DIREÇÃO-GERAL DOS ESTABELECIMENTOS ESCOLARES DIREÇÃO DE SERVIÇOS DA REGIÃO CENTRO ANO LECTIVO 2015 2016 CURSO PROFISSIONAL TÉCNICO DE ANÁLISE LABORATORIAL MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Uma das técnicas de separação muito utilizada em química é a cromatografia. Esta técnica foi desenvolvida por Michael Tswett (botânico russo), no início do século XX (1906), este utilizava-a para separar pigmentos extraídos de plantas utilizando para o efeito uma coluna cromatográfica, cheia com carbonato de cálcio (CaCO 3 ) e como eluente o éter de petróleo A cromatografia do grego Chrom (cor) e graph (escrever), é um método físico-químico de separação de componentes de uma mistura através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contacto. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra se move através dela. O grande desenvolvimento desta técnica é a consequência natural das múltiplas vantagens que ela oferece, nomeadamente a fácil interpretação e execução, separações rápidas, versatilidade, fácil reprodutibilidade e baixo custo. A cromatografia é um processo de purificação/separação de componentes de uma mistura, por ação do deslocamento de uma fase móvel relativamente a uma fase estacionária. Existem várias técnicas cromatográficas. No entanto todas têm em comum a existência de duas fases: uma estacionária (sólida ou líquida) e uma outra móvel (líquida ou gás) que contacta com a primeira e que é designada de eluente. A separação dos componentes existentes na fase móvel verifica-se dada a diferença de velocidade dos mesmos, como consequência das diferentes interações estabelecidas com a fase estacionária. A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura TIPO DE CROMATOGRAFIA TIPO DE FASE ESTACIONÁRIA MÓVEL UTILIZAÇÃO Cromatografia em coluna Sólida Líquida Separação em pequena escala HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Sólida Líquida Análise qualitativa e quantitativa TLC (Thin Layer Chromatography) Cromatografia em camada fina GLC (Gas Liquid Chromatography) Cromatografia gás-líquido Cromatografia em papel Sólida Líquida Sólida Líquida Análise qualitativa Líquida Gasosa Análise qualitativa e quantitativa Análise qualitativa e quantitativa de compostos polares (orgânicos e inorgânicos) GSC (Cromatografia gás sólido) Sólida Gasosa Análise qualitativa e quantitativa Página 1 de 9
As várias técnicas cromatográficas podem ser agrupadas em dois tipos fundamentais: cromatografia de adsorção e cromatografia de partição. Cromatografia de adsorção 1. Cromatografia em coluna 2. Cromatografia em camada fina 3. Cromatografia gás-sólido. Para este tipo de cromatografia pode considerar-se que: A fase estacionária é sempre um sólido (ou a interface líquido líquido). A fase móvel pode ser um líquido ou um gás (eluente). Os componentes da mistura são adsorvidos à superfície do sólido (por interações dipolo-dipolo), a diferentes velocidades, à medida que a fase móvel os desloca ao longo da fase estacionária. O fator que condiciona a separação é a diferença de afinidades que as substâncias a separar têm, entre a fase estacionária (sólido) e a fase móvel (eluente). Usa-se este tipo de cromatografias quando os componentes das misturas são compostos orgânicos polares (não iónicos) A fase estacionária ou adsorvente, visto que é nela que o soluto se vai ligar, é a sílica, no caso da cromatografia de camada fina. A superfície desta fase porosa apresenta grupos silanol (-Si-OH) e siloxano (Si-O-Si), podendo o primeiro estabelecer ligações de hidrogénio com o soluto. A ação do adsorvente resulta pois, da interação destes grupos com as moléculas (ou grupos nas moléculas) polares dos solutos. Existem, assim, na superfície adsorvente, grupos que formam ligações de forças diferentes: fracas (grupos siloxano) e mais fortes (silanóis). CROMATOGRAFIA EM COLUNA - Esta técnica é muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto, estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida. Fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionarias líquidas por partição. Página 2 de 9
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Cromatografia de partição 1. Cromatografia em papel 2. Cromatografia gás-líquido 3. Cromatografia HPLC Nesta cromatografia, a fase estacionária é um líquido. Os componentes de uma mistura são separados entre a fase líquida e a fase móvel. No caso de solutos e eluentes apolares a atividade adsorvente é pequena, tendo como consequência uma rápida e quase total mobilidade dos mesmos, logo baixos tempos de retenção. No caso de solutos e solventes polares, verificam-se fortes interações com o adsorvente, resultando elevados tempos de retenção, bem como por vezes caudas nas bandas. A capacidade de retenção de um componente pela fase estacionária permite a separação dos diversos