumoral. A sobrevida livre de recorrências a distância foi melhor no grupo que permaneceu em tamoxifeno, com RR de 0,61 (p = 0,067). A sobrevida global não foi estatisticamente significativa 9. Vários estudos 86;87 mostram que os tumores com receptor de estrógeno positivo e progesterona negativo (RE+RP-) são resistentes ao tamoxifeno. Nesse subgrupo particular, a vantagem de anastrozol sobre o tamoxifeno mostrou-se maior 88. Os tumores que apresentam positividade para o HER-2 têm de forma geral um pior prognóstico e são mais resistentes ao tratamento quimioterápico e endócrino usual 89. A taxa de resposta com o uso do letrozol foi mais elevada do que com o tamoxifeno (88%

18 e 21%, p = 0,0004) na neo-adjuvância nos tumores RE+ e HER-2 + 86. Apesar dessas observações, a Sociedade Americana de Oncologia Clínica não recomenda a escolha de inibidor de aromatase para tratamento adjuvante do câncer de mama, baseada nesses critérios 90. A terapia hormonal não é utilizada nos tumores com ausência de receptores de estrogênio e progesterona 90. O Grupo Internacional de Estudos de Câncer de Mama, recentemente, no Consenso de St. Gallen (10th International Conference St. Gallen, Saint Gallen, Swiss), determinou a divisão do carcinoma de mama em três grupos de acordo com a resposta a terapia endócrina: grupo responsivo, grupo de resposta incerta e não responsivo de acordo com a quantidade de células coradas de RH, superior a 10%, 1-9% e 0 respectivamente 4;91. As recomendações de consenso são amplamente seguidas na Europa e nos Estados Unidos da América, sugerindo que a resposta à terapia endócrina deve orientar a escolha da terapia sistêmica adjuvante, um paradigma que impõem que a reprodutibilidade da coloração dos RH seja fundamental 4;47;91. 2.5 Receptores hormonais e Carcinoma ductal in situ A coloração imunoistoquímica de RE no carcinoma ductal in situ (CDIS), a diferença do que ocorre no carcinoma invasor, tem sido recentemente estimada pelo potencial beneficio à terapia hormonal com o tamoxifeno. O estudo do NSABP B-24 (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol B-24) estudou de forma randômica 1804 mulheres tratadas com quadrantectomia e radioterapia que receberam tratamento com tamoxifeno por 5 anos ou palcebo. Os resultados mostraram que o grupo que recebeu tamoxifeno apresentaram menos desfecho carcinoma de mama que o

19 grupo que recebeu placebo (8.2 vs 13.4%, p=0.0009). Houve uma redução carcinoma de mama ipsilateral e novo tumor na mama contra-lateral no grupo que recebeu terapia adjuvante com tamoxifeno quando comparado com palcebo (RR 0,63; p<0,001) 92;93. Em 2003 a Universidade de Baylor e os investigadores do NSABP publicaram os resultados preliminares de um estudo retrospectivo que relaciona coloração dos RE e desfecho do estudo B-24. Dos 628 casos de CDIS (327 que pertenciam ao grupo placebo e 301 do grupo tamoxifeno) a maioria (77%) eram RE positivo, sendo claramente beneficiadas pela terapia adjuvante com o tamoxifeno, que reduziu a recorrência de câncer de mama ipsilateral e a de novo tumor na mama contra-lateral (RR 0,41; p<0,001). As pacientes ER negativo mostraram pouco benefício com a terapia hormonal (RR 0,80; p<0,51), mas o número de desfechos foi muito pequeno para conclusões sobre significado clínico 94. A expressão dos receptores de estrogênio no carcinoma de mama não mostra diferença estatística entre carcinoma ductal invasor e carcinoma ductal invasor com componente intra-ductal. Entretanto, a expressão dos receptores de progesterona no carcinoma ductal invasor apresenta, significativamente, uma menor intensidade no carcinoma ductal invasor com componente intra-ductal 50. A presença de receptores hormonais na biópsia percutânea e na peça cirúrgica é equivalente em torno de 97% das vezes 95, sendo que a sensibilidade da biópsia inicial pode ser muito superior, principalmente se há retardo na cirurgia, injúria mecânica na mama e uso de quimioterapia neoadjuvante 95;96 Não existe diferença significativa entre os vários métodos de fixação, sendo a parafina o mais usado. No entanto, o preparo da lâmina deve ser feito idealmente em até 30 minutos, e nunca após 24-48 horas, e a

20 estocagem por períodos prolongados pode destruir os receptores hormonais, diminuindo a positividade em estudos posteriores 97. Quando se analisa a intensidade dos receptores hormonais (pelo H escore), observa-se que esta é significativamente maior na biópsia percutânea, sendo que o grau de positividade diminui da periferia do tumor para o centro 98.

21 3. JUSTIFICATIVA PARA O ESTUDO Até o momento não existe um consenso se a avaliação da expressão dos receptores de estrogênio, progesterona e Ki67 através da IQ deva ser realizada a partir da biópsia percutânea ou do espécime cirúrgico naquelas pacientes que realizaram a BP prévia ao tratamento cirúrgico. Dúvidas têm surgido na literatura sobre qual o melhor material para se realizar a avaliação imunoistoquímica. Até o momento a decisão tem sido baseada na comodidade clínica, uma vez que não parece haver diferenças nos resultados obtidos através da biópsia percutânea e do espécime cirúrgico. No estudo desenvolvido por Mann e cols 16 onde 100 pacientes foram avaliados para estudo IHC de fragmentos de biópsia percutânea e do espécime cirúrgico, 9% das pacientes (IC 95%, 4,2-16,4%) apresentaram biópsia percutânea positiva para receptores hormonais e resultado negativo quando a avaliação foi realizada no espécime cirúrgico. Caso a decisão terapêutica fosse baseada somente na avaliação da biópsia cirúrgica, estas pacientes seriam consideradas receptores hormonais negativo e não receberiam terapia hormonal complementar. Esta discordância de resultados apontada na literatura internacional justifica a avaliação em nosso meio dos resultados obtidos com a IQ de espécime cirúrgica e de biópsia percutânea, uma vez que não apresentamos uma rotina estabelecida.

22 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo Geral: Avaliar a expressão de Ki67 e de receptores hormonais em material de espécime cirúrgico e biópsia percutânea de pacientes com câncer de mama. 4.2 Objetivos Específicos: 4.2.1 Avaliar, por meio da técnica imunoistoquímica, a expressão do Ki67 em material de biópsia percutânea e de espécime cirúrgico de câncer de mama feminino. 4.2.2 Avaliar, por meio da técnica imunoistoquímica, a expressão dos receptores de estrogênio e de progesterona, em material de biópsia percutânea e de espécime cirúrgico de câncer de mama feminino. 4.2.3 Examinar a relação entre os resultados da técnica imunoistoquímica e dados demográficos e clínico-patológicos. 4.2.4. Comparar os resultados obtidos em material de espécime cirúrgico e de biópsia percutânea

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32 6. Artigo em inglês Immunohistochemestry assessment of Ki67, estrogen and progestogen receptors in breast cancer surgical specimen and core biopsy Fabiane S. Barbosa M.D. b*, Antonio L. Frasson M.D. Ph.D c, Márcia GraudenzM.D. Ph.D. d, Vinícius Duval Da Silva M.D. Ph.D. e, Felipe P. Zerwes M.D. Ph.D. f, Marcelle Moraes Dos Santos g, Felipe Loss h, Cláudio O. P. Alexandre Ph.D a* a Molecular Biology Laboratory - Research Center and Post-graduating, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) Porto Alegre, RS, Brazil b Breast Surgeon of Centro de Mama do Hospital São Lucas da PUCRS c Professor of Department of Ginecology and Obstetrics da PUCRS and Gerontology Post graduation. Breast Surgean Department Director- Centro da Mama (HSL-PUCRS). d Professor of Pathology and Post-Graduating of Patology, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) e Professor of Pathology and Radiation of HSL da PUCRS f Professor of Department of Ginecology and Obstetrics da PUCRS.Breast Surgean of Centro da Mama (HSL-PUCRS). g,h Graduate student, Faculty of Medicine, PUCRS Contact number: Fabiane S. Barbosa, Cláudio O. P. Alexandre Molecular Biology Laboratory, UFCSPA Address: Rua Sarmento Leite, 245 Porto Alegre, RS Brazil, ZIP CODE 90050-170 Phone: + 51 33039000 E-mail: fabianesb@uol.com.br ; calex@ufcspa.edu.br Key works: hormonal receptors, breast cancer, surgical specimen, core biopsy

33 ABSTRACT Rationale The Ki67 antigen is an important breast cancer (BC) marker of cell proliferation, used as a prognostic marker. The status of hormonal receptors (HR) is critical in the management of BC patients, predicting responsiveness and prognosis. Endocrine therapy is considered ineffective in patients whose tumours show no expression of oestrogen receptors (ER) and progesterone receptors (PR). The assessment of Ki67 and hormonal receptors is usually done by immunohistochemistry on tissue sections from surgical specimen (SS). The core biopsy (CB) has become the method of choice for diagnosing lesions. Previous studies have shown that the CB can also be used to assess receptor status. Objectives To assess Ki67 and hormonal receptors immunohistochemistry expression differences between surgical specimens and core biopsy of breast cancer patients. Study design A transversal study was performed with 90 breast cancer women, without neoadjuvant therapy and submitted to breast surgery and, previously, core biopsy. A computer assisted quantitative scoring method was used to determinate Ki67 and hormonal receptor immunohistochemistry expression. All slides (core and surgical specimens) were stained and tested in the same laboratory at the same time.

34 Results The percentage observed for Ki67 on the BP, where the average is 18,32, was statistically significantly higher than when compared to the Ki67 percentage in SS, where the average is 5,86 (p<0,001). PR expression in surgical specimens was 58,9% (53/90); while 68,9% (62/90) of cores were positive, this difference was not statically significance, even though when positive or negative results where evidenced, there was a positive tendency in BP material (p=0,108). The ER status of surgical specimens showed no statistical differences (p=0,248) between SS and CB. If a tumour was defined as overall positive hormone receptor (ER+ or PR+), no differences in the assessment of receptor expression were found between SS and CB. No differences were observed when the type of surgery, histological type and staging were analysed. Final comments Our data suggests that core biopsy could be used to asses Ki67 and HR in breast cancer patients. We suggest that a new assessment should be done in CB when PR in surgical specimens is negative.

