MANUAL DE AULA PRÁTICA PARASITOLOGIA CLÍNICA

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1 CURSO DE FARMÁCIA DISCIPLINA DE PARASITOLOGIA CLÍNICA MANUAL DE AULA PRÁTICA PARASITOLOGIA CLÍNICA Profª. Ma. Maria de Fátima Lino Coelho Poços de Caldas/MG 2016

2 2 SUMÁRIO 1. NORMAS DE BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA CLÍNICA CONTROLE DE QUALIDADE AMOSTRA BIOLÓGICA FEZES EXAME FÍSICO DAS FEZES MÉTODOS COPROLÓGICOS 5.1. Método de Lutz, Hoffman, Pons e Janer Método de Blagg e cols ou MIFc Método de Ritchie ou Formol-éter Método de Willis Método de Faust e cols Método de Baerman-Moraes Método de Rugai e cols Método de Grahan ou fita gomada Método de kato-katz Método de Identificação de proglotes pelo Ácido Acético Método de coloração pela hematoxilina ANÁLISE MICROSCÓPICA DAS FEZES PESQUISA DE CARBOIDRATOS SUBSTÂNCIAS REDUTORAS PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES PESQUISA DE GORDURA NAS FEZES PESQUISA DE LEUCÓCITOS NAS FEZES EXAME PARASITOLÓGICO DE SANGUE...29 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...31 ANEXOS...33

3 3 NORMAS DE BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA O padrão para a redução da exposição do trabalhador a patógenos baseia-se na adoção de precauções gerais como um método de controle de infecção: I - Devem ser usadas luvas e avental quando se manipulam fezes ou outras amostras II - As mãos devem ser lavadas com sabão neutro e álcool a 70% ao entrar no laboratório e após a retirada das luvas III As vestes de laboratório não devem ser usadas fora dele IV Não ingerir nenhum tipo de alimento dentro do laboratório V - Evitar tocar o rosto com as mãos, e não colocar objetos de uso pessoal, como óculos ou livros, sobre a bancada de trabalho. VI - Deve-se tomar cuidado para deixar toda a área de trabalho limpa. A bancada de trabalho deve ser limpa com desinfetante ou uma solução de hipoclorito a 1% antes e depois do trabalho; a) todos os materiais contaminados devem ser imediatamente colocados em desinfetante ou recipiente adequado para descarte; b) derramamentos devem ser cobertos e desinfetados, utilizando desinfetantes próprios (ex: solução de hipoclorito a 1%). MICROSCÓPIO Aparelho utilizado para visualizar estruturas minúsculas como as células. Na parasitologia utilizamos este instrumento para pesquisa e diagnóstico de formas parasitárias como: ovos, larvas, oocistos, cistos e trofozoítos. Mas na nossa rotina laboratorial devemos ter alguns cuidados com este instrumento de trabalho: Partes de um microscópio: Ajuste grosseiro ou macrométrico: controle que ajusta a posição das objetivas do microscópio; usado para focar inicialmente o microscópio. Ajuste fino ou micrométrico: controle que ajusta a posição das objetivas; usado para o foco preciso do objeto depois de ter sido focado com o micrométrico. Ocular: lente de aumento que está mais próxima do olho do examinador. O aumento usual é de 10 vezes (10 x). Objetiva: lente de aumento que está mais próxima do objeto a ser examinado no microscópio. A objetiva pode ser de pequeno aumento (10 x), objetiva de grande aumento (40,43 ou 45 x) e a objetiva de imersão a óleo (95, 97 ou 100 x). Condensador: localizado abaixo da platina do microscópio que direciona a luz para a objetiva se for baixado ou elevado. Baixando o condensador vai haver um aumento de espécimes não corados. Diafragma: regula a quantidade de luz que chega ao espécime examinado no microscópio.

