PARTICIPAÇÃO DO RECEPTOR ST2 DA IL-33 NO ESTRESSE OXIDATIVO HEPÁTICO INDUZIDO PELO CCL4.

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1 PARTICIPAÇÃO DO RECEPTOR ST2 DA IL-33 NO ESTRESSE OXIDATIVO HEPÁTICO INDUZIDO PELO CCL4. (1)Cássia Calixto de Campos (PIBIC/CNPq-UEL); (1)Renato D. Ramalho Cardoso(Colaborador); (1)Victor Fattori(Colaborador) ; (1)Flávia Alessandra Guarnier(Colaboradora); (1)Rubens Cecchini(Colaborador); (1)Rubia Casagrande(Colaboradora); (2)José Carlos Alves-Filho(Colaborador); (2)Damo Xu(Colaborador); (2)Foo Y. Liew(Colaborador); (3)Fernando Q. Cunha(Colaborador); (1)Waldiceu A. Verri Jr (Orientador), waldiceujr@yahoo.com.br (1)Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Ciências Patológica/ Londrina, PR. (2) University of Glasglow/ Division of Immunology, infection and inflammation/ Glasgow-Escócia; (3) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FRMP-USP)/Departamento de Farmacologia. Ribeirão Preto-SP. Ciências Biológica - Farmacologia Palavras-chave: IL-33, estresse oxidativo, lesão hepática. Resumo: A IL-33 é uma citocina da família da IL-1 com funções imunoreguladoras que sinaliza via seu receptor ST2, induzindo a ativação de MAP quinases, do fator de transcrição NFkB e produção de citocinas próinflamatórias. Existem evidências que a super-expressão do ST2 reduz a lesão hepática em modelo de isquemia e reperfusão e que ocorre aumento da produção de IL-33 e ST2 após administração de CCl 4 (tetracloreto de carbono). Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a participação e os mecanismos da IL-33 via seu receptor ST2 com ênfase no estresse oxidativo, na letalidade e lesão hepática induzidas pela administração de CCl 4 em camundongos. Foram utilizados camundongos Balb/c (ST2 +\+ ) e ST2/KO (ST2 -/- ) para a realização de testes de sobrevida, análise histológica e avaliação do estresse oxidativo observando a letalidade induzida pelo CCl 4. Observou-se menor letalidade e menor estresse oxidativo induzido pelo CCl 4 em camundongos deficientes para ST2 -/- em comparação aos controles ST2 +/+. Esse dado sugere que a IL-33 agindo via ST2 é uma citocina importante para a letalidade e lesão hepática induzidas pelo CCl 4 em camundongos por um mecanismo relacionado ao aumento do estresse oxidativo. Dessa forma, é possível que a inibição da atividade da IL-33 possa aumentar a janela terapêutica em intoxicações com lesão hepática que apresentem mecanismos semelhantes aos do CCl 4.

2 Introdução A IL-33 é uma citocina da família da IL-1 que se liga com seu receptor específico denominado ST2. (SCHMITZ et al., 2005). O gene st2 codifica duas proteínas, uma forma que é ligada à membrana, denominada ST2L e uma forma solúvel, denominado sst2 (XU et al., 1998; LIEW et al., 2005). A IL-33 ao se ligar com o ST2L induz a transdução de sinal pelo recrutamento de diferentes moléculas como MyD88, IRAK, IRAK4 e TRAF6, o que resulta na ativação de MAP quinases (p38, JNK e ERK) e fator de transcrição NFκB, com conseqüente produção de citocinas (SCHIMTZ et al., 2005). A outra forma encontrada denominada de sst2 (solúvel) é obtida através do processamento de mrna diferencial. O sst2 atua como um receptor seqüestrador da IL-33 inibindo a sua atividade (LIEW et al., 2010). O fígado é um órgão de crucial importância para o organismo, pois exerce funções vitais relacionadas ao metabolismo. Uma das principais funções do fígado é a detoxificação de drogas e toxinas. Algumas drogas ao serem metabolizadas se transformam em compostos altamente hepatotóxicos (RANG, 2007). Como exemplo, podemos citar o CCl 4 (Tetracloreto de carbono) que ao ser metabolizado, se transforma nos radicais livres triclorometil e triclorometilperoxil que lesionam o tecido hepático. A maioria dos radicais livres são derivados do metabolismo do oxigênio e são encontrados em todos os sistemas biológicos. As espécies reativas do oxigênio (EROs) são o ânion-radical superóxido (O 2.- ), o Peróxido de Hidrogênio (H 2 O 2 ), o Radical hidroxil (. OH), o Radical Hidroperoxila (HO 2 ), o Oxigênio Singlet ( 1 O 2 ) e o Ozônio (O 3 ) (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1985). O desequilíbrio entre moléculas oxidantes e antioxidantes que resulta diretamente na indução de danos celulares pelos radicais livres denomina-se estresse oxidativo. A ocorrência de um estresse oxidativo é acompanhada do aumento das defesas antioxidantes enzimáticas (ANDERSON, 1996). Considerando o aumento da expressão da IL-33 e ST2 pelo estímulo com CCl 4 (YIN, 2000; MARVIE, 2009), e que o CCl 4 induz seus efeitos tóxicos via radicais livres, investigamos se a IL-33 teria um papel na intoxicação com CCl 4 relacionado a produção de radicais livres. Materiais e métodos Foram utilizados camundongos Balb\c e ST2\KO machos pesando entre 20-25g. Os camundongos foram submetidos a administrado intraperitonial (i.p.) da solução de CCl 4 diluído em Óleo de Milho (1:3) na dose de 0,1ml\10g de peso corpóreo, dose única. Primeiramente foi realizada análise de sobrevida com os camundongos tratados com CCl 4 ou veículo. Posteriormente foi avaliado se a deficiência (-/-) para ST2 resultaria em alteração da sobrevida, histológicas e estresse oxidativo 6 h após estímulo com CCl 4.

