BUSCA DE PARCEIROS BIOLÓGICOS DE ctpxi DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZES DA FORMAÇÃO DE DISSULFETOS MISTOS SOB ESTRESSE OXIDATIVO SEARCHING FOR BIOLOGICAL PARTNERS OF THE Saccharomyces cerevisiae ctpxi ABLE TO FORM MIXED DISULFIDE BOND IN RESPONSE TO OXIDATIVE STRESS Aline Keiko Ishikawa, Luana Martins de Andrade, Marcos Antonio de Oliveira Campus Experimental do Litoral Paulista Unidade São Vicente Ciências Biológicas aline.ishikawa@clp.unesp.br PIBIC/CNPq. Palavras-chave: espécies reativas de oxigênio; estresse oxidativo; tiorredoxina peroxidase. Keywords: reactive oxygen species; oxidative stress; thioredoxin peroxidase. RESUMO 1. INTRODUÇÃO Espécies reativas de oxigênio (EROs) são moléculas presentes em todos os organismos aeróbios, sendo relacionadas a processos como crescimento, apoptose e diferenciação celular, além de possuir características patogênicas quando em altas concentrações (Ji, 2007). Dentre as variadas EROs geradas nos sistemas biológicos, destacam-se o ânion superóxido (O 2 _ ), o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) e o radical hidroxila (HO ) (Halliwell & Gutteridge, 2007). Para modular as concentrações, os organismos contam com enzimas antioxidantes, dentre elas, estão as Tiorredoxina Peroxidases (TPx), as quais são amplamente distribuídas em diversos organismos. As TPx são capazes de reduzir seus substratos através de cisteínas altamente reativas, localizadas em seus sítios ativos, sendo a grande maioria destas proteínas detentoras de duas cisteínas envolvidas na decomposição de peróxidos, denominadas cisteína peroxidásica (Cys P ) e cisteína de resolução (Cys R ) (Poole, 2007). Em leveduras, foram caracterizadas cinco isoformas das TPx, sendo uma encontrada no núcleo celular (ntpx), uma na mitocôndria (mtpx) e três no citossol (ctpxi, ctpxii, ctpxiii) (Park et al., 2000). Adicionalmente a atividade peroxidásica, estudos demonstraram que ctpxi possui função de chaperona molecular quando submetida a choques térmicos ou estresse oxidativo (Poole, 2007). Em experimentos utilizando Schizosaccharomyces pombe como organismo experimental foram detectadas associações entre a enzima TPx (que possui alta identidade com ctpxi de Saccharomyces cerevisiae), com a MAP quinase Sty1, quando esta levedura foi submetida a estresse por H 2 O 2. Este trabalho demonstra a ocorrência de interações físicas entre uma TPx e fatores de crescimento celular (Veal et al., 2004). Esta associação envolveu a formação de um dissulfeto misto estável entre um mutante de SpTPx, o qual carreava a substituição da sua Cys R por uma serina. Apesar de S. cerevisiae ser o eucarioto mais estudado até o presente momento, sendo um modelo para estudos de crescimento celular, nenhum trabalho atentou para o estudo de interações físicas com MAPK ligadas ao crescimento celular. 2. OBJETIVOS Este trabalho teve por objetivo a investigação e caracterização de interações efetuadas por dissulfetos mistos entre a isoforma citossólica I da TPx (ctpxi) através de ligações covalentes com parceiros biológicos por meio de dissulfetos mistos, em resposta ao estresse oxidativo por H 2 O 2. Para tanto foram padronizadas a expressão heteróloga e a purificação das proteínas ctpxi e 1
ctpxi C170S, como também realizados experimentos visando a detecção de complexos protéicos unidos por dissulfetos mistos por SDS PAGE em condições não redutoras e redutoras e identificação de supostos parceiros biológicos por espectrometria de massas (LC/MS/MS). 