4 4 Distância de trabalho: é a distância entre a objetiva e a lâmina quando o objeto está em foco bem nítido. Quanto maior o aumento, menor à distância. O macrométrico não deve ser usado quando se usa o maior aumento, para evitar que a objetiva acidentalmente bata na lâmina e esta seja danificada. Precauções Use o ajuste macrométrico somente com objetivas de pequeno aumento. Use o óleo de imersão sempre que usar a lente de imersão. Use o óleo de imersão somente com lente de imersão. Limpe as oculares e objetivas após o uso. Sempre baixar a luz antes de desligar o microscópio. Para carregar o microscópio, segure com uma mão o braço do microscópio e com outra a base. Evite vibrações e batidas no microscópio. Guarde o microscópio coberto com uma capa para protegê-lo do pó. CONTROLE DE QUALIDADE EM PARASITOLOGIA CLÍNICA 1. Preparação adequada, armazenamento e preservação dos espécimes submetidos ao diagnóstico 2. Avaliação permanente dos reativos e regentes 3. Monitoramento do equipamento 4. Correta supervisão e treinamento periódico da equipe técnica 5. Uso de manuais de procedimentos, revistas específicas e referências bibliográficas GARANTIA DE QUALIDADE: programa em que todas as atividades realizadas pelo laboratório são diretamente conduzidas no sentido de assegura a qualidade de todo o processo As boas Práticas de Laboratório (BPL) normas que disciplinam a organização, funcionamento e as condições sob as quais os exames são planejados, registrados, liberados e como as amostras são preservadas e descartadas e os resultados arquivados. esses processos incluem atividades préanalíticas, analíticas e pós-analíticas. ATIVIDADES PRÉ-ANALÍTICAS: Treinamento do Pessoal Técnico Preparação do paciente Coleta da amostra Qualidade e Volume das amostras Transporte e Identificação das Amostras ATIVIDADES ANALÍTICAS: Procedimentos técnicos: manual com descrição das técnicas Incluídas expressões de CQ e testes de proficiência plano de ação corretiva.

5 5 Manutenção preventiva e calibração do equipamento ATIVIDADES PÓS- ANALÍTICAS: Transmissão de Informações verbais, escritas ou através de meios eletrônicos do laboratório ao clínico. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO - Baseado em normas rígidas de padronização da metodologia. - Estudos duplo cego, no qual, 1 em cada 10 amostras são divididas em 2 outras amostras, que serão analisadas pelos técnicos, sem que eles saibam de que se trata da mesma amostra. Os resultados destes testes, analisados pelo pessoal do CQ, devem ser idênticos - Controlar o corante após nova preparação e anotar o período de validade desse no rótulo - Controlar semanalmente os métodos de coloração permanente com amostras positivas e registrar todos os resultados de CQ. - Amostras positivas não disponíveis, usar fezes contendo células epiteliais ou pus - Controlar, no momento do uso e periodicamente, para qualidade na coloração, os corantes para parasitos do sangue; - Introduzir, previamente, espécimes identificados como amostras positivas para estimar a performance total do laboratório de Parasitologia. CONTROLE DE QUALIDADE EXTERNO Programa básico: possui parâmetro mínimos para que o Laboratório clínico possa avaliar sua qualidade analítica, assim como, credenciar-se a uma acreditação do seu sistema de qualidade, com as especialidades e seus respectivos analitos. - Parasitologia Básica: identificação de protozoários e helmintos intestinais Programa avançado: constituído pelo programa básico e por outras especialidade que completam as análises realizadas no Laboratório clínico de maior porte e complexidade. Inclui todas as amostras-controle disponíveis no PNCQ, nas especialidade e análise respectivamente. - Pesquisa de Sangue Oculto: amostra de uma mistura representando o material biológico, para pesquisa direta do sangue 1. O controle Externo da Qualidade ou ensaio de Proficiência PRO-EX é constituído de uma série de amostras-controle que o PNCQ envia aos Laboratórios Participantes, mensalmente como ensaio de Proficiência, de acordo com os termos contratuais, para que eles venham a conhecer a sua precisão e exatidão. 2. Estas amostras-controle são enviadas via Sedex aos laboratórios participantes dentro do KIT CONTROLE PNCQ, mas as respectivas planilhas para o envio dos resultados estão disponíveis na internet,no site do PNCQ.