35 Introduction Ki67 is a nuclear non-histone protein expressed universally in proliferating tissues, used as marker of cell proliferation 1, 2. Many studies show the ability of KI67 to discriminated between a good and bad prognosis group in the node negative population when considered as a single variable 3-9. The assessment of hormone receptors is fundamental for the treatment of patients with breast cancer, predicting responsiveness and prognosis 10, 11. In patients whose tumours do not express oestrogen (ER) or progesterone receptors (PR), any form of endocrine therapy is considered effective 10. The assessment of hormone receptors and Ki67 in breast cancer is usually done by immunohistochemistry on tissue sections from surgical specimen (SS) 12. The core biopsy (CB) has become the method of choice for diagnosing lesions in many centres 13. Studies show that the assessment of hormone receptors can be done using core biopsy material without negatively affecting analysis 12. In many cases, such as in advanced breast cancer, a tumour sample taken from core biopsy can be the unique tissue sample for the assessment of hormone receptors 14. Controversial results have been seen, however, regarding the hormonal receptors assessment on tissue sections from surgical specimen and core biopsies 14. The decision, till now, is based on the clinical convenience. There are no consensus recommendations or standards to determine if the therapeutic decision about endocrine therapy will be based on immunohistochemestry results of surgical specimens (SS) or core biopsies (CB). The objective of this study is to assess the Ki67 antigen and hormonal receptor immunohistochemistry expression assessment in surgical specimens (SS) and core

36 biopsies (CB) in breast cancer patients, help seeking to define the best option to assess these markers. Study design A transversal study was performed with 90 breast cancer patients, without neoadjuvant therapy and submitted to breast surgery and, previously, core biopsy on Centro de Mama do HSL da PUCRS. A computer assisted quantitative scoring method was used to determinate Ki67 cell proliferation and hormonal receptor immunohistochemistry expression. The average age was 55,57 years old (34-85 years old). The histological assessment and degree of differentiation of tumours was acording the World Health Organization and the Elston e Ellis classification 15, 16. Histological evaluation of core and surgical specimens material classified the tumors in infiltrating ductal carcinomas, ductal carcinoma in situ, lobular infiltrating carcinoma and special type carcinoma (medullary, papillary and inflammatory). The other histological subtypes were not found in the studied patients. The study was approved by the ethics committee of São Lucas Hospital of PUCRS and FFFCMPA. Immunohistochemistry A computer assisted quantitative scoring method was used to determinate Ki67 and hormonal receptor immunohistochemistry expression. All slides (core and surgical specimens) were stained and tested in the same laboratory at the same time.

37 The paraffin blocks (for the core biopsy and the surgical specimen) were cut and underwent immunohistochemistry. The elements were deparaffinised, rehydrated using xilol, pure ethylic alcohol, 70% and 50% alcohol and destilled water alternately, for five minutes for every bathing, at room temperature. Antigenic recuperations was performed through the immersion of the films in Tris-EDTA buffer, ph 9.0 in a water bath up to 92 O C for 30 minutes and, following this, leaving it for 20 minutes at room temperature. Subsequently, the blocking of endogenous peroxidase was performed, with a solution of oxygenated water 5% (H 2 O 2 ) in methanol for 10 minutes, at room temperature. at 30V. The blocking of unspecific reactions was performed with BSA at 1% for 30 minutes. The estrogen recetor (ER) assessment was performed with ER, 6F11 clone Novocastra, diluted at 1/200. The positive control used was breast tissue. For PR, 16 clone, Novocastra, was used diluted at 1/150. For Ki67, MIB-1 clone, Dakocytomation, was used diluted at 1/200. Incubation with the biotinylated secondary antibody was performed for 40 minutes at room temperature. Subsequently, the substrate was revealed with chromogen (DAB) and counter-coloured with hematoxiline and dehydration. The films were mounted with Entellan (Merck, Darmstadt, GER). The films were labelled with data regarding the patient s paraffin block and assessed by two examiners, under a double optical microscope with the diameter of the field being 20mm and after digitalized of images. For assessing the HR and Ki67, an attempt was made to identify the tumour hotspots. For cases considered to be negative, HR and Ki67 were identified in non-tumoural breast tissue when present, for internal controls. An immunohistochemical assessment of the Ki67 protein was also used to evaluate the suitability of the material for study.

38 For ER and PR results, we adopted the criteria of Breast International Group (BIG) that divided the cells in three groups according with the immunohistchemical and response to endocrine therapy: absent stained cells, equivocal (present 1-9% stained cells) and positive ( 10% stained cells). Tumors designate receptors as equivocal presents weak or none response to endocrine therapy, and are considerate as negative. We accepted as positive at least 10% of stained cells. Statistical analysis Considering a significance level (α) of 5% and power of 20%, the minimum estimated sample size was 90 cases. The presumed sampling error was 2.6%, in accordance with the variability evidenced in the sample. Kolmogorov-Smirnov assessed the non-parametrical distribution of Ki67 values. The Wilcoxon test was used to assess Ki67 immunohistochemistry differences between core biopsies and surgical specimens. A measure of central tendency (median, mediana) and quartis division was analysed. McNemar was used to valuate the disagreement of the pared sample of PR and ER data. Results The percentage observed for Ki67 on the BP, where the average is 18,32, was statistically significantly higher than when compared to the Ki67 percentage in SS, where the average is 5,86 (p<0,001) (Figure 1). The ER status of surgical specimens showed positivity in 54/90 cases (60%); while 61/90 cores (67.8%) were positive, no statistical differences were observed (p=0,350). PR expression in surgical specimens was 58,9% (53/90); while 68,9% (62/90) of cores were positive, this difference was not statically

39 significance, even though when positive or negative results where evidenced, there was a positive tendency in BP material (p=0,108). There was concordance between the ER assessment of core and surgical specimen in 70% at the level of positive and negative cases and 72% for PR. If a tumour was defined as an overall positive hormone receptor (ER+ or PR+), no differences in the assessment of receptor expression were found between surgical specimens and core biopsies. No differences were observed when HR and Ki67 were determined on BP and SS when the type of surgery, histological type, tumoral grade, metastatic linfonodes or time between BP and surgery were analysed (Table 2-6). The evaluation of ER in SS, when compared type of surgery, showed a statically significant difference (p=0,022), patients who underwent a mastectomy were found more negative than patients who underwent to setorectomy. The same was not observed on PR in SS. Discussion Definitions of cut off for KI67 vary and hamper comparisons between studies: it is considered more helpful as a continuous variable 9. In our study Ki67 was statistically significantly higher in core biopsy than surgical specimen evaluation (p<0,001). Possible reasons for this variation are the rapid fixation of the core compared with the whole tumour of the surgical specimen. Core biopsies spend a shorter time in fixative before being processed, while the tumour in surgical specimen need a longer fixation periods. It can be assumed that the core biopsies were uniformly and rapidly fixed along their length immediately after excision 17.

40 The core biopsy (CB) seems to reflect the results of the surgical specimen (SS) in defining the hormone receptors 14, 18. The results of the Zidan and Cols study evidence that the CB used in the diagnosis of breast cancer offer a sufficient quantity of tumoural cells for the immunohistochemical assessment of the oestrogen receptors 14. It is believed that the determining of the HR is the surgical specimen is the gold standard and that the core biopsy is trustworthy in the immunohistochemical assessment of oestrogen receptors, however, less reliable in the assessment of progesterone receptors 14, 18. In our study, this difference was not evidenced. The differences obtained between CB and SS can be explained, partially, by tumoural heterogeneity, present in some tumours, and by the occasional differences in fixation 14. Tumoural heterogeneity is evidenced in the IQ for HR through the grouping of negative tumoural niches, clearly positive and strongly positive in the same film 14. In our study, some tumours were observed whose peripheral area contained more intense coloration than the central area, as well tumours in which some central sections did not display coloration for HR. This fact can be explained by an extensive area of central fibrosis or an artefact, due to the better fixation and preservation of cells located in the tumoural periphery 14. In our analyses, this fact did not significantly affect the results, as areas of greater concentrations of coloured nuclei, or hotspots. Another explanation for the discrepancies found is the different fixation regarding CB and SS, due to the size of the material 13, 14, 18. This could also be an explanation for to the differences observed in the evaluation of ER in SS of mastectomy and setorectomy. The CB is made up of small

41 fragments that are rapid and fixed better when compared to SS 14, 18, as well as the SS of setorectomy which are smaller than mastectomy. Formalin fixation induces cross-links between proteins and nucleic acids that are necessary for immunohistochemical analysis. Problems of delayed fixation, underfixation, and overfixation with formalin have been reported 18, 19. Delayed fixation can allow proteolytic degradation of the antigen, this degradation has been demonstrated in assays for both ER and PR. 20 Underfixation means that the periphery of a specimen may be properly fixed while the center is not. This process would lead to more intense staining either at the periphery or the center of the lesion, depending on the antigen and the antibody used. Prolonged fixation may lead to weak or absent staining, depending on the individual epitope 20. Douglas-Jones and Cols, in comparing core biopsy and surgical specimen, demonstrate coloration that is 35% lower in surgical specimen when compared to core biopsy by way of immunocytochemical analysis. The authors also observed that the periphery of tumours is generally of a more intense colour than the centre. This variation in coloration is not observed in core biopsy material 17. Mann and Cols partially explain this inconsistency between CB and CE in one tumour in a patient due to the variability of immunohistochemistry and fixation techniques. Greater immunoreactivity in CB for PR seems to reflect an increase in the preservation of immunoreactivity due to the rapid fixation that occurs in CB 17, 18. Another explanation for this finding seems to be the greater chance of peripheral tumoural sampling with core biopsy 17. There are reports from negative hormone receptor patients that demonstrate a response to hormone therapy, increasing the probability that these are false negative 18. An