componentes, em virtude das suas diferentes velocidades de movimento na fase móvel. Quando a fase móvel é um líquido, podemos exprimir esta capacidade de retenção por um fator de retardação, o R f é uma característica do soluto, facto que permite muitas vezes a identificação dos compostos. distância percorrida pelo soluto R f distância percorrida pelo eluente R f. O Entre os métodos modernos de análise a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas, por si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de análise, como por exemplo a espectrofotometria ou a espectrometria de massa. Na cromatografia de camada fina, uma camada fina de adsorvente é espalhada sobre uma placa recoberta pelo adsorvente e seca, chamada de cromatoplaca, a amostra é aplicada repetidas vezes com o auxílio de um capilar, obtendo-se pequenas manchas. Os principais fenómenos que governam a separação cromatográfica são adsorção e absorção (partição). A adsorção ocorre com a fase estacionária, sólida, geralmente Silicagel ( SiO2. xh2o ) ou alumina Al2O 3. O grau de adsorção depende da quantidade de água presente na fase sólida (esta será mais reativa quanto menos água estiver presente), da estrutura do composto (presença de grupos funcionais polares, capacidade de formar ligações de hidrogénio, etc.), da adsorção do solvente ao ocupar os sítios ativo da fase sólida e da força de atracão entre soluto e o solvente. Algumas formas de visualizar as interações entre a alumina e os componentes orgânicos de uma amostra. Estruturas similares podem ser escritas para a Silicagel. Página 4 de 9
A partição ocorre com fases estacionárias líquidas (que são imobilizadas sobre suportes sólidos). Os componentes da mistura adsorvem-se com as partículas de sólido devido à interação de diversas forças intermoleculares. O composto terá uma maior ou menor adsorção, dependendo das forças de interação, que variam na seguinte ordem: formação de sais> coordenação> ligações de hidrogénio> dipolo-dipolo> Van der Waals. O processo de absorção (inter-superfícies) é regulado pela partição e ocorre devido a diferença de solubilidade dos componentes na fase estacionária líquida. Dependendo da natureza das duas fases envolvidas (estacionária e móvel) têm-se diversos tipos de cromatografia: Sólido-líquido Líquido-líquido Gás-líquido NA CROMATOGRAFIA EM PAPEL, a fase estacionária é o papel colocado numa tina. A fase móvel é o eluente que sobe pelo papel arrastando as substâncias que compõem as misturas. As diferentes substâncias sobem com velocidades diferentes, porque interagem de forma diferente com o eluente e com o papel. As substâncias que têm mais afinidade pelo eluente sobem mais rapidamente, enquanto as que têm grande afinidade pelo papel são arrastadas mais lentamente pelo eluente. Dessa forma, ocorre a separação, sendo possível visualizar os diferentes componentes de cada tinta. A cromatografia em papel é uma técnica de partição líquido-líquido, estando um deles fixo a um suporte sólido. Este método, embora menos eficiente que a cromatografia em camada fina, é muito útil para a separação de compostos polares. Existem separações em que a cromatografia unidirecional não consegue responder satisfatoriamente, sendo necessário recorrer cromatografia bidirecional, em que se utiliza outro solvente numa direção perpendicular à primeira para melhor separar as manchas. Página 5 de 9
Neste tipo de cromatografia, o eluente difunde-se ao longo de uma tira de papel que serve, simultaneamente, com suporte e como absorvente. O método é bastante semelhante ao descrito para a cromatografia em placa, utilizando igualmente uma câmara de cromatografia onde se coloca o eluente e no qual se introduz o papel, após aplicação da amostra. Na cromatografia em papel podem utilizar-se técnicas descendentes ou ascendentes conforme o eluente desce ou sobe ao longo do papel. Usa-se a técnica descendente nas situações em que o eluente é muito viscoso. Existem separações em que a cromatografia unidirecional não consegue responder satisfatoriamente, sendo necessário recorrer cromatografia bidirecional, em que se utiliza outro solvente numa direção perpendicular à primeira para melhor separar as manchas. NA CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA - uma pequena quantidade de uma amostra orgânica é colocada num ponto da placa, sendo adsorvida pela fase sólida (Figura a). A placa cromatográfica é colocada numa câmara fechada contendo um eluente que percorre a fase fixa em movimento ascendente por ação capilar, arrastando consigo a amostra orgânica (Figura b). A visualização dos componentes da mistura pode ser feita a olho nu (se os componentes forem corados) através de luz ultravioleta, por se tornarem fluorescentes quando excitados por essas radiações (cuidado!) e por vapores de iodo, num recipiente fechado (Figura c). (a) Aplicação da amostra na cromatoplaca (b) Eluição de uma placa cromatográfica; (c) Revelação de uma placa cromatográfica em câmara de iodo Página 6 de 9