6 6 3. Para as determinações nestas amostras-controle, o Laboratório Participante deve seguir as instruções contidas nas planilhas de resultados e colocar na rotina do laboratório, como se fossem amostras de pacientes. 4. Não trate as amostras-controle de modo especial, use-as como se fossem amostras dos clientes. AMOSTRA BIOLÓGICA - FEZES PARA PARASITOLOGIA BÁSICA: A amostra-controle é constituída de material proveniente de um pool de fezes conservada em formol a 5%, destinada á pesquisa de ovos, cistos e larvas de parasitas humanos, ou então slides, fotografias ou imagens em CD-ROM. Para a execução da metodologia, seguir as instruções contidas nas respectivas planilhas e lançar os resultados encontrados na forma parasitária encontrada. PARA A PESQUISA DE SANGUE OCULTO A amostra-controle é uma mistura sintética representando a amostra biológica e está pronta para uso. RESULTADOS FALSOS POSITIVOS E NEGATIVOS - Falso positivos e negativos, podem ocorrer quando os técnicos são mal qualificados - Não há padronização metodológica - Má conservação da amostra COPROLOGIA 1. Exame Parasitológico de Fezes: Formas parasitárias a serem pesquisadas e diagnosticadas: - ovos e larvas de helmintos; - trofozoítos, cistos e oocistos de protozoários. 2. IDENTIFICAÇÃO SEGURA E CORRETA DE UM PARASITA: A maioria dos parasitos intestinais é diagnosticada pelo exame de fezes, embora materiais como: urina, escarro, secreções urogenitais, aspirados, tecidos, conteúdo duodenal e espécimes obtidos de biópsia, também são utilizados. Estágios usuais: ovos, larvas de helmintos e trofozoítos, cistos, oocistos e esporos de protozoários. Fragmentos de alimentos, células vegetais, grãos de pólen, leucócitos, células de tecido animal e outros artefatos presentes nas fezes podem assemelhar-se a certas espécies de parasitos. O bolo fecal normal é composto quase exclusivamente de fezes, mas em certas situações pode haver sangue, muco e tecido morto., essas porções de massa fecal evidenciam infecção parasitária. Adultos de Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, proglotes de Taenia spp e Dipylidium caninum podem ser encontrados no bolo fecal sem que a presença de ovos seja identificada. Por esta razão o exame macroscópico deve preceder o microscópico.

7 7 3. COLETA DE MATERIAL: Qualquer evacuação do dia FEZES EMITIDAS ESPONTANEAMENTE Tipo de recipiente, volume, idade da amostra, drogas e compostos químicos devem ser considerados. Cada amostra deve apresentar: nome do paciente, número de identificação, nome do médico, data e horário da coleta, deve vir acompanhada de requisição médica indicando o procedimento laboratorial. Recipiente: limpo e seco, boca larga, capacidade aproximada de 250ml, vedação hermética. Amostra seca na superfície e bordas deve ser rejeitada. As fezes devem ser coletadas diretamente no frasco, ou em urinol, jornal ou papel limpo e transferidas para o recipiente. Pote livre de anti-sépticos, agentes germicidas, gotas de óleo e urina para evitar destruição das formas vegetativas. As fezes excretadas no solo não devem ser usadas, pois larvas de vida livre e outros contaminantes confundem o diagnóstico. Fezes obtidas de privadas (latrinas) não podem ser aproveitadas. Para permitir um exame macro e microscópico- 20 a 30g. Fezes pastosas ou mucosas são indicadas para a preparação de esfregaços corados e porções formadas em técnicas de concentração. Os espécimes fecais nunca devem ser incubadas (37 C) ou congelados antes do exame, exceto para pesquisa de oocistos de Cyclospora cayetanensis. Certos medicamentos e produtos químicos tornam a amostra insatisfatória para a análise. Ex: antidiarréicos, antibióticos, antiácidos, derivados de bismuto e bário, vaselina e óleos minerais. A pesquisa parasitológica dever ser realizada antes de o paciente ser submetido a um exame radiológico, como a administração do contraste de sulfato de bário; essas partículas são substâncias cristalinas e podem destruir os trofozoítos devido à ação abrasiva. A coleta dever ser retardada por um período de 7 a 10 dias. Antibióticos (tetraciclina) afetam a flora intestinal normal e causam diminuição ou ausência temporária dos organismos nas fezes, visto que esses parasitos se alimentam de bactérias intestinais e um diagnóstico seguro não é possível antes de 2 a 3 semanas. Os recipientes com amostras fecais de pacientes com HIV e sua seqüela, a síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA/AIDS) deverão ser protegidos por um invólucro de plástico e identificados com etiqueta vermelha ou HIV positivo AMOSTRAS MÚLTIPLAS: A possibilidade de encontrar organismos aumenta pelo exame de amostras múltiplas em razão: a) da intermitência da passagem de certos parasitos a partir do hospedeiro; b) da distribuição não uniforme de ovos de helmintos; c) dos estágios dos protozoários; d) das limitações das técnicas de diagnóstico. A. lumbricoides, ancilostomideos, T. trichiura = emitem ovos com continuidade. Cistos de E. histolytica = oscilações diárias e com picos cíclicos, 7 a 10 dias. Cistos de G. lamblia =

