ESTUDO FITOQUÍMICO DA ESPECIE VEGETAL Arrabidaea chica Wannigleice de Sousa AMORIM (IC) 1 ; Luziane da Cunha BORGES (IC) 1 ; Geyse do Carmo Diniz SAMPAIO (PG) 2 ; Sonia das Graças Santa Rosa PAMPLONA (PG) 2 ; Milton Nascimento da SILVA (PQ) 3 1 Universidade Federal do Pará/Faculdade de Química/Química Industrial, (Bolsistas PIBIC/CNPq), Wanniamorim26@gmail.com 2 Universidade Federal do Pará/Faculdade de Química/Pós-graduação em Química, 3 Universidade Federal do Pará/Faculdade de Química/Pesquisador-CNPq/UFPA, Orientador, yumilton@yahoo.com.br 1- RESUMO Arrabidaea chica Verlot é uma planta trepadeira, com flores róseas ou violáceas, as folhas submetidas à fermentação fornecem um corante vermelho-tijolo, sua composição química mostra saponinas, quininos, taninos, flavonoides, alcaloides, etc, considerando às suas atividades biológicas, como anti-inflamatória e de cicatrização de feridas (Teran, 1997). Considerando a composição química da mesma, o projeto propôs realizar um estudo fitoquímico das folhas da planta. A coleta foi realizada na Embrapa Amazônia Oriental, o material foi seco, triturado, macerado com etanol em duas bateladas de 24 horas, concentrado em evaporador rotativo e submetido à Cromatografia em Coluna de sílica gel por via úmida do extrato etanólico, as frações foram coletadas e submetidas à análise em HPLC analítico. A fração escolhida foi a fração AcOEt 100%, devido ter menor complexidade nas substâncias, com isso, iniciou-se o desenvolvimento do método para o isolamento das mesmas. Palavras chaves: Arrabidaea chica, Bignoniaceae, HPLC. 2- INTRODUÇÃO A Flora Amazônica é considerada a maior reserva de biodiversidade do planeta, com poucas espécies de plantas estudadas de forma científica. Diante deste universo de etnoconhecimento botânico, é possível a busca de novas drogas com o estudo de plantas de uso popular consagrado para certa finalidade (Agra et al., 2008; Bertucci et al., 2008; Marliére et al., 2008; Veiga-Junior, 2008; Jesus et al., 2009; Leitão et al., 2009; Santos et al., 2009). A família Bignoniaceae reúne aproximadamente 78 gêneros e 832 espécies geralmente tropicais espontâneas da América do Sul, incluindo árvores, lianas, arbustos e raramente ervas. Em levantamento etnofarmacológico realizado na região Amazônica, algumas espécies dessa família mostraram-se amplamente utilizadas com fins medicinais entre elas estão a Arrabidaea chica (HKB) Verlot e Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry (TAKEMURA et al 1995). Apresenta dois grandes centros de distribuição geográfica, o 1 675
Brasil e o continente Africano, observa-se que o Brasil é, provavelmente, a região onde a família apresenta-se com o maior número de espécies, ocorrendo desde a Amazônia até o Rio Grande do Sul, não possuindo um habitat único (PAULETTI et al., 2003). Na espécie Arrabidaea chica, há identificado vários pigmentos como a bixina, genipina e derivados da cajurina, que produzindo um corante vermelho-escuro servem para tingir toda variedade de fibras artesanais, sendo supostamente eficazes contra dermatoses e impinges (CORREA, 1984, TAYLOR 1998, MORS 2000) e são comumente utilizados pelos indígenas da Amazônia na sua pintura corporal, para tingir seus enfeites, utensílios e vestuários, bem como para tatuagem, na arte, magia e até como método profilático contra picada de mosquitos e como protetor solar. Os estudos químicos demonstraram presença de fitosteróis, flavonóides e pigmentos utilizados em cosméticos como: carajurona, carajurina e 3-deoxiantocianidina (ESTRELA, 1995). As propriedades tintoriais dessa planta são devido a dois pigmentos flavônicos: a carajurina, que é o pigmento principal e a carajurona (GRENARD et al.,1987). É uma planta trepadeira com atributos ornamentais, é amplamente utilizada na medicina caseira, principalmente na região Amazônica é usada como anti-inflamatória, antimicrobiana (TAYLOR, 1998), além de um agente adstringente, sendo seu extrato usado na cosmética em forma de sabonete cremoso produzindo um efeito anti-acne (TAKEMURA,1995) e atividade antifúngica (BARBOSA & QUIGNARD,1998). A espécie Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl., Bignoniaceae, é conhecida popularmente como cajuru, carajirú, crajirú, cipó-pau, pariri, cipó-cruz (Cronquist, 1988; Grenand et al., 1987; Pauletti et al., 2003). 