3. MATERIAIS E MÉTODOS Para a cultura de bactérias foi utilizado o meio LB, e para as leveduras foi empregado o meio YPD. Os meios de cultura sólidos foram obtidos adicionando Ágar em concentração final de 2%. A visualização dos resultados foi realizada por SDS PAGE 12%, corados por Coomassie Blue ou nitrato de prata. A expressão heteróloga das proteínas foram efetuadas utilizando linhagens de E. coli BL21 (DE3) contendo plasmídeos pet15b/ctpxi e pet15b/ctpxi C170S. O rompimento das células foi realizado por sonicação (35% de amplitude), e a purificação das proteínas contendo cauda de histidina, inseridas pelo plasmídeo de expressão, foi efetuada através de cromatografia de afinidade por metais imobilizados (IMAC), em gradiente de imidazol. O extrato protéico solúvel total de levedura foi obtido de linhagens BY4741 ctpxi/ ctpxii, e o rompimento celular foi realizado pelo método de glass beads. Foram testadas várias concentrações de ctpxi C170S, extrato protéico total de levedura e H 2 O 2 para o ensaio de formação de complexos, sendo a melhor condição encontrada de 8,8mg de ctpxi C170S : 19mg de extrato protéico total de levedura e [50μM] final de H 2 O 2. Devido à oxidação das proteínas pelo O 2 molecular, tanto ctpxi C170S quanto o extrato protéico foram previamente reduzidos com DTT ou β-mercaptoetanol, respectivamente, com posterior retirada do excesso dos agentes redutores através de cromatografia de filtração em gel utilizando colunas PD10 Desalting (GE Healthcare). O ensaio foi realizado overnight a 4ºC, sendo em seguida co-purificado por IMAC para obtenção dos complexos. Então, foi feita avaliação dos resultados por SDS-PAGE com coloração por nitrato de prata, para melhor detalhamento das condições amostradas. Para a análise de espectrometria de massas, as amostras foram preparadas conforme o protocolo de digestão in gel disponibilizado pelo Laboratório Nacional de Luz Síncroton (LNLS). 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES O resultado de quantificação do extrato protéico total pela metodologia empregada apresentou rendimento bastante satisfatório (Figura 1). 2
Figura 1. Curva padrão da concentração do extrato protéico total de levedura. Foram utilizadas concentrações crescentes (50-500µg/mL) de ctpxi C170S para a quantificação do extrato protéico total de S. cerevisiae. Por sua vez, os resultados das purificações iniciais por IMAC de ctpxi C170S e ctpxi wt revelaram que as proteínas recombinantes carreando a cauda de histidina (massa molecular = 23.346,8 Da) apresentaram alto grau de pureza e bom rendimento (Figura 2). Figura 2. SDS-PAGE contendo resultados de alíquotas da purificação por IMAC de ctpxi WT (A) e de ctpxi C170S (B). As bandas protéicas foram coradas com coomassie blue. Em ambas as figuras, as lanes representam, da esquerda para a direita: 1) PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Fermentas); 2, 3, 4 e 5) Alíquota inicial de eluído de 50mM, 100mM, 150mM e 200mM de Imidazol, respectivamente. 6-7) Alíquota de eluído contendo ctpxi C170S em 500mM de Imidazol. A legenda no lado direito da figura (~23kDa) identifica as proteínas ctpxi WT (A) e ctpxic170s (B). Nos experimentos, ctpxi C170S foi utilizada como isca e os alvos biológicos como presas. As presas foram capturadas através do estabelecimento de um dissulfeto misto decorrente do tratamento com H 2 O 2. Os complexos foram co-purificados por IMAC através de gradiente de imidazol, em razão de ctpxi C170S possuir cauda de histidinas. Como uma ponte dissulfeto é uma interação covalente, o resultado destes experimentos podem ser detectados em SDS-PAGE, uma vez que a interação deve gerar bandas com massas moleculares superiores a de ctpxi C170S e os parceiros moleculares podem ser identificados por espectrometria de massas. A Figura 3 mostra o resultado do ensaio de obtenção de complexos. A co-purificação apresentada no gel abaixo continha 0,67mg/ml de extrato protéico total de levedura (15ml) e 5,9mg/ml de ctpxi C170S (1,5ml), aproximadamente 1:1. Figura 3. Resultado de SDS-PAGE apresentando a co-purificação de complexos protéicos entre ctpxic170s e supostos parceiros biológicos após oxidação por H 2 O 2. SDS-PAGE com revelação por nitrato de prata. As lanes presentes no gel correspondem: 1) PageRuler TM Prestained Protein Ladder (Fermentas); 2) Alíquota do extrato protéico solúvel total de levedura (EPSTL) pré reduzida com β-mercaptoetanol, seguida de retirada do excesso; 3) Alíquota de ctpxic170s pré reduzida por DTT e seguida de retirada do excesso. 4, 5, 6, 7 e 9) Resultados do ensaio 3
