QFL-5922 Espectrometria de Massa Luiz Henrique Catalani
Data Tópicos 30/03 Espectrometria de massas Técnicas básicas 06/04 Espectrometria de massas Teoria de fragmentação 13/04 Espectrometria de massas Teoria de fragmentação 20/04 Resolução de problemas 27/04 1ª Prova 04/05 Seminários
Períodicos especializados em espectrometria de massas: 1. International Journal of Mass Spectrometry 2. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 3. Journal of Chromatography. A, Including Electrophoresis, Mass Spectrometry and other Separation and Detection Methods 4. Journal of Mass Spectrometry 5. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 6. Mass Spectrometry for Biotechnology 7. Mass Spectrometry Reviews 8. Rapid Communications in Mass Spectrometry
Histórico 1897: J.J. Thompson descobre elétron e determina m/z 1912: J.J. Thompson constrói o primeiro espectrômetro de massas 1942: Demster desenvolve a fonte de impacto de elétrons 1942: Primeiro instrumento comercial para análise orgânica 1953: Quadrupolo e ion trap (W. Paul e H.S. Steinwedel, Nobel 1989) 1956: Primeiro GC-MS 1974: Primeiro HPLC-MS 1987: Demonstração de MALDI 1988: Demonstração de ESI 1990s: Crescimento explosivo de MS, devido a ESI e MALDI 2002: Nobel para inventores ESI (Fenn e Tanaka)
Informações Obtidas da Espectrometria de Massa A massa molecular A fórmula molecular A massa de fragmentos Detalhes estruturais do composto
Espectrometria de Massas Técnica analítica para: identificação de compostos desconhecidos quantificação de compostos conhecidos. Sensibilidade: Substâncias podem ser detectadas com quantidades mínimas de amostra (10-12 g, 10-15 moles pra um composto de massa 1000 Daltons. Seletividade: Substâncias podem ser identificadas e quantificadas em concentrações muito baixas (uma parte em 10 12 ) em misturas complexas.
Definição IUPAC Espectrometria de Massas: Estudo de sistemas pela formação de íons em fase gasosa, com ou sem fragmentação, que são caracterizados por suas relações massa carga e abundâncias relativas
Em que consiste EM Ionização Separação dos íons Detecção dos íons Fonte Analisador Detector Entrada Manipulação dos dados Sistema de dados Introdução da amostra Saída dos dados Ion Abundance (%) 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 250 m/z Espectro de massas
Espectro de massas 100 Pico base (ion 100%) Íons fragmentários Pico do íon molecular (Precursor) Ion abundance (%) 80 60 40 20 Isótopos m/z
Reações de produção de íons em EM Protonação Remoção de elétrons e - M M + Captura de elétrons M + H + [MH] + Cationização M + Na + [MNa] + M + e - M Desprotonação H + M H M
Necessidade de vácuo Passo livre médio percorrido por uma molécula entre colisões L (em cm) = p 4,95 (em mtorr) Sugere pressões da ordem de 10-5 torr para mover uma molécula um metro sem colisão
Espectrômetro de massas Sistema de dados Alto vácuo 10-5 -10-8 mbar Sistema de inserção Fonte de íons Analisador Detector HPLC GC Bomba seringa ESI* APCI* MALDI EI CI Quadrupolo TOF Ion trap FT-ICR Setor Magnético Fotomultiplicador Multiplicador de elétrons Microchannel Plate *Fonte de íons a pressão atmosférica
Métodos de produção de íons em EM
Métodos de produção de íons em EM EI (electron impact) CI (chemical ionization) FAB (fast atom bombardment) MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) API (atmospheric pressure ionization) ESI (electrospray ionization) APCI (atmospheric pressure chemical ionization) ICP (inductively-coupled plasma) TIS (thermal ionization source)
Como ocorre a ionização por EI?
Fonte de Impacto Eletrônico (EI)
70 ev e - A-B-C <70 ev e - Elétrons de baixa energia A + + B-C. A-B-C +. cátion radicalar A-B. + C + A. + B-C + A-B + + C. B + C + B + + C A + B + A + + B
Vantagens e desvantagens de EI Vantagens Método robusto e simples Fragmentação fornece informações estruturais; Espectros são facilmente reprodutíveis; Existência de biblioteca de impressões digitais ; Limitações Requer volatilização da amostra ou derivatização; Para substâncias de massa molar <800 uma Amostra deve ser termicamente estável; Íon molecular pode ser de difícil identificação; Fragmentação pode ser extensa (moléculas maiores).