42 exam of the normal mammary epithelium is fundamental in films in which the hormone receptors are negative, seeing as it serves as a positive internal control 18. In cases in which there was no expression of hormone receptors, the possibility of a false negative must be assessed 18. For this reason, reaction control becomes necessary. The quality control for the material was performed by with the Ki67. All the cases (core biopsy and surgical specimen) expressed this marker of tumoural proliferation. There has been discussion about heterogenicity of the expression of ER in breast cancer 17. There is not a precise definition regarding tumoural heterogeneity 17. Some tumours express ER strongly in some areas and they are clearly positive or even negative in others. This type of heterogeneity which depends on two cellular subclones (one positive and another negative) is uncommon, being present is 0.5% of breast cancer. In this study, we observed tumoural heterogeneity in 3 cases (3%). Possible reasons for different results from core and surgical specimens include sampling error, with the core biopsy not reflecting the status of the entire tumor. Fixation artifact, with the delay in exposure of the center of a surgical specimen to formalin, result in bigger negativity 18. The small number of negative cases on core and positive on surgical specimens could be an sample problem. If a tumour was defined as overall positive hormone receptor (oestrogen or progesterone receptors positive), no differences in the assessment of receptor expression were found between surgical specimen and core biopsy. Disagreement on hormonal assessment in breast cancer patients could influence the endocrine treatment, when the therapeutic decision is based in one or other method to

43 assess the hormonal receptors. Our date suggests that a new assessment should be done on core biopsy when the surgical specimen is negative. Conclusion Our data suggests that core biopsy could be used to asses Ki67 and HR in breast cancer patients. We suggest that a new assessment should be done in CB when PR in surgical specimens is negative.

44 Table 1. Demographic, Clinical, and Pathologic Characteristics of Cases Characteristic Age, years Median Range Breast surgery Total mastectomia Breast conservation Axillary surgery Sentinel-node biopsy Axillary dissection Pathology In situ carcinoma Invasive ductal Invasive lobular Special type Size (TNM classification) Tis T1 T2 T3 Axillary envolvment (TNM classification) N0 N1 N2 N3 Tumoral grade (Bloom e Richardson classification) G1 G2 G3 No classification No. of Patients (n=90) 55,57 34-85 39 51 40 50 05 64 14 07 5 44 40 1 58 21 6 5 5 44 32 9

45 Table 2: Simple and relative frequency distribution for ER and PR and measures of central tendency and variability for Ki67, according to type of surgery. ER* PR* KI67 PB SS PB SS Mastectomy (n=39) Type of Surgery Setorectomy (n=51) Positive 24 (61,5) 37 (72,5) Negative 15 (38,5) 14 (27,5) Positive 20 (51,3) 34 (66,7) Negative 19 (48,7) 17 (33,3) Positive 25 (64,1) 37 (72,5) Negative 14 (35,9) 14 (27,5) Positive 21 (53,8) 32 (62,7) Negative 18 (46,2) 19 (37,3) p (value) Total (positive) 0,379 A 61 (67,8) 0,140 A 54 (60,0) 0,530 A 62 (68,9) 0,526 A 53 (58,9) AA ± SD 16,4 ± 115,2 19,7 ± 15,8 18,3± 14,5 PB P 50 (P 25 -P 75 ) 10,3 13,4 0,308 12,3 (6,1 23,1) (7,1 30,0) (7,0 27,9) p (value) 0,350 B 0,214 B <0,001 D AA ± SD 4,8 ± 8,3 7,3 ± 10,9 5,8 ± 7,6 SS P 50 (P 25 -P 75 ) 2,0 3,9 0,050 C 3,2 (0,5 5,3) (0,9 8,7) (0,6 7,4) * Values are presented as n(%), where the percentage was obtained from each group; aritimetical average ± SD; P25- includes 25% of samples with smaller or same values defined for Q1; P50= mediana: includes 50% of sample with smaller or same values defined for Q2; P75: includes 75% of samples with smaller or same values defined for Q3; A: test X 2 Pearson; test of Mann-Whitney D: Test of Wilcoxon.

46 Table 3: Simple and relative frequency distribution for ER and PR and measures of central tendency and variability for Ki67, according to histological type. ER* PR* PB SS PB SS CDI + CDImic (n=64) Histological Type CLI (n=14) Cdis+ca+T (n=12) Positive 43 (67,2) 10 (71,4) 8 (66,7) Negative 21 (32,8) 4 (28,6) 4 (33,3) Positive 38 (59,4) 8 (57,1) 8 (66,7) Negative 26 (40,6) 6 (42,9) 4 (33,3) Positive 43 (67,2) 8 (57,1) 11 (91,7) Negative 21 (32,8) 6 (42,9) 1 (8,3) Positive 37 (57,8) 8 (57,1) 8 (66,7) Negative 27 (42,2) 6 (42,9) 4 (33,3) AA ± SD 19,1±16,1 14,2±14,2 17,7±13,8 PB P 50 (P 25 -P 75 ) 13,4 (7,8-27,4) 8,0 (3,1-25,1) 9,5 (7,4-30,6) p (value) 0,950 A 0,869 A 0,143 A 0,840 A 0,375 C KI67 AA ± SD 5,3±8,1 5,9±7,6 11,4±17,7 SS P 50 (P 25 -P 75 ) 3,2 0,505 C 3,0(0,6-5,5) 5,5(1,0-8,6) (0,9-8,0) * Values are presented as n(%), where the percentage was obtained from each group; aritimetical average ± SD; P25- includes 25% of samples with smaller or same values defined for Q1; P50= mediana: includes 50% of sample with smaller or same values defined for Q2; P75: includes 75% of samples with smaller or same values defined for Q3; A: test X 2 Pearson; test of Mann-Whitney D: Test of Wilcoxon.

47 Table 4: Simple and relative frequency distribution for ER and PR and measures of central tendency and variability for Ki67, according to tumoral grade. ER* PR* PB SS PB SS Tumoral Grade I (n=5) II (n=44) III (n=32) Positive 3 (60,0) 31 (70,5) 20 (62,5) Negative 2 (40,0) 13 (29,5) 12 (37,5) Positive 3 (60,0) 25 (56,8) 19 (59,4) Negative 2 (40,0) 19 (43,2) 13 (40,6) Positive 3 (60,0) 31 (70,5) 23 (71,9) Negative 2 (40,0) 13 (29,5) 9 (28,1) Positive 3 (60,0) 25 (56,8) 20 (62,5) Negative 2 (40,0) 19 (43,2) 12 (37,5) AA ± SD 13,1±14,9 16,3±13,1 22,6±18,7 PB P 50 (P 25 -P 75 ) 4,2 (1,7-29,0) 11,5 (7,8-22,9) 16,5 (7,1-37,7) p (value) 0,728 A 0,971 A 0,864 A 0,883 A 0,285 C KI67 MD ± DP 2,8±3,5 4,8±6,9 6,3±9,3 SS P 50 (P 25 -P 75 ) 1,1 2,5 3,5 0,737 C (0,4-6,1) (0,6-5,5) (0,6-6,6) * Values are presented as n(%), where the percentage was obtained from each group; aritimetical average ± SD; P25- includes 25% of samples with smaller or same values defined for Q1; P50= mediana: includes 50% of sample with smaller or same values defined for Q2; P75: includes 75% of samples with smaller or same values defined for Q3; A: test X 2 Pearson; test of Mann-Whitney D: Test of Wilcoxon.

48 Table 5: Simple and relative frequency distribution for ER and PR and measures of central tendency and variability for Ki67, according to metastatic linfonodes. ER* PR* PB SS PB SS Metastatic linfonodes 0 (n=58) 1-3 (n=21) > 3 (n=11) Positive 36 (62,1) 18 (85,7) 7 (63,6) Negative 22 (37,9) 3 (14,3) 4 (36,4) Positive 36 (62,1) 13 (61,9) 5 (45,5) Negative 22 (37,9) 8 (38,1) 6 (54,5) Positive 38 (65,5) 15 (71,4) 9 (81,8) Negative 20 (34,5) 6 (28,6) 2 (18,2) Positive 35 (60,3) 12 (57,1) 6 (54,5) Negative 23 (39,7) 9 (42,9) 5 (45,5) MD ± DP 16,7±14,1 20,8±18,9 21,5±16,6 PB P 50 (P 25 -P 75 ) 12,3 (6,3-26,7) 12,4 (7,1-32,9) 12,7 (7,9-41,5) p (value) 0,132 A 0,576 A 0,541 A 0,922 A 0,809 C KI67 MD ± DP 5,1±8,4 8,1±12,89 8,9±10,7 SS P 50 (P 25 -P 75 ) 3,0 3,6 2,5 0,781 C (0,6-6,8) (1,3-6,8) (0,-3-17,6) * Values are presented as n(%), where the percentage was obtained from each group; aritimetical average ± SD; P25- includes 25% of samples with smaller or same values defined for Q1; P50= mediana: includes 50% of sample with smaller or same values defined for Q2; P75: includes 75% of samples with smaller or same values defined for Q3; A: test X 2 Pearson; test of Mann-Whitney D: Test of Wilcoxon.

49 Table 6: Simple and relative frequency distribution for ER and PR and measures of central tendency and variability for Ki67, according to time (days) between BP and surgery ER* PR* PB SS PB SS Time (days) 0-20 days(n=5) 21-40 (n=44) > 40 (n=32) Positive 18 (62,1) 26 (78,8) 17 (60,7) Negative 11 (37,9) 7 (21,2) 11 (39,3) Positive 18 (62,1) 21 (63,6) 15 (53,6) Negative 11 (37,9) 12 (36,4) 13 (46,4) Positive 21 (72,4) 25 (75,8) 16 (57,1) Negative 8 (27,6) 8 (24,2) 12 (42,9) Positive 20 (69,0) 20 (60,6) 13 (46,4) Negative 9 (31,0) 13 (39,4) 15 (53,6) AA ± SD 20,1±14,7 16,1±1,1 18,6±18,9 PB P 50 (P 25 -P 75 ) 14,6 (9,6-28,8) 11,5 (5,2-26,8) 9,0 (3,5-34,0) p (value) 0,234 A 0,699 A 0,260 A 0,217 A 0,269 C KI67 AA ± SD 3,9±7,1 6,8±9,9 7,9±12,0 SS P 50 (P 25 -P 75 ) 1,6 3,6 4,0 0,115 C (0,3-4,3) (1,4-8,0) (0,5-8,6) * Values are presented as n(%), where the percentage was obtained from each group; aritimetical average ± SD; P25- includes 25% of samples with smaller or same values defined for Q1; P50= mediana: includes 50% of sample with smaller or same values defined for Q2; P75: includes 75% of samples with smaller or same values defined for Q3; A: test X 2 Pearson; test of Mann-Whitney D: Test of Wilcoxon.