para formação de complexos protéicos purificado através de gradiente de Imidazol (50, 100 e 200mM lanes 4 a 6, respectivamente; lanes 7 e 9 500mM). 8 e 10) Alíquotas 7 e 9 reduzidas por DTT, respectivamente. O peso molecular das bandas detectadas no marcador de peso molecular estão assinalados à esquerda, e as legendas do lado direito da figura assinalam a proteína ctpxic170s. Os asteriscos vermelhos (*) na figura identificam as bandas relacionadas aos supostos complexos protéicos unidos por dissulfetos mistos, sendo de ~38kDa (amostra oxidada) e ~15kDa (amostra reduzida). Os asteriscos azuis (*) indicam as bandas com massa inferior ao da ctpxi C170S, entre 12-18kDa, as quais se revelaram na amostra reduzida. Na lane 9 da Figura 3 foi detectada uma banda adicional com massa molecular superior a de ctpxi C170S, aproximadamente 38 kda, e que aparentemente não possui correspondentes no extrato protéico total de levedura ou na ctpxi C170S purificada por IMAC, indicando a formação de complexo. Após a amostra da lane 9 ser tratada por DTT, foram detectadas três bandas com massa entre 12-18 kda (Figura 3 lane 10), as quais não foram encontradas antes do tratamento com DTT (Figura 3 lanes 7 e 9), confirmando a hipótese de um complexo protéico com ctpxi C170S. Como controle negativo, o mesmo ensaio foi realizado com ctpxi WT, e está representado na Figura 4. Figura 4. SDS-PAGE contendo resultado da co-purificação do experimento de controle negativo realizado com ctpxiwt e ΔcTPxI/ΔcTPxII. SDS-PAGE, com revelação por nitrato de prata. As lanes presentes no gel correspondem: 1) PageRuler TM Prestained Protein Ladder (Fermentas); 2) Alíquota do extrato protéico solúvel total de levedura (EPSTL) pré reduzida com β-mercaptoetanol, seguida de retirada do excesso por cromatografia de filtração em gel; 3) Alíquota de ctpxi WT pré reduzida por DTT e seguida de retirada do excesso. 4-8) Resultados do ensaio de controle negativo purificado através de gradiente de Imidazol (50, 100 e 200mM lanes 4 a 6, respectivamente; lanes 7 e 8 500mM). O peso molecular das bandas detectadas no marcador de peso molecular estão assinalados à esquerda, e as legendas do lado direito da figura indicam a proteína ctpxiwt e as bandas com os pesos moleculares correspondentes aos dímeros de ctpxi WT. As amostras identificadas acima foram submetidas a digestão in gel utilizando tripsina (conforme descrito na seção Materiais e Métodos) e serão submetidas a espectrometria de massas no Laboratório de Espectrometria de Massas (LEC) do Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), conforme as propostas de pesquisa já aprovadas (MAS-11218) as quais foram agendadas para os dias 13-15 e 18 de Julho de 2011. 5. CONCLUSÕES Os resultados deste trabalho verificaram que há a interação entre ctpxi C170S de S. cerevisiae e parceiros biológicos, com a formação de dissulfetos mistos sob estresse oxidativo. A metodologia demonstrou-se eficiente para o alcance dos objetivos, sugerindo que a concentração do agente oxidante foi adequada para o ensaio. Assim, os experimentos de espectrometria de massas (LC/MS/MS) identificarão quais são os parceiros biológicos de ctpxi C170S. 6. BIBLIOGRAFIAS 4
JI, L. L. Antioxidant signaling in skeletal muscle: A brief review. Exp. Geron.42: 582-593, 2007. HALLIWELL, B., GUTTERIDGE, J. M. C. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview. Metho. Enzymol. 186: 1-85, 2007. PARK, S. G. Distinct physiological functions of thiol peroxidase isoenzymes in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 275: 5723-5732, 2000. POOLE, L.B. The catalytic mechanism of peroxiredoxins. Subcell Biochem. 44: 61-81. 2007. VEAL, E.A., et al. A 2-Cys peroxiredoxin regulates peroxide-induced oxidation and activation of a stress-activated MAP kinase. Mol. Cell. 15: 129-139, 2004. APOIO FINANCEIRO: PIBIC/CNPq PROTOCOLO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA: NÃO SE APLICA 5