Ionização química - CI
Como ocorre a ionização química? Modificação de EI Resulta em pouca ou nenhuma fragmentação Gás e amostra entram junto Amostra é tipicamente 1% da mistura Maior pressão do gás gera ionização preferencial Espécie iônica gerada transfere carga para o analito
Mecanismos de ionização química Troca de carga (hélio como reagente) He + + M He + M + Reações ácido-base Com metano: CH 5 + + M CH 4 + M + (P elevadas) Com água: OH - + MH H 2 O + M - Adição de grupo alquila C 2 H 5 + + M MC 2 H 5 +
Como ocorre a ionização química? O gás reagente pode ser: Introduzido diretamente na fonte Misturado com a amostra antes de entrar na fonte. Requer colisão, logo, as pressões são mais altas L = = 4,95 0,01cm = p p 4,95 495 mtorr p A fonte CI é uma fonte EI modificada
Vantagens e desvantagens de CI Vantagens Determinação do peso molecular (íon molecular) Baixa fragmentação Limitações Vários parâmetros (gás, reagente e pressão relativa) dificultam a reprodutibilidade Ausência de espectros de referência Perda de informações estruturais devido à baixa fragmentação
Bombardeamento rápido de átomos (FAB) Técnica rápida e simples para análise de compostos de 300 a 6000 Da; Amostra é dissolvida numa matriz líquida, viscosa e com baixa pressão de vapor (glicerol ou álcool 3-nitrobenzílico); Matriz é bombardeada com feixe de átomos (xenônio ou argônio) ou íons (césio) de alta energia cinética; Moléculas são removidas da superfície da matriz, entram na fase gasosa e se ionizam por protonação ou desprotonação; Íon resultante é estável e fragmenta pouco.
Como ocorre a ionização por FAB?
Vantagens e desvantagens de FAB Vantagens Rapidez e simplicidade Tolerante às variações na amostra Corrente intensa de íons (bom para altas resoluções) Limitações Requer que o analito seja solúvel na matriz líquida Requer pureza e boa quantidade de amostra Não é adequado para compostos com mais de duas cargas
EM via FAB de 5 peptídeos íons (M+H)+; Seqüenciamento do m/z 872
Dessorção/ionização a LASER assistida por matriz - MALDI Preparação de amostra: analito dissolvido junto com uma substancia orgânica, matriz, que possui absorção intensa no λ do laser (λ = 337 nm para laser de N 2 ); Dessorção da solução sólida por um laser pulsado (ns) de alta intensidade; Matrizes típicas: ácido 2,5-dihidroxibenzóico; ácido 3,5- dimetóxi-4-hidroxicinâmico; ácido 5-clorosalicílico; Espectro resultante inclui íons (M+H) +, e outros com prótons adicionais, retirados da matriz. Deve ser usado com analisadores compatíveis com métodos pulsados (TOF ou FT-ICR)
MALDI
Matrizes típicas Utilizadas em MALDI Placa de amostras para MALDI 100 poços padrão
Vantagens e desvantagens de MALDI Vantagens Baixa concentração do analito Velocidade Análise de polímeros e macromoléculas polares e nãopolares (M>50.000) Limitações Não compatível com LC/MS Difícil obtenção de espectros de MS/MS Deve ser usado com analisadores compatíveis com métodos pulsados (TOF ou FT-ICR)
EM via MALDI de um anticorpo monoclonal EM via MALDI de poli(metil metacrilato) M w = 7100 Da MW mero = 100
Ionização por electrospray - ESI Substância dissolvida numa mistura, p.ex. agua-metanol, é injetada diretamente, ou por HPLC, ou por eletroforese capilar. Íons são formados a partir das gotas a pressão atmosférica e formam um jato por expansão livre. O mecanismo exato ainda é objeto de especulações. Amostragem ocorre através de um skimmer, e introduzidos no alto vácuo do espectrômetro. Íons com número elevado de cargas. Íons com carga múltipla podem ser detectados mesmos com instrumentos menos sofisticados. O número de cargas pode depender do ph, da presença de sais, desnaturação da proteína, quebra de ligações S-S, etc.
Ionização por electrospray
Vantagens Amostras não-voláteis Ionização branda a pressão atmosférica Análise de compostos de elevado peso molecular Acoplamento com HPLC e eletroforese capilar Limitações Vantagens e desvantagens de ESI Espécies multiplamente carregadas exigem transformações matemáticas para interpretação do espectro Complementar à APCI. Não é boa para compostos não carregados, não básicos e de baixa polaridade, como esteróides Muito sensível a contaminantes, tais como metais alcalinos ou compostos básicos Corrente de íons relativamente baixa
EM da lisozima: MW calculado = 17828 ± 2.0 Da
Mioglobina de cavalo MW = 16.951,5 Da A. Íons de carga +12 a +24 em baixa resolução B. Ampliação do +17 mostrando picos isotópicos (resolução 15.000)
Determinação do número de cargas e de M em espectros contendo íons com cargas múltiplas a) Em espectros electrospray, a massa de um íon m 1 com carga z 1 pode ser equacionada com a massa da molécula (M) e da massa do próton (m p ) m z 1 M 1 = = z M m 1 ( 1 + m m2( z1 j) = M + mp ( z1 j) p m b) Escolhendo outro pico no espectro, separado por (j-1) picos em ordem crescente de m/z, podemos equacionar a massa m 2 como z p 1 ) (1) (2) c) Da combinação de (1) e (2): z 1 j( m ( m 2 2 m m 1 p ) ) = (3)
Ionização química a pressão atmosférica (APCI) Ionização similar à electrospray, com exceção de que: Ocorre em uma coroa de descarga e não no capilar Capilar encontra-se aquecido e não está submetido à alta voltagem As moléculas de solvente são ionizadas primeiramente.