50 Figure 1. Extreme values observation in a quartis Box-plot graphic of KI67 immunohistochemestry of core biopsy and surgical specimen 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0-5 -10-15 -20 N = 90 13 22 25 64 34 49 90 24 25 10 20 23 11 34 58 86 19 26 46 48 51 65 KI67 CB KI67 SS

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53 7. Artigo em Português Detecção imunoistoquímica de Ki67, receptores de estrogênio e de progesterona em espécime cirúrgico e biópsia percutânea de carcinoma de mama. Fabiane S. Barbosa b*, Antonio L. Frasson c, Márcia Graudenz d, Vinícius Duval Da Silva e, Felipe P. Zerwes f, Marcelle Moraes Dos Santos g, Felipe Loss h, Cláudio O. P. Alexandre a* a Laboratório de Biologia Molecular - Centro de Pesquisa e Pós-graduação, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) Porto Alegre, RS, Brazil b Médica Mastologista do Centro de Mama do Hospital São Lucas da PUCRS c Professor Doutor do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da PUCRS e Coordenador do Centro de Mama do Hospital São Lucas da PUCRS. Professor de Pós-graduação do Curso de Gerontologia Biomédica do Instituto de Geriatria e Gerontologia da PUCRS. d Professora Associada 1 do Departamento de Patologia e Professora do Curso de Pós Graduação em Patologia da FFFCMPA, Professora Adjunta 1 do Departamento de Patologia da UFRGS. e Professor Doutor do Departamento de Patologia da PUCRS f Professor Doutor do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da PUCRS e Médico Mastologista do Centro de Mama da PUCRS. g Aluna da graduação da Faculdade de Medicina da PUCRS h Aluno da graduação da Faculdade de Medicina da PUCRS Autores correspondentes: Fabiane S. Barbosa, Cláudio O. P. Alexandre Laboratório de Biologia Molecular, UFCSPA Endereço: Rua Sarmento Leite, 245 Porto Alegre, RS Brazil, ZIP CODE 90050-170 Telefone: + 51 33039000 E-mail: fabianesb@uol.com.br ; calex@ufcspa.edu.br Palavras Chave: receptores hormonais, câncer de mama, espécime cirúrgico, biópsia percutânea

54 RESUMO Introdução: O antígeno Ki67 é um importante marcador de proliferação celular usado, no carcinoma de mama (CM), como fator prognóstico. Da mesma forma, o estado dos receptores hormonais é fundamental no manejo de pacientes com CM, predizendo resposta à terapia e prognóstico. A terapia endócrina é considerada ineficaz em pacientes que não expressam receptores de estrogênio (RE) e/ou progesterona (RP). A avaliação do Ki67 e dos receptores hormonais é obtida, rotineiramente, por meio da técnica imunoistoquímica (IQ) utilizando o espécime cirúrgico (EC). Entretanto, em muitos casos, tais como no carcinoma de mama avançado, a amostra tumoral a partir da biópsia percutânea (BP) pode ser a única amostra de tecido disponível para a avaliação. Objetivo: Avaliar a expressão de Ki67 e receptores hormonais em espécime cirúrgico e biópsia percutânea, por meio da técnica imunoistoquímica, de pacientes com carcinoma de mama. Material e métodos: Foi realizado um estudo transversal em 90 mulheres com carcinoma de mama sem tratamento neoadjuvante e submetidos à biópsia percutânea prévia. Foi utilizado o método computadorizado de análise quantitativa para determinar a expressão do Ki67 e dos receptores hormonais detectados pela técnica imunoistoquímica. Todas as lâminas (EC e BP) foram confeccionadas e testadas no mesmo laboratório e no mesmo período de tempo. Resultados: Os percentuais observados para o Ki67 na biópsia percutânea, cuja média foi de 18,32, se mostraram significativamente superiores quando comparados aos percentuais de Ki67 no espécime cirúrgico, cuja média foi de 5,86 (p<0,001) A expressão dos RP no EC foi detectada em 58,9% (53/90) dos casos e na BP em 68,9% (62/90), esta diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,2144), entretanto quando evidenciados os resultados positivos e negativos concordantes, houve uma tendência a maior positividade em material de BP (p=0,108). Por outro

55 lado, a freqüência dos RE detectada em EC e BP, não mostrou diferença estatisticamente significativa (p=0,248). Quando o critério de receptor hormonal positivo considerado foi ER ou RP positivos, não foi observada diferença entre EC e BP. Não foram observadas diferenças com relação ao tipo de cirurgia, tipos histológicos ou estadiamento do tumor. Conclusões Nossos dados indicam que a biópsia percutânea pode ser utilizada para a detecção do Ki67 e dos RH em pacientes com carcinoma de mama. Sugerimos que se deve considerar uma nova avaliação de RP, quando o espécime cirúrgico for negativo para RH, usando-se a biópsia percutânea.

56 Introdução Ki67 é uma proteína nuclear não histona, expressa universalmente em tecidos em proliferação 1, 2. Diversos estudos evidenciam a propriedade do antígeno Ki67, na avaliação de pacientes com linfonodos negativos, como marcador de grupos de bom e mau prognóstico quando considerado como única variável 3-9. A avaliação dos receptores hormonais é fundamental no tratamento dos pacientes com carcinoma de mama, predizendo resposta e prognóstico 10, 11. Nos pacientes em que os tumores não expressam receptores de estrogênio (RE) e ou progesterona (RP), nenhuma forma de endocrinoterapia é considerada efetiva 10. A avaliação de receptores hormonais e do Ki67, no carcinoma de mama, é usualmente feita por meio da técnica imunoistoquímica em espécimes cirúrgicos 12. Por outro lado, a biópsia percutânea tem se tornado o método de escolha para o diagnóstico pré-operatório das lesões mamárias em muitos centros 13. Tem sido evidenciado que a avaliação de receptores hormonais pode ser feita a partir de material de biópsia percutânea sem prejuízos da análise 12. Em muitos casos, tais como no carcinoma de mama avançado, a amostra tumoral a partir da biópsia percutânea pode ser a única amostra de tecido para a avaliação dos receptores hormonais 14. Entretanto, estudos recentes mostram resultados controversos com relação a detecção dos RH a partir de material de espécimes cirúrgicos e de biópsia percutânea 14. Até o momento, o fator de decisão tem sido a comodidade clínica. Não há recomendações de consenso ou alguma norma que determine se a decisão terapêutica adjuvante será baseada nos resultados da imunoistoquímica de biópsia percutânea ou de espécime cirúrgico. O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão do antígeno Ki67 e dos receptores hormonais em espécime cirúrgico e biópsia percutânea de pacientes com carcinoma de mama,

57 utilizando a técnica imunoistoquímica, buscando contribuir para a definição da melhor opção para a detecção destes marcadores. Material e métodos Foi realizado um estudo transversal em 90 pacientes com carcinoma de mama sem tratamento neoadjuvante e submetidas a tratamento cirúrgico no Centro de Mama do HSL da PUCRS, que apresentavam biópsia percutânea prévia. A idade média foi de 55,57 anos, com uma amplitude de 34 até 85 anos. A classificação histológica e a graduação dos tumores foi realizada de acordo com as recomendações da Organização Mundial da Saúde e a classificação de Elston e Ellis 15, 16 A avaliação histológica do material de biópsia percutânea e espécime cirúrgico dos tumores classificou os tumores em: em carcinomas ductais infiltrantes do tipo não-especial, carcinomas ductais in situ, carcinomas infiltrantes do tipo lobulares e do tipo especial (medular, papilífero, tubular e mucinoso). Os demais subtipos histológicos não foram encontrados nas pacientes estudadas. O estudo foi aprovado pelos Comitês de Ètica do Hospital São Lucas da PUCRS e da UFCSPA. Imunoistoquímica Foi utilizado o método computadorizado de análise quantitativa para determinar a expressão do Ki67 e dos receptores hormonais detectados pela técnica imunoistoquímica. Todas as lâminas (EC e BP) foram confeccionadas e testadas no mesmo laboratório e no mesmo período de tempo. Para a avaliação imunoistoquímica os blocos de parafina, contendo biópsia percutânea ou espécime cirúrgico, foram cortados e montados em lâminas. Os cortes foram desparafinizados, rehidratados utilizando seqüencialmente a imersão em xilol, álcool etílico absoluto, a 70% e a 50% e água destilada, por cinco minutos cada, a temperatura ambiente. A recuperação antigênica foi realizada com imersão das lâminas em tampão Tris-EDTA, ph 9,0, em banho-maria até 92 O C por

58 30 minutos a seguir incubadas por 20 minutos a temperatura ambiente. Para o bloqueio da peroxidase endógena utilizou-se solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 5% em metanol, por 10 minutos, à temperatura ambiente. O bloqueio de reações inespecíficas foi feito com BSA a 1% por 30 minutos. Para avaliação do receptor de estrogênio (RE) foi aplicado o anticorpo primário, clone monoclonal 6F11 (Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK) na diluição 1/200. O controle positivo utilizado foi tecido mamário. Para o receptor de progesterona (RP), foi utilizado o clone monoclonal 16 ( Novocastra ) na diluição 1/150. Para a detecção do antígeno Ki67, utilizou-se o clone MIB-1, Dakocytomation (Dakocytomation, CA, USA), na diluição 1/200. A incubação com o anticorpo secundário biotinilado foi realizada por 40 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente foi realizada a revelação do substrato com cromógeno (DAB) e contra-corado com hematoxilina e desidratação. As lâminas foram montadas com Entellan (Merck, Darmstadt, GER). As lâminas foram rotuladas com dados do bloco de parafina do paciente e analisadas por 2 examinadores, num microscópio ótico duplo, diâmetro de campo de 20mm e realizada a digitalização das imagens. Para a avaliação dos RH e do Ki67 foram identificadas áreas de hotsptos tumorais. Para os casos considerados negativos, RH e Ki67 foram identificados em tecido mamário não tumoral quando presente, para controle interno. Avaliação imunoistoquímica da proteína Ki67 foi utilizada, também, para avaliar a adequabilidade do material em estudo. Na avaliação dos resultados, aceitamos os critérios definidos pelo Breast International Group (BIG) que dividiu as células em três categorias de acordo com a coloração imunoistoquímica e a resposta ao tratamento hormonal adjuvante: ausência de coloração; baixa coloração (1 a 9% das células coradas) e elevada coloração (superior a 10% das células coradas).. Como os tumores com baixa coloraçao apresentam pouca ou nenhuma resposta a hormonioterapia e, em geral, são tidos como negativos, aceitamos como positivas as reações nos tecidos em que havia pelo menos 10% dos núcleos marcados.