3 A avaliação do Estresse Oxidativo foi realizada pelos testes de: Quimiluminescência, Determinação da capacidade antioxidante total (TRAP) por quimiluminescência, Determinação da Proteína Carbonílica Atividade da Superóxido Dismutase (SOD), Atividade da Catalase e Dosagem de Proteínas. Resultados e Discussão O óleo de milho não alterou a sobrevida dos animais Balb/c (ST2 +/+ ) e ST2 -/- enquanto o CCl 4 induziu 100% de letalidade em camundongos ST2 +/+ e 20% de letalidade em animais ST2 -\-, portanto, houve um aumento no tempo de sobrevida de animais ST2 -/- comparados com ST2 +/+ Houve aumento significativo da TRAP em animais ST2 +/+ CCl 4 comparados com ST2 +/+ veículo, e em animais ST2 -/- CCl 4 comparados com ST2 +/+ CCl 4. Isto demonstra uma proteção dos antioxidantes endógenos relacionado a uma diminuição da lesão por estresse oxidativo. Houve aumento significativo de carbonilação de proteínas nos animais ST2 +/+ CCl 4 e redução nos animais ST2 -/- CCl 4. Assim, a deficiência do gene ST2 reduziu a carbonilação de proteínas induzida pelo CCl 4. A administração de CCl 4 reduziu a peroxidação lipídica (QL) em animais ST2 -/- CCl 4. A falta do gene ST2 reduz parcialmente a peroxidação induzida pelo CCl 4. O tratamento com CCl 4 induziu aumento significativo da atividade da SOD em animais ST2 +/+ e ST2 -/- comparados com os controles (veículo). O tratamento com CCl 4 induziu aumento significativo da atividade da SOD em animais ST2 +/+ e ST2 -/- comparados com os controles (veículo), porém, a atividade da SOD foi significativamente menor nos animais ST2 -/- CCl 4 comparados com os controles ST2 +/+ CCl 4. A atividade da catalase foi reduzida em animais ST2 -/- CCl 4 comparados com ST2 -/- veículo, sugerindo que houve o seu consumo durante o estresse oxidativo induzido pelo CCl 4, o que influenciou diretamente na sobrevivência dos animais. Pode-se observar que animais ST2 -\- não tratados possuem menos SOD e maior atividade da CAT, porém, quando os mesmos animais são tratados com CCl 4, observa-se o consumo da CAT e diminuição nos níveis da mesma e um aumento da SOD. Tal fato deve-se pela SOD estar em maior atividade, conseqüentemente aumentando a dismutação do ânion superóxido que atua na formação de H 2 O 2, tal composto é convertido em H 2 O e O 2 pela CAT, estas transformações utilizam proporcionalmente a CAT existente, diminuindo diretamente seus níveis. Não foi observada diferença histológica entre os grupos, todos apresentaram alterações histológicas, indicando lesões reversíveis como tumefação turva e degeneração hidrópica. Conclusões Ao avaliar a participação do receptor ST2 na letalidade e lesão hepática induzida pelo modelo de intoxicação de CCl 4 em camundongos, foi

4 observada redução do estresse oxidativo e redução da mortalidade, através do aumento da sobrevida dos camundongos ST2 -\- quando comparado com os camundongos ST2 +\+. Desta forma, é possível que a inibição da atividade da IL-33 possa aumentar a janela terapêutica em intoxicações com lesão hepática, qual tenham mecanismos semelhantes aos do CCl 4, e assim, otimizaria a utilização de terapias convencionais. Agradecimentos Agradecemos o apoio financeiro da FAPESP, CNPq, CAPES e Fundação Araucária. Referências Anderson, D. Antioxidant defences against reactive oxygen species causing genetic and other damage. Mutat Res, Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases. Molec. aspects of medic., v.8, p , Liew, F. Y. Negative regulation of toll-like receptormediated immune responses. Nat Rev Immunol, v.5, n.6, p , Liew, F. Y. et al. Disease-associated functions of IL-33: the new kid in the IL- 1 family. Nat Rev Immunol, 2010 (no prelo). MARVIE, P. et al. Interleukin-33 overexpression is associated with liver fibrosis in mice and humans. J. Cell Mol Med Rang, H. P.; DALE, M. M.; RITTER, J. M. Farmacologia. 6 ed. Ed.Guanabara Koogan, Schmitz, J. et al. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines. Immunity, v.23, n.05, p , Xu, D. et al. Selective expression and functions of interleukin 18 receptor on T helper (Th) type 1 but not Th2 cells. J Exp Med, v.188, n.08, p , 1998.

5 Yin, H. et al. Pretreatment with soluble ST2 reduces warm hepatic ischemia/reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications, 351, , 2000.