3- OBJETIVOS 3-1- Geral Realizar o estudo fitoquímico da espécie Arrabidaea chica e avaliar o perfil químico utilizando técnicas cromatográficas de Alta Eficiência. 3-2- Específicos Isolar e identificar as substâncias presentes nas folhas de Arrabidaea chica, utilizando técnicas cromatográficas clássicas e de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência no modo preparativo; Avaliar a atividade biológica da espécie. 2 676
4- MATERIAIS E MÉTODOS Nas separações cromatográficas em coluna, foi utilizada como adsorvente sílica gel (60-200 µm) da SilicaFlash G60. Balança analítica SHIMADZU, AY220. Percolador. Evaporador Rotativo Buchi. Solventes TEDIA: Hexano, Metanol, Acetato de etila, Acetonitrila todos ACS. Papel de filtro analítico. Técnica Cromatográfica: Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) em cromatoplacas medindo 5x5 cm. Revelador utilizado: Ácido Sulfúrico. Cromatógrafo Líquido Shimadzu LC-10 (analítico) e LC-6 (preparativo). 5- PREPARO DO EXTRATO ETANÓLICO As folhas foram coletadas na Embrapa Amazônia Oriental. As mesmas foram colocadas para secar em estufa de circulação de ar à 45º C por cinco dias, em seguida foram trituradas em um liquidificador, totalizando 360 g de material botânico seco e triturado, logo após foi colocado no percolador por 24 horas e submetido a duas extrações, por maceração, com etanol (2Lx2), seguido de filtração e evaporação do solvente em evaporador rotativo. Obteve-se 36 g de extrato etanólico bruto resultante das duas bateladas. Em seguida o extrato foi submetido a um fracionamento em coluna cromatográfica de sílica gel, na coluna utilizou-se 180 g de sílica, para uma altura de 11 cm, com diâmetro de 7,4 cm. A fase móvel foi constituída por Hexano (HEX), acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH), empregados em modo crescente de polaridade, iniciando com um sistema de Hex/AcOEt 10% (1), Hex/AcOEt 30% (2), Hex/AcOEt 50% (3), AcOEt 100% (4), AcOEt/ MeOH 20% (5), MEOH 100% (6). 3 677
Folhas de A. chica M= 360 g Hex/AcOEt 10% (1) 1,6123g Hex/AcOEt 30% (2) 2,1878 g Hex/AcOEt 50% (3) 1,5644 g AcOEt 100% (4) 1,644 g AcOEt/MeOH 20% (5) 12,2324 g MeOH 100% (6) 15,145 g As frações 2, 3, 4, 5 e 6 foram analisadas por HPLC analítico e a fração escolhida para dar prosseguimento ao trabalho foi a fração AcOEt 100% (4), devido ter menor complexidade nas substâncias. A fração AcOEt 100% com um rendimento de 1,6g, foi submetida a um refracionamento por CCVU, usando Hexano, Acetato de Etila e Metanol como eluentes. Deste processo obteve-se 83 frações, de Hex/AcOEt 10% à AcOEt/MeOH 20%, das quais as frações 1 a 14 foram descartadas, as frações 15 a 23 continuam em frascos separados, as frações 24-26; 27-34; 35-36; 37-41; 47-57; 58-65 e 66-73, foram reunidas e o restante também continuam em frascos separados. AcOEt 100% (4) 1,644 g Fração 27-34 154 mg S2 S1 A técnica de escolha para o pré-tratamento das frações foi a Extração por Fase Sólida (SPE). O método utilizado consistiu em um cartucho C18 previamente condicionado com 4 678
1,0 ml de acetonitrila e 1,0 ml de água ultrapura, depois, a este foi adicionada uma alíquota de 10 mg do extrato dissolvidos em uma solução de 800 µl de ACN sonicado por um minuto e mais 200 µl de H2O sonicado também por um minuto (20:80), os analitos de interesse eluiram com a solução, quanto aos interferentes, permaneceram retidos na C18. Desta solução foram injetados 20 µl em um cromatógrafo líquido para se dar início ao desenvolvimento do método de isolamento das substâncias por HPLC. 6- RESULTADOS E DISCUSSÃO O isolamento das substâncias presente na fração 27-34 foi realizado em um cromatógrafo líquido, utilizando como fase estacionária uma coluna semi-preparativa Gemini C18, 5 µm, (250 x 10 mm) com fluxo de 4,7 ml/ min. Como fase móvel, utilizouse misturas dos solventes H2O/ACN (90:10 v/v), para as substancias S1 e S2 empregouse o mesmo método de isolamento, para a substancia que não obteve uma pureza aceitável, a mesma se encontra em processo de purificação. CROMATOGRAMA DA FRAÇÃO AcOEt 100%. mau Ch1-319nm,4nm (1.00) 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0-5 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min Condição cromatográfica Coluna Gemini C18 250 x 4.60 mm 5 μm 110A. Fase móvel composta por H2O/ACN variando de 5 a 100% em um tempo de 60 minutos, em modo linear e vazão de 1 ml/min. Detecção de UV, = 319 nm. CROMATOGRAMAS DAS SUBSTANCIAS ESPECTROS DE RMN DE 1 H. ISOLADAS E SEUS RESPECTIVOS 5 679
mau Ch1-215nm,4nm (1.00) 3000 2500 2000 1500 5.304/1552501 S1 1000 500 0 4.234/75513 4.489/130927-500 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min Condição cromatográfica Coluna Gemini C18 (250 x 4.60 mm), 5 μm, 110A. Fase móvel composta por H2O/ACN (90:10 v/v) em modo isocrático e vazão de 1 ml/min. Detecção de UV, = 215 nm. Espectro de RMN de 1 H da substancia isolada S1. 6 680
400 350 300 mau Ch1-400nm,4nm (1.00) 13.303/374756 S2 250 200 150 100 50 0-50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min Condição cromatográfica Coluna Gemini C18 (250 x 4.60 mm), 5 μm, 110A. Fase móvel composta por H2O/ACN (90:10 v/v) em modo isocrático e vazão de 1 ml/min. Detecção de UV, = 400 nm. Espectro de RMN de 1 H da substância isolada S2. 7- CONCLUSÃO Na investigação química das folhas de A. Chica foram isoladas duas substancias, as mesmas foram isoladas via HPLC em escala semi-preparativa. A determinação 7 681
estrutural das substâncias ainda se encontra em processo de análise, e será feita com base na análise dos dados espectrométricos de RMN de 1 H, 13 C, HETCOR, HMBC, DEPT e COSY e por comparação com informações encontradas na literatura. 8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS RIBEIRO, C. M. Avaliação da atividade antimicrobiana de plantas utilizadas na medicina popular da Amazônia. Dissertação de mestrado, 2008. TAFFARELLO, D. Extrato de Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl) Verlot obtidos por processos biotecnológicos: otimização da extração e avaliação farmacológica. Dissertação de mestrado, 2008. RIBEIRO, J. F. A. Investigação fitoquímica biomonitorada da tintura 70ºgl de Arrabidaea chica Humb. & Bompl.Verlot. Dissertação de mestrado, 2011. SOUZA, A. S. D.; PAGADIGORRIA, C. L. S.; ISHII-IWAMOTO, E.L.; BRACHT, A.; CORTEZ, D. A. G.; AND YAMAMOTO, N. S. Effects of the Arrabidaea chica extract on energy metabolism in the rat liver, Pharmaceutical Biology, 2009. SCHIOZER, A. L.; CABRAL, E. C.; GODOY, L. A. F. D.; CHAVES, F, C. M.; POPPI, R. J.; RIVEROS, J. M.; EBERLIN, M. N.; AND BARATA, L. E. S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry Fingerprinting of Extracts of the Leaves of Arrabidaea chica, J. Braz. Chem. Soc., Vol. 23, No. 3, 409-414, 2012. BARBOSA, W. L. R.; PINTO, L. D. N.; QUIGNARD, E.; VIEIRA, J. M. D. S.; JR, J. O. C. S.; ALBUQUERQUE, S. Arrabidaea chica (HBK) Verlot: phytochemical approach, antifungal and trypanocidal activities, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 2008. PAULA, J. T.; PAVIANI, L. C.; FOGLIO, M. A.; SOUSA, I. M.O.; DUARTE, G. H.B.; JORGE, M. P.; EBERLIN, M. N.; CABRAL, F. A. Extraction of anthocyanins and luteolin from Arrabidaea chica by sequential extraction in fixed bed using supercritical CO2, etanol and water as solventes, The Journal of Supercritical Fluids, 2014. ALVES, M. S. M.; MENDES, P. C.; VIEIRA, J. G. D. P.; OZELA, E.F.; BARBOSA, W. L. R.; JÚNIOR, J. O. C. S. Análise farmacognóstica das folhas de Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B.Verlt, Bignoniaceae, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 2008. MAFIOLETI, L.; JUNIOR, I. F. D. S.; COLODEL, E. M.; FLACH, A.; MARTINS, D. T. D. O. Evaluation of the toxicity and antimicrobial activity of hydroethanolic extract of Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl, Journal of Ethnopharmacology, 2013. 8 682
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