59 Análise estatística Considerando um nível de significância (α) de 5% e um poder de 20%, o tamanho mínimo de amostra estimado foi de 90 casos. O erro amostral assumido, de acordo com a variabilidade evidenciada na amostra, foi de 2,6%. Foi utilizado o teste de Kolmogorov-Smirnov para avaliar a distribuição não paramétrica dos valores de Ki67. O teste de Wilcoxon foi utilizado para avaliar as diferenças imunoistoquímicas do Ki67 entre biópsia percutânea e espécime cirúrgico. Foram analisadas medidas de tendência central (média, mediana) e divisões em quartis. O teste de McNemar foi utilizado para avaliar as diferenças das amostras pareadas entre receptores de estrogênio e de progesterona. Resultados Os percentuais observados para o Ki67 na biopsia percutanea, cuja media foi de 18,32, se mostraram significativamente superiores quando comparados aos percentuais de Ki67 no espécime cirúrgico, cuja média foi de 5,86 (p<0,001) (Figura 1). O RE no espécime cirúrgico foi positivo em 60% (54/90) casos, enquanto na biópsia percutânea a imunorreatividade foi de 67,8% (61/90), entretanto, os valores não apresentaram diferença estatisticamente significativa (p=0,350). Os RP foram positivos em 58,9% (53/90) dos casos no espécime cirúrgico e na biópsia percutânea em 68,9% (62/90), a diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,2144), entretanto quando evidenciados os resultados positivos e negativos concordantes, houve uma tendência a maior positividade em material de BP (p=0,108). Houve concordância na determinação dos RE entre biópsia percutânea e espécime cirúrgico em 70% dos casos positivos e negativos e na determinação dos RP em 72%. Quando um tumor é definido receptor hormonal positivo (RE+ ou RP+), nenhuma diferença entre avaliação a partir do espécime cirúrgico e da biópsia percutânea foi observada. Não foram observadas diferenças na determinação dos RH e de Ki67 em material de BP e EC com relação ao tipo de cirurgia, tipo histológico, grau tumoral, número de linfonodos axilares metastáticos ou o tempo de decurso entre a BP e a cirurgia (Tabelas 2-6).

60 Na avaliação dos RE em material de EC, quando comparado o tipo de cirurgia, foi detectada diferença estatisticamente significativa (p=0,022), pacientes que realizaram mastectomia apresentam significativamente mais resultados negativos de RE que aquelas que realizaram setorectomia. O mesmo não foi observado na avaliação dos RP em EC. Discussão Variações nas definições de pontos de corte do Ki67 dificultam as comparações entre estudos, considera-se útil avaliá-lo como uma variável contínua 9. Em nosso estudo, a avaliação do Ki67 na biópsia percutânea foi estatisticamente maior do que no espécime cirúrgico (p<0,001). Possíveis motivos para essa variação incluem a rápida fixação da biópsia percutânea quando comparada à fixação de todo o tumor no espécime cirúrgico. A biópsia percutânea requer um tempo menor de fixação antes de ser processada, já o tumor no espécime cirúrgico pode necessitar de um período mais longo de fixação. Pode-se supor que a biópsia percutânea seja uniforme e rapidamente fixada ao longo do seu comprimento imediatamente após a excisão 17. A biópsia percutanea (BP) parece refletir os resultados do espécime cirúrgico (EC) na determinação dos receptores hormonais 14, 18.Os resultados do estudo de Zidan e cols evidenciam que a BP utilizada no diagnóstico do carcinoma de mama apresenta quantidade de células tumorais suficientes para a avaliação imunoistoquímica dos receptores de estrogênio 14. O espécime cirúrgico para a avaliação dos RH é considerado por muitos o padrão-ouro e a biópsia percutanea, embora confiável na avaliação imunoistoquímica de receptores de estrogênio, parece ser menos fidedigna na avaliação dos receptores de progesterona 14, 18. Nosso estudo não evidenciou esta diferença. As diferenças observadas entre BP e EC podem ser explicadas, em parte, pela heterogeneidade tumoral, presente em alguns tumores, e pelas eventuais diferenças de fixação 14. A heterogeneidade tumoral é evidenciada na IQ para RH através de agrupamentos de nichos tumorais negativos, fracamente positivos e fortemente positivos em uma mesma lâmina 14. Em nosso estudo, foram observados alguns tumores em que a área mais periférica apresentava uma coloração mais intensa

61 que a área central, assim como, tumores em que em alguns campos mais centrais não apresentavam coloração para alguma para RH. Este fato pode ser explicado por uma extensa área de fibrose central ou um artefato, devido a melhor fixação e preservação das células situadas na periferia tumoral 14. Nas nossas análises, este fato não alterou, significativamente, os resultados, pois foi utilizado como critério de leitura as áreas de maiores concentrações de núcleos corados, os hotspots. Uma outra explicação para as discrepâncias observadas é a diferença nas condições de fixação da BP e do EC, fundamentalmente, em razão do tamanho do material 13, 14, 18 sendo também uma possível justificativa para as diferenças observadas na avaliação dos RE entre espécime cirúrgico de mastectomia e de setorectomia. A BP é constituída de fragmentos de pequena dimensão que são rápido e melhor fixados quando comparados ao EC 14, 18, bem como o espécime cirúrgico de setorectomia que apresenta menor dimensão quando comparado ao espécime cirúrgico de mastectomia. A fixação com formalina induz ligações cruzadas entre proteínas e ácidos nucleicos, necessários para a análise imunoistoquímica. Problemas de retardo na fixação, pouca fixação ou 18, 19 fixação em excesso com formol tem sido relatados. Retardo na fixação pode permitir degradação proteolítica do antígeno, esta degradação tem sido evidenciada em determinações de receptores hormonais 20. Pouca fixação é o resultado da lenta difusão do formal em alguns tecidos, que requerem tempo para ligações químicas cruzadas, desta forma a periferia do tumor pode ser adequadamente fixada e o centro não. Este processo levaria a coloração mais intensa seja na periferia ou no centro da lesão, dependendo do antígeno e dos anticorpos utilizados. Fixação em excesso pode levar a coloração fraca ou ausente, dependendo epitopo individual 20. Douglas-Jones e cols, comparando biópsia percutânea e espécime cirúrgico, mostraram coloração 35% inferior nos espécimes cirúrgicos quando comparada a biópsia percutânea pela análise imunocitoquímica. Os autores também observaram que a periferia do tumor é geralmente corada mais intensamente que o centro. Esta variação na coloração não é observada no material de biópsia percutânea 17. Mann e cols explicam parcialmente esta discordância entre a BP e o EC no

62 mesmo tumor de uma paciente pela variabilidade inerente da imunoistoquímica e pelas técnicas de fixação. A maior imunoreatividade na BP para RP parece refletir um aumento da preservação da imunorreatividade pela rápida fixação que ocorre na BP 17, 18. Uma outra explicação para este achado parece ser a maior chance de amostragem tumoral periférica com a biópsia percutânea 17. Existem relatos de pacientes receptores hormonais negativos que apresentam resposta a hormonioterapia, aumentando a probabilidade que estes sejam falso-negativos 18. O exame do epitélio mamário normal é fundamental nas lâminas em que os receptores hormonais são negativos, uma vez que serve como um controle interno positivo 18. Nos casos em que não houve expressão dos receptores hormonais, a possibilidade de falso negativo deve ser avaliada 18. Por esta razão, uma reação de controle faz-se necessária. Neste estudo foram utilizados tumores de mama receptores hormonais positivos como controle da reação. O controle da qualidade do material foi feito através da determinação do Ki67. Todos os casos (biópsia percutânea e espécime cirúrgico) expressaram o este marcador de proliferação tumoral. Muito tem sido discutido sobre a heterogeneidade da expressão dos RE no carcinoma de mama 17. Não existe uma definição precisa de heterogeneidade tumoral 17. Alguns tumores expressam RE fortemente em algumas áreas e são fracamente positivos ou até mesmo negativos em outras. Este tipo de heterogeneidade que conta com dois sub-clones celulares (um positivo e outro negativo) é incomum, estando presente em 0,5% dos tumores de mama. Neste estudo observamos heterogeneidade tumoral em 3 casos (3,3%). Possíveis razões para os diferentes resultados observados na avaliação de receptores de progesterona a partir de material de BP e de EC incluem erro amostral, com a BP não refletindo o estatus de todo o tumor. Artefatos de fixação com retardo de exposição do centro da lesão de EC a formalina, podem resultar em maior negatividade 18. O pequeno número de casos que foram negativos na BP e positivos no EC pode ser devido a problemas amostrais. Quando considerado critério de positividade de ao menos um dos receptores hormonais positivos, não encontramos diferença entre avaliação a partir do espécime cirúrgico e da biópsia

63 percutânea. Discordâncias na avaliação dos RH em pacientes com carcinoma de mama podem levar a um manejo hormonioterápico inadequado, quando a decisão terapêutica se baseia em um ou outro método para a determinação dos RH. Nossos dados sugerem que se a avaliação do espécime cirúrgico for negativo, uma nova análise poderia ser feita na biópsia percutânea. Conclusão Nossos dados indicam que a biópsia percutânea pode ser utilizada para a detecção do Ki67 e dos RH em pacientes com carcinoma de mama. Sugerimos que se deve considerar uma nova avaliação de RP, quando o espécime cirúrgico for negativo para RH, usando-se a biópsia percutânea.