NATUREZA DA AMOSTRA MÉTODO DE IONIZAÇÃO EXEMPLO Amostras gasosas, voláteis e EI, CI CO2, NO, solventes,pah, dioxinas termicamente estáveis Moléculas pequenas (< 1000 u), puras e suficientemente estáveis e voláteis para serem dessorvidas de uma sonda EI, CI (Em EI o pico do íon molecular pode não aparecer) Muitas moléculas orgânicas Moléculas pequenas (< 1500 u) que não são voláteis ou termicamente estáveis. Devem ter um grau de afinidade de próton Moléculas como as acima, mas que podem ser derivatizadas para dar produtos voláteis e estáveis Peptídeos, proteínas e oligonucleotídeos Proteínas, peptídeos e misturas do mesmos FAB (se pura), ESI ou APCI (infusão ou via HPLC, se necessário). EI ou CI usando CG/MS. ESI (via bomba de infusão ou acoplada com micro-clae). MALDI Aminoácidos, carboidratos, lipídios Ácidos como ésteres, álcoois como silil-éteres Proteínas intactas. PPG, PEG Interações não-covalentes ESI (nanoflluxo) com MS-MS. Interações droga-droga ou drogaproteína Análise elementar ICP ou TIS Solo
Métodos de análise de íons em EM
Métodos de análise de íons em EM Deflexão elétrica Deflexão magnética Quadrupolo Tempo de vôo TOF (time of flight) Aprisionamento de íons IT (Ion trap) Ressonância ciclotrônica de íons FT-ICR (Fourriertransform ion cyclotron resonance)
Deflexão magnética
Deflexão magnética
Deflexão elétrica
Deflexão elétrica
Foco duplo alta resolução Modelo Nier-Johnson - E constante H variável
Quadrupolo
Quadrupolo + - -- + ++ - M = z 2V 2 2 D υ D Para um determinado V, D e ν só existe um M/z que tem uma oscilação estável através do quadrupolo sem chocarse com os polos.
TOF (tempo de vôo)
TOF (tempo de vôo) TOF tipo Reflectron
TOF (tempo de vôo) TOF = t 0 + t a + t D + t d Onde: t 0 = tempo de formação do íon t a = tempo de aceleração t D = tempo de percurso t d = tempo de resposta do detector
Aprisionamento de íons (Ion trap)
Aprisionamento de íons (Ion trap) Íons são presos através da ação de três eletrodos (2 end-cap e um anel) Voltagens aplicadas geram uma cavidade onde os íons oscilam em uma trajetória estável A trajetória exata dos íons é dependente das voltagens aplicadas e da razão m/z A alteração dos potenciais destabiliza a trajetória resultando em sua ejeção através do endcap de saída, em ordem crescente de m/z É possível isolar um valor particular de m/z e, assim, permitir experimentos CID (collision induced dissociation), para análise de íons-filho e MS n
Ressonância ciclotrônica de íons FT-ICR (Fourrier-transform ion cyclotron resonance)
Ressonância ciclotrônica de íons Íons se movem em um movimento circular em um campo magnético A freqüência ciclotrônica do movimento circular é dependente da massa Sob excitação externa de mesma freqüência (ressonante), a orbita aumenta e, quando se aproxima do receiver plate, induz uma corrente imagem que é amplificada e digitalizada Um unico pulso contendo todas as freqüências gera uma corrente-imagem contendo informações sobre todos os íons de diferentes massas (diferentes freqüências) Transformada de Fourrier do sinal da corrente-imagem gera espectro de massa
Ressonância ciclotrônica de íons
Ressonância ciclotrônica de íons Técnica de grande resolução (maior entre TOF, IT e anteriores) Adequado para técnicas pulsadas como MALDI Magneto supercondutor provém calibração estável Faixa dinâmica de trabalho é baixa Apresenta artefatos como harmonicas e bandas laterais
Orbitrap - Similar ao FT-ICR - Maior resolução (~200.000) - Maior faixa dinâmica de trabalho (~5000 Da)
Análise em série Tandem MS
Análise em série Tandem MS Combina dois ou mais analisadores diferentes ou do mesmo tipo O primeiro analisador isola o íon de interesse (íon parente) Íons são fragmentados entre o primeiro e segundo analisador através de colisões ou irradiação O último analisador obtém o MS dos fragmentos (íons filho)
Detectores
Detectores - Fotomultiplicadoras
Detectores Multiplicadora de dinôdo contínuo
Detectores Microchannel plate 12,5 µm de diâmetro
Fim