Este procedimento é especialmente útil no caso de compostos que são sensíveis ao calor ou não são voláteis, ou seja, no caso de compostos que não são apropriados à determinação de ponto de ebulição ou à cromatografia em fase gasosa. A distância percorrida por cada composto em uma amostra, dividido pela distância percorrida pelo solvente é conhecida como o R f (fator de retenção). Comparações do valor de R f da amostra com o de um padrão é um método qualitativo usado na identificação de um composto. Para o cálculo de valor de R f mede-se a distância que a substância deslocou a partir do ponto de aplicação (ds), considerando-se para efeito de medida o centro de gravidade da mancha, e divide-se pela distância percorrida pela frente do solvente a partir do ponto original da amostra (dm). A Figura ilustra o cálculo do R f para os componentes de uma amostra. distância percorrida pelo soluto (ds) R f = distância percorrida pelo eluente (dm) Quando as condições de medida são completamente especificadas, o valor do R f é constante para uma dada substância, e corresponde a uma propriedade física daquele composto. O valor de R f pode, então, ser usado para identificar um composto desconhecido, mas como muitas substâncias podem ter o mesmo valor de R f, assim com podem ter o mesmo ponto de fusão, métodos adicionais devem ser utilizados para identificação inequívoca do composto. Como já foi referido existem várias técnicas cromatográficas que vão das mais simples como cromatografia de coluna e camada fina até as mais sofisticadas e computadorizadas, como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). De modo geral, entre os métodos modernos de análises, as técnicas cromatográficas, ocupam um lugar de destaque na química e bioquímica, na pesquisa e na indústria, devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas presentes em uma amostra, mesmo em misturas muito complexas. Aplicações da cromatografia em camada fina em Química Orgânica Estabelecer a identidade dos compostos; Determinar o número de componentes de uma mistura; Determinar o solvente apropriado para a separação por cromatografia em coluna; Monitorar uma separação realizada por cromatografia em coluna; Verificar a eficiência de uma separação; Monitorizar o andamento de uma reação. Página 7 de 9
Seleção da Fase Móvel O Solvente utilizado tem um papel fundamental na separação dos componentes. Verifica-se uma competição entre as moléculas da amostra e da fase móvel, pela superfície adsorvente, assim a natureza química da amostra e a polaridade da fase móvel é da maior importância na eficácia do processo. Revelação de um cromatograma Pode ser por métodos físicos ou químicos. Compostos UV-ativos, que aparecem como manchas escuras em fundo fluorescente, se a placa for iluminada com lâmpada de luz ultravioleta (Método físico) Quase todas as classes de substâncias orgânicas (exceto alcanos e haletos alifáticos) reagem com iodo formando complexos. A formação desses complexos é reversível. As placas também podem ser borrifadas com outros reveladores (ácido sulfúrico/metanol, vanilina sulfúrica, tricloreto de antimônio, permanganato de potássio/ácido sulfúrico, etc.). (Método químico) Reveladores Biológicos: Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para tornar a mancha visível. Placa de sílica, eluída com diclorometano:metanol (97:3). A placa foi borrifada com solução esporos de fungos e, onde apareceram manchas brancas porque houve inibição dos fungos pelas substâncias contidas nos extratos de uma planta. Página 8 de 9
Se os componentes da mistura a cromatografar são corados, a tarefa está simplificada, já que aparecem manchas coloridas a diferentes alturas. No entanto a maior parte das vezes isso não acontece e torna-se então necessário recorrer a processos de revelação, tais como: 1. Luz ultravioleta método físico não destrutivo, permite a recuperação das substâncias. 2. Reveladores universais aplicados por pulverização sendo alguns destrutivos (ácido sulfúrico) e outros não (iodo) 3. Reveladores específicos reveladores especiais. Interpretação de um cromatograma As maiores potencialidades de um cromatograma: I. Permitem-nos ter uma ideia do grau de pureza de uma determinada amostra. II. III. Permite-nos determinar o número de componentes existentes numa mistura. Permite-nos tirar conclusões sobre a identidade de uma substância. Técnicas cromatográficas Hifenadas Cromatografia Gasosa associada à espectrometria de massa. Cromatografia líquida associada à espectrometria de massas em sequências Cromatografia líquida associada à ressonância magnética nuclear O Professor: Henrique Manuel Dias Gonçalves Página 9 de 9