64 Table 1. Tabela 1. Dados clínicos e anátomo-patológicos Características nº de pacientes (n=90) Idade Média Variação Moda 55,57 anos (34-85 anos) 52 anos Tipo de cirurgia Mastectomia Setorectomia Cirurgia Axilar BLS EA Tipo Histológico CDIS CDI CLI Tipo especial Tamanho tumoral Tis T1 T2 T3 Comprometimento axilar N0 N1 N2 N3 Grau tumoral G1 G2 G3 Não aplicável 39 51 40 50 05 64 14 07 5 44 40 1 58 21 6 5 5 44 32 9

65 Tabela 2: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o tipo de cirurgia RE* RP* KI67 BP EC BP EC Mastectomia (n=39) Tipo de cirurgia Setorectomia (n=51) Positivo 24 (61,5) 37 (72,5) Negativo 15 (38,5) 14 (27,5) Positivo 20 (51,3) 34 (66,7) Negativo 19 (48,7) 17 (33,3) Positivo 25 (64,1) 37 (72,5) Negativo 14 (35,9) 14 (27,5) Positivo 21 (53,8) 32 (62,7) Negativo 18 (46,2) 19 (37,3) p (valor) Total (positivos) 0,379 A 61 (67,8) 0,140 A 54 (60,0) 0,530 A 62 (68,9) 0,526 A 53 (58,9) MD ± DP 16,4 ± 115,2 19,7 ± 15,8 18,3± 14,5 BP P 50 (P 25 -P 75 ) 10,3 13,4 0,308 12,3 (6,1 23,1) (7,1 30,0) (7,0 27,9) p (valor) 0,350 B 0,214 B <0,001 D MD ± DP 4,8 ± 8,3 7,3 ± 10,9 5,8 ± 7,6 EC P 50 (P 25 -P 75 ) 2,0 3,9 0,050 C 3,2 (0,5 5,3) (0,9 8,7) (0,6 7,4) * Valores apresentados da forma n(%), onde o percentual foi obtido com base no total de cada grupo; Média aritmética ± Desvio Padrão; : P 25 - concentra 25% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 1 ; P 50 = mediana: concentra 50% da amostra com valores inferiores ou iguais aos definidos por Q 2 ; P 75 : concentra 75% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 3 ; A: Teste Quiquadrado de Pearson; B: Teste Z para comparações de proporções; C: Teste de Mann-Whitney; D: Teste de Wilcoxon

66 Tabela 3: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o tipo de tumor RE* RP* BP EC BP EC CDI + CDImic (n=64) Tipo Histologico CLI (n=14) Cdis+ca+T (n=12) Positivo 43 (67,2) 10 (71,4) 8 (66,7) Negativo 21 (32,8) 4 (28,6) 4 (33,3) Positivo 38 (59,4) 8 (57,1) 8 (66,7) Negativo 26 (40,6) 6 (42,9) 4 (33,3) Positivo 43 (67,2) 8 (57,1) 11 (91,7) Negativo 21 (32,8) 6 (42,9) 1 (8,3) Positivo 37 (57,8) 8 (57,1) 8 (66,7) Negativo 27 (42,2) 6 (42,9) 4 (33,3) MD ± DP 19,1±16,1 14,2±14,2 17,7±13,8 BP P 50 (P 25 -P 75 ) 13,4 (7,8-27,4) 8,0 (3,1-25,1) 9,5 (7,4-30,6) p (value) 0,950 A 0,869 A 0,143 A 0,840 A 0,375 C KI67 MD ± DP 5,3±8,1 5,9±7,6 11,4±17,7 EC P 50 (P 25 -P 75 ) 3,2 0,505 C 3,0(0,6-5,5) 5,5(1,0-8,6) (0,9-8,0) * Valores apresentados da forma n(%) onde o percentual foi obtido com base no total de cada grupo; Média aritmética ± Desvio Padrão; : P 25 - concentra 25% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 1 ; P 50 = mediana: concentra 50% da amostra com valores inferiores ou iguais aos definidos por Q 2 ; P 75 : concentra 75% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 3 ; A: Teste Qui-quadrado de Pearson;; C: Teste de Mann-Whitney;

67 Tabela 4: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o grau tumoral RE* RP* BP EC BP EC Grau tumoral I (n=5) II (n=44) III (n=32) Positivo 3 (60,0) 31 (70,5) 20 (62,5) Negativo 2 (40,0) 13 (29,5) 12 (37,5) Positivo 3 (60,0) 25 (56,8) 19 (59,4) Negativo 2 (40,0) 19 (43,2) 13 (40,6) Positivo 3 (60,0) 31 (70,5) 23 (71,9) Negativo 2 (40,0) 13 (29,5) 9 (28,1) Positivo 3 (60,0) 25 (56,8) 20 (62,5) Negativo 2 (40,0) 19 (43,2) 12 (37,5) MD ± DP 13,1±14,9 16,3±13,1 22,6±18,7 BP P 50 (P 25 -P 75 ) 4,2 (1,7-29,0) 11,5 (7,8-22,9) 16,5 (7,1-37,7) p (valor) 0,728 A 0,971 A 0,864 A 0,883 A 0,285 C KI67 MD ± DP 2,8±3,5 4,8±6,9 6,3±9,3 EC P 50 (P 25 -P 75 ) 1,1 2,5 3,5 0,737 C (0,4-6,1) (0,6-5,5) (0,6-6,6) * Valores apresentados da forma n(%) onde o percentual foi obtido com base no total de cada grupo; Média aritmética ± Desvio Padrão; : P 25 - concentra 25% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 1 ; P 50 = mediana: concentra 50% da amostra com valores inferiores ou iguais aos definidos por Q 2 ; P 75 : concentra 75% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 3 ; A: Teste Qui-quadrado de Pearson;; C: Teste de Mann-Whitney;

68 Tabela 5: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o número de linfonodos metastaticos RE* RP* BP EC BP EC Número de linfonodos metastáticos Zero (n=58) De 1 a 3 (n=21) Acima de 3 (n=11) Positivo 36 (62,1) 18 (85,7) 7 (63,6) Negativo 22 (37,9) 3 (14,3) 4 (36,4) Positivo 36 (62,1) 13 (61,9) 5 (45,5) Negativo 22 (37,9) 8 (38,1) 6 (54,5) Positivo 38 (65,5) 15 (71,4) 9 (81,8) Negativo 20 (34,5) 6 (28,6) 2 (18,2) Positivo 35 (60,3) 12 (57,1) 6 (54,5) Negativo 23 (39,7) 9 (42,9) 5 (45,5) MD ± DP 16,7±14,1 20,8±18,9 21,5±16,6 BP P 50 (P 25 -P 75 ) 12,3 (6,3-26,7) 12,4 (7,1-32,9) 12,7 (7,9-41,5) p (valor) 0,132 A 0,576 A 0,541 A 0,922 A 0,809 C KI67 MD ± DP 5,1±8,4 8,1±12,89 8,9±10,7 EC P 50 (P 25 -P 75 ) 3,0 3,6 2,5 0,781 C (0,6-6,8) (1,3-6,8) (0,-3-17,6) * Valores apresentados da forma n(%) onde o percentual foi obtido com base no total de cada grupo; Média aritmética ± Desvio Padrão; : P 25 - concentra 25% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 1 ; P 50 = mediana: concentra 50% da amostra com valores inferiores ou iguais aos definidos por Q 2 ; P 75 : concentra 75% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 3 ; A: Teste Qui-quadrado de Pearson; B: Teste Z para comparações de proporções; C: Teste de Mann-Whitney; D: Teste de Wilcoxon

69 Tabela 6: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o tempo de decurso entre biopsia percutanea e cirurgia RE* RP* BP EC BP EC Até 20 (n=5) Tempo (dias) De 21 a 40 (n=44) Acima de 40 (n=32) Positivo 18 (62,1) 26 (78,8) 17 (60,7) Negativo 11 (37,9) 7 (21,2) 11 (39,3) Positivo 18 (62,1) 21 (63,6) 15 (53,6) Negativo 11 (37,9) 12 (36,4) 13 (46,4) Positivo 21 (72,4) 25 (75,8) 16 (57,1) Negativo 8 (27,6) 8 (24,2) 12 (42,9) Positivo 20 (69,0) 20 (60,6) 13 (46,4) Negativo 9 (31,0) 13 (39,4) 15 (53,6) MD ± DP 20,1±14,7 16,1±1,1 18,6±18,9 BP P 50 (P 25 -P 75 ) 14,6 (9,6-28,8) 11,5 (5,2-26,8) 9,0 (3,5-34,0) p (valor) 0,234 A 0,699 A 0,260 A 0,217 A 0,269 C KI67 MD ± DP 3,9±7,1 6,8±9,9 7,9±12,0 EC P 50 (P 25 -P 75 ) 1,6 3,6 4,0 0,115 C (0,3-4,3) (1,4-8,0) (0,5-8,6) * Valores apresentados da forma n(%) onde o percentual foi obtido com base no total de cada grupo; Média aritmética ± Desvio Padrão; : P 25 - concentra 25% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 1 ; P 50 = mediana: concentra 50% da amostra com valores inferiores ou iguais aos definidos por Q 2 ; P 75 : concentra 75% da amostra com valores inferiores ou iguais ao definido por Q 3 ; A: Teste Qui-quadrado de Pearson;; C: Teste de Mann-Whitney;

70 Figura 1. Gráfico Box-plot dos valores extremos observados em quartis da imunoistoquímica do Ki67 na biópsia percutânea e no espécime cirúrgico 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0-5 -10-15 -20 N = 90 13 22 25 64 34 49 KI67 CB 90 24 25 10 20 23 11 34 58 86 19 26 46 48 51 65 KI67 SS KI67 CB KI67 SS

71 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Van Dierendonck JH, Keijzer R, Van d, V, Cornelisse CJ. Nuclear distribution of the Ki-67 antigen during the cell cycle: comparison with growth fraction in human breast cancer cells. Cancer Res 1989; 49(11):2999-3006. 2. Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer 1983; 31(1):13-20. 3. Brown RW, Allred CD, Clark GM, Osborne CK, Hilsenbeck SG. Prognostic value of Ki-67 compared to S-phase fraction in axillary nodenegative breast cancer. Clin Cancer Res 1996; 2(3):585-592. 4. Railo M, Lundin J, Haglund C, von SK, von BK, Nordling S. Ki-67, p53, Er-receptors, ploidy and S-phase as prognostic factors in T1 node negative breast cancer. Acta Oncol 1997; 36(4):369-374. 5. Seshadri R, Leong AS, McCaul K, Firgaira FA, Setlur V, Horsfall DJ. Relationship between p53 gene abnormalities and other tumour characteristics in breast-cancer prognosis. Int J Cancer 1996; 69(2):135-141. 6. Thor AD, Liu S, Moore DH, Edgerton SM. Comparison of mitotic index, in vitro bromodeoxyuridine labeling, and MIB-1 assays to quantitate proliferation in breast cancer. J Clin Oncol 1999; 17(2):470-477. 7. Clahsen PC, Van d, V, Duval C et al. The utility of mitotic index, oestrogen receptor and Ki-67 measurements in the creation of novel prognostic indices for node-negative breast cancer. Eur J Surg Oncol 1999; 25(4):356-363. 8. Trihia H, Murray S, Price K et al. Ki-67 expression in breast carcinoma: its association with grading systems, clinical parameters, and other prognostic factors--a surrogate marker? Cancer 2003; 97(5):1321-1331. 9. Urruticoechea A, Smith IE, Dowsett M. Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer. J Clin Oncol 2005; 23(28):7212-7220. 10. Goldhirsch A, Glick JH, Gelber RD, Coates AS, Thurlimann B, Senn HJ. Meeting highlights: international expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2005. Ann Oncol 2005; 16(10):1569-1583. 11. Hayes DF. Markers of increased risk for failure of adjuvant therapies. Breast 2003; 12(6):543-549. 12. Hodi Z, Chakrabarti J, Lee AH et al. The reliability of assessment of oestrogen receptor expression on needle core biopsy specimens of invasive carcinomas of the breast. J Clin Pathol 2007; 60(3):299-302. 13. Pinder SE, Elston CW, Ellis IO. The role of pre-operative diagnosis in breast cancer. Histopathology 1996; 28(6):563-566. 14. Zidan A, Christie Brown JS, Peston D, Shousha S. Oestrogen and progesterone receptor assessment in core biopsy specimens of breast carcinoma. J Clin Pathol 1997; 50(1):27-29. 15. BLOOM HJ, RICHARDSON WW. Histological grading and prognosis in breast cancer; a study of 1409 cases of which 359 have been followed for 15 years. Br J Cancer 1957; 11(3):359-377. 16. Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up. Histopathology 1991; 19(5):403-410.

72 17. Douglas-Jones AG, Collett N, Morgan JM, Jasani B. Comparison of core oestrogen receptor (ER) assay with excised tumour: intratumoral distribution of ER in breast carcinoma. J Clin Pathol 2001; 54(12):951-955. 18. Mann GB, Fahey VD, Feleppa F, Buchanan MR. Reliance on hormone receptor assays of surgical specimens may compromise outcome in patients with breast cancer. J Clin Oncol 2005; 23(22):5148-5154. 19. Werner M, Chott A, Fabiano A, Battifora H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol 2000; 24(7):1016-1019. 20. von Wasielewski R, Mengel M, Nolte M, et al. Influence of Fixation, Antibody Clones, and Signal Amplification on Steroid Receptor Analysis. Breast J 1998; 4:33-40.

73 8. ANEXOS 8.1 Pacientes, materiais e métodos 8.1.1 Delineamento do estudo Trata-se de um estudo transversal de prevalência. 8.1.2 População estudada Foram consideradas elegíveis todas as pacientes do sexo feminino submetidas a tratamento cirúrgico no Centro de Mama do HSL da PUCRS, que apresentavam biópsia percutânea prévia ao tratamento, no período de 2000 a janeiro de 2007. Nenhum tipo de tratamento neoadjuvante foi administrado nessas pacientes. Todas as pacientes concordaram em participar do estudo através de termo de consentimento livre e esclarecido, previamente aprovado pela Comissão de Ética da FFFCMPA (reunião 5/10/2006, parecer 248-06) e do HSLda PUCRS (reunião 17/01/2007, registro 06/03343). Foram excluídas as amostras com quantidade tumoral insatisfatória para a análise imunoistoquímica, quer seja do material da biópsia percutânea ou do espécime cirúrgico. Pacientes que apresentaram mais de um tumor na mama somente foram incluídas quando pudemos identificar em qual tumor foi realizada a biópsia percutânea. 8.1.3 Amostra estudada

74 Das 100 pacientes com câncer de mama que inicialmente compunham o estudo, foram excluídas 10 pacientes por apresentarem quantidade insuficiente de tumor na biópsia percutânea ou no espécime cirúrgico. 8.2. Metodologia 8.2.1 Avaliação clínico-anátomo patológica Todas as pacientes foram submetidas à biópsia percutânea prévia ao tratamento cirúrgico. Nenhum tipo de tratamento neoadjuvante foi administrado. Os exames para diagnóstico e estadiamento da doença, a indicação cirúrgica e o tipo de tratamento administrado ocorreram conforme a rotina do Ambulatório do Centro de Mama do HSL da PUCRS. A realização desse estudo não interferiu em nenhum momento no diagnóstico ou tratamento dessas pacientes. A avaliação histológica do material de biópsia percutânea e espécime cirúrgico dos tumores foi classificada em carcinomas ductais infiltrantes do tipo não-especial, carcinomas ductais in situ, carcinomas infiltrantes do tipo lobulares e do tipo especial (medular, papilífero, tubular e mucinoso). Os demais subtipos histológicos, a exemplo do carcinoma papilar e inflamatório, não foram encontrados nas pacientes estudadas 99. A classificação histológica e a graduação dos carcinomas foram realizadas de acordo com a graduação de Scarff-Bloom-Richardson, oficialmente adotadas pela Organização Mundial de Saúde em 1968 e modificada por Elston e Ellis, referida como Nothinghan. (Tabela 2). De acordo com estes autores, conforme a porcentagem de formação tubular, pleomorfismo nuclear e o índice mitótico as lesões são classificadas em grau I, II e III, como carcinomas bem, moderadamente e pouco diferenciados, respectivamente 19;100

75 Foi utilizada a classificação TNM conforme padronização da União Internacional Contra o Câncer (UICC), 6ª edição. Esse sistema é baseado no TNM, no qual o T se refere ao tamanho tumoral, N ao comprometimento de linfonodos e M à presença de metástases a distância 101, como indicado abaixo: Classificação patológica ptnm- 6ª edição Tumor primário (pt) ptx Tumor primário não pode ser avaliado pt0 Sem evidências de tumor primário ptis Carcinoma in situ: carcinoma intraductal ou carcinoma lobular in situ ou doença de Paget da papila sem tumor associado. pt1 Tumor com 2 cm ou menos em sua maior dimensão: pt1mic- carcinoma microinvasor ( 0,1 cm) pt1a - tumor com 0,5 cm ou menos em sua maior dimensão pt1b - tumor com mais de 0,5 cm e até 1 cm em sua maior dimensão pt1c - tumor com mais de 1 cm e até 2 cm em sua maior dimensão pt2 Tumor com mais de 2 cm e até 5 cm em sua maior dimensão pt3 Tumor com mais de 5 cm em sua maior dimensão pt4 Tumor de qualquer tamanho, com extensão direta à parede torácica ou à pele pt4a extensão à parede torácica pt4b edema (incluindo peau d orange) ou ulceração da pele da mama ou nódulos cutâneos satélites, confinados à mesma mama. pt4c T4 a e T4 b associados T4d carcinoma inflamatório Linfonodos regionais (pn) pnx Linfonodos regionais não podem ser avaliados

76 pn0 Ausência de metástase nos linfonodos regionais pn0 (i/+)* pn0 (MOL -/+)* pn1 pn1mi micrometástase ( >0,2 mm e 2mm) em axila ou cadeia mamária interna. pn1a 1 a 3 linfonodos axilares homolaterais comprometidos com pelo menos uma metástase > que 2mm. pn1b - linfonodos da mamária interna com metástase microscópica identificada em linfonodo sentinela mas não clinicamente aparente pn1c- 1 a 3 linfonodos axiliares comprometidos incluindo pelo menos uma metástase maior que 2mm e linfonodos da mamária interna com metástase microscopicas em linfonodo sentinela mas não clinicamente aparente. Metástases em linfonodo(s) axilar(es) homolateral(is) móvel(is) pn2- pn2a- 4 a 9 linfonodos axiliares comprometidos incluindo pelo menos uma metástase maior que 2mm pn2b- linfonodos da mamária interna clinicamente aparentes na ausência de comprometimento axilar pn3- pn3a- 10 ou mais linfonodos axilares comprometidos incluindo pelo menos uma metástase maior que 2mm - linfonodo infra-clavicular ipslateral comprometido pn3b- linfonodos da mamária interna clinicamente comprometidos na presença de comprometimento de linfonodos axilares - mais de 3 linfonodos axilares comprometidos e linfonodos da mamária interna com metástase microscópica identificada em linfonodo sentinela mas não clinicamente aparente pn3c- linfonodo(s) supra-clavicular ipslateral comprometido casos em que a metástase linfonodal consiste de apenas células tumorais isoladas ou formando grupamentos menores que 0,2mm, sendo em sua maioria detectadas por

77 imunohistoquimica (i) ou técnicas de biologia molecular (MOL), são classificadas como pno, pois não mostram atividade metastática efetiva. Metástases à distância (pm) PMX A presença de metástases à distância não pode ser avaliada PM0 Ausência de metástases à distância PM1 Metástases à distância

78 8.2.2 Avaliação imunohistoquímica As avaliações imunoistoquímicas para RE, RP e Ki67 de todas as pacientes, foram realizadas a partir dos blocos de parafina das biópsias percutâneas e dos espécimes cirúrgicos. Todas as lâminas foram feitas no laboratório de Patologia da Pós-graduação da UFCSPA, simultaneamente (biópsia percutânea e espécime cirúrgico), pelo mesmo técnico, para minimizar possíveis variações do método. As peças foram desparafinizadas e reidratadas, utilizando seqüencialmente xilol, álcool etílico absoluto, a 70% e a 50% e água destilada, por cinco minutos cada banho, em temperatura ambiente. A recuperação antigênica foi realizada com imersão das lâminas em tampão Tris-EDTA ph 9,0, em banho-maria até 92 O C por 30 minutos seguida de descanso de 20 minutos à temperatura ambiente. Para o bloqueio da peroxidase endógena utilizou-se solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 5% em metanol, por 10 minutos, à temperatura ambiente. O bloqueio de reações inespecíficas foi feito com BSA a 1% por 30 minutos. Para avaliação do receptor de estrogênio (RE) foi aplicado o anticorpo primário, clone 6F11 (Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK) na diluição 1/200. O controle positivo utilizado foi tecido mamário. Para o receptor de progesterona (RP), foi utilizado o clone 16 ( Novocastra ) na diluição 1/150. Para a detecção do antígeno Ki67, utilizou-se o clone MIB-1, Dakocytomation (Dakocytomation, CA, USA), na diluição 1/200. A incubação com o anticorpo secundário biotinilado foi realizada por 40 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente foi realizada a revelação do substrato com cromógeno (DAB) e contra-corado com hematoxilina e desidratação. As lâminas foram montadas com Entellan (Merck, Darmstadt, GER).

79 As lâminas foram rotuladas com dados do bloco de parafina do paciente e analisadas por 2 examinadores, num microscópio ótico duplo, diâmetro de campo de 20mm e realizada a digitalização das imagens. Para a avaliação dos RH e do Ki67 foram identificadas áreas de hotsptos tumorais. Para os casos considerados negativos, RH e Ki67 foram identificados em tecido mamário não tumoral quando presente, para controle interno. Avaliação imunoistoquímica da proteína Ki67 foi utilizada, também, para avaliar a adequabilidade do material em estudo. Na avaliação dos resultados, aceitamos os critérios definidos pelo Breast International Group (BIG) que dividiu as células em três categorias de acordo com a coloração imunoistoquímica e a resposta ao tratamento hormonal adjuvante: ausência de coloração; baixa coloração (1 a 9% das células coradas) e elevada coloração (superior a 10% das células coradas).. Como os tumores com baixa coloração apresentam pouca ou nenhuma resposta a hormonioterapia e, em geral, são tidos como negativos, aceitamos como positivas as reações nos tecidos em que havia pelo menos 10% dos núcleos marcados ( Figuras 1-6). 8.2.3 Análise estatística Considerando um nível de significância (α) de 5% e um poder de 20%, o tamanho mínimo de amostra estimado foi de 90 casos. O erro amostral assumido, de acordo com a variabilidade evidenciada na amostra, foi de 2,6%. Testes estatísticos univariados foram utilizados inicialmente para comparar os resultados dos receptores hormonais a partir do espécime cirúrgico e da biópsia percutânea, através de análise descritiva com tabelas de freqüência simples e relativa, e análise exploratória, visando a um maior conhecimento da distribuição das quantitativas. Foram analisadas também as características clínicas e anátomo-patológicas através de tabelas de dupla entrada, visando à investigação das concordâncias entre a avaliação, através da biópsia percutânea e do espécime cirúrgico. A

80 comparação das discordâncias investigadas se deu pelo teste de McNemar, que busca comparação entre dados pareados. 8.2.4 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa O presente estudo foi previamente aprovado pela Comissão de Ética da FFFCMPA (reunião 5/10/2006, parecer 248-06) e do HSL da PUCRS (reunião 17/01/2007, registro 06/03343). 8.2.5 Termo de consentimento informado livre e esclarecido para pesquisa científica Projeto de Pesquisa: Detecção imunoistoquímica de receptores hormonais em material de biópsia percutânea e espécime cirúrgico de tumores de mama. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS DA PESQUISA A senhora foi submetida a tratamento cirúrgico por tumor de mama no Centro de Mama do HSL da PUCRS. A utilização da hormonioterapia (tratamento hormonal que se usa após o tratamento cirúrgico) baseia-se no resultado de estudos que realizamos para sabermos se o tumor responde a algum tipo de hormônio (terapia hormonal). Essa análise pode ser feita tanto a partir da biópsia que foi realizada antes da cirurgia quanto do tumor que foi retirado com a cirurgia. Até o momento, acredita-se que as duas formas de avaliação sejam efetivas para determinar quais os tumores que respondem ou não a esse tratamento, e nos tragam informações idênticas. Essa pesquisa está sendo feita para sabermos se a análise feita a partir da biópsia ou a partir do tumor que foi retirado durante a cirurgia nos fornecem as mesmas informações com relação aos receptores hormonais. PROCEDIMENTOS A SEREM UTILIZADOS

81 A pesquisa será feita através de análise dos receptores hormonais nos blocos de parafina que estão armazenados no serviço de patologia da Instituição (biópsia e espécime cirúrgico). A paciente que optar por participar desta pesquisa não deverá realizar nenhum tipo de análise, uma vez que a pesquisa será realizada em material que já foi retirado previamente. DESCONFORTOS OU RISCOS ESPERADOS Não há riscos implicados na participação da pesquisa, pois a avaliação será realizada em blocos de parafina. Caso a nova análise apresente resultado diferente daqueles avaliados previamente (por exemplo, se a pesquisa evidenciar receptores hormonais positivos e o seu resultado anterior era negativo), será considerado o primeiro resultado, pois sabemos que algumas variações podem ocorrer simplesmente quando trocamos os métodos utilizados. Esse tipo de variação é conhecido por nós e o seu exame foi realizado num laboratório em que confiamos e, portanto, o resultado será tido como verdadeiro. Lembramos que queremos com este trabalho avaliar se ocorrerá algum tipo de variação entre as duas amostras retiradas do mesmo tumor (antes da cirurgia com a biópsia e depois da cirurgia com o espécime cirúrgico), sempre lembrando que a opção de usar ou não hormonioterpia é uma decisão tomada conjuntamente entre toda a equipe. BENEFÍCIOS Saber se existe ou não algum tipo de diferença entre a pesquisa a partir de material de biópsia e de espécime cirúrgica é muito importante para que possamos cada vez mais melhorar o tratamento de pacientes com tumores de mama. No seu caso especificamente não há nenhum benefício esperado, não mudando o seu tratamento. Mas, para futuras pacientes, essa informação pode ser muito importante.

82 PROCEDIMENTOS ALTERNATIVOS QUE POSSAM SER VANTAJOSOS Não existem. GARANTIA DE RESPOSTA A PERGUNTAS E DÚVIDAS Os pesquisadores envolvidos, bem como a equipe do Centro de Mama do HSL PUCRS, estão disponíveis para esclarecimentos e perguntas que possam surgir. LIBERDADE DE ABANDONAR A PESQUISA SEM PREJUÍZO PARA SI O paciente participante da pesquisa pode solicitar a sua retirada da mesma a qualquer momento, sem prejuízo ao seu tratamento, acompanhamento e atenção médica. GARANTIA DE PRIVACIDADE Ressaltamos que a concordância em participar deste estudo não altera o tratamento que está sendo realizado. Os dados obtidos são confidenciais e utilizados apenas para fins científicos nesta pesquisa, não sendo divulgados os nomes dos participantes. COMPROMISSO COM INFORMAÇÃO ATUALIZADA DO ESTUDO do estudo. O participante poderá, a qualquer momento, solicitar informações a respeito do andamento DISPONIBILIDADE DE TRATAMENTO MÉDICO A disponibilidade de tratamento não sofrerá interferência pela pesquisa.

83 Eu,...(paciente ou responsável) fui informado dos objetivos da pesquisa acima de maneira clara e detalhada. Recebi informação a respeito do tratamento recebido e esclareci minhas dúvidas. Sei que em qualquer momento poderei solicitar novas informações e modificar minha decisão se assim eu o desejar. O médico...(pesquisador responsável) certificou-me de que todos os dados desta pesquisa serão confidenciais, bem como o seu tratamento não será modificado em razão desta pesquisa e terei liberdade de retirar meu consentimento de participação na pesquisa, face a estas informações. Declaro que recebi cópia do presente Termo de Consentimento. Assinatura do Paciente ou Responsável Nome do Paciente ou Responsável Data / / Assinatura do Pesquisador Nome do Pesquisador Data / / Este formulário foi lido para (nome do paciente) em / / (data) pelo (nome do pesquisador) enquanto eu estava presente. Assinatura de testemunha Nome da Testemunha Data / /

84 8.3 Figuras Figura 1. Imunoistoquímica para RE em material de biópsia percutanea de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x). Figura 2. Imunoistoquímica para RE em material de espécime cirúrgico de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x).

85 Figura 3. Imunoistoquímica para RP em material de biópsia percutanea de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x). Figura 4. Imunoistoquímica para RP em material de espécime cirúrgico de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x).

86 Figura 5. Imunoistoquímica para Ki67em material de biópsia percutanea de carcinoma de mama baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% das células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x). Figura 6. Imunoistoquímica para Ki67 em material de espécime cirúrgico de carcinoma de mama baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% das células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x).