8 8 intermitência com intervalos de 2 a 3 dias para 7, 8 ou mais dias. Produção de ovos também é irregular, gênero Schistosoma, proglotes das Taenia passam por interrupções (2 a 3). Procedimento aconselhável é coletar em dias separados, uma série de 3 espécimes em não mais de 10 dias ou uma série de 6 amostra em dias alternados dentro de 14 dias. Fezes emitidas espontaneamente apresentam uma probabilidade maior de conter cistos, os quais podem ser identificados com maior confiabilidade do que os trofozoítos. Alguns autores recomendam a coleta de 3 amostras (2 evacuações normais e a 3ª após um laxante).após tratamento deverão ser coletadas 3 amostras; protozoários: 3 a 4 semanas após o tratamento. Helmintos: 1 a 2 semanas, tênias; 5 a 6 semanas FEZES EMITIDAS ATRAVÉS DE LAXANTES: A. Objetivo: Fezes liquefeitas (administração de laxantes) estabelecer e confirmar diagnóstico de amebíase, giardíase e estrongiloidíase. B. Indicação: (solicitação médica) série de exames negativos pesquisa-se ovos, larvas, cistos e trofozoítos. C. Laxantes indicados: laxantes salinos: fosfato de sódio e sulfato de sódio menos danos morfológicos aos parasitas. *OBS: Não são indicados óleos minerais alterações nos parasitas. D. Procedimento: Fezes induzidas por laxantes coletar todo o bolo fecal envio imediato ao laboratório; caso contrário uma fração da amostra em PVA. E. Prática do uso de laxantes: Indicada para clínicas e hospitais onde as amostras fecais são recebidas pelo laboratório imediatamente após a coleta. 4. ESTABILIDADE DAS AMOSTRAS: Desde que os trofozoítos não se multiplicam ou se encistam fora do corpo humano, eles morrem e se degeneram após a excreção das fezes. O tempo recomendado para os espécimes líquidos (30 ); pastosas (1h); sólidas (24h). 5. PRESERVAÇÃO: (amostras fecais não enviadas imediatamente ao laboratório). Os espécimes não preservados podem temporariamente refrigerados (3 a 5 C) em recipientes hermeticamente fechados. Nessas temperaturas ovos, larvas, cistos mantêm-se viáveis vários dias, enquanto larvas de S stercoralis e Ancilostomídeos poderão sofrer alterações morfológicas. Preservação permanente de trofozoítos, cistos, ovos e larvas: formalina, mertiolato-iodoformaldeído (MIF), acetato de sódio-ácido acético-formaldeído (SAF), álcool polivinílico (fixador APV), líquido de Schaudinn e fenol-etilico-formaldeído (PAF) 6. OUTRAS AMOSTRAS: *Enteroparasitas diagnóstico pelo exame das fezes. *Outras amostras: urina, escarro, secreções urogenitais, raspados anais, aspiradores de abscessos, conteúdo duodenal favorecem o diagnóstico de vários parasitas.

9 9 6.1 Urina: Diagnóstico de infecções por T. vaginalis (urina recente e 1ª micção matinal). 6.2 Escarro: estágios de larvas de A. lumbricoides, S. stercoralis e de Ancilostomideos, protozoários como E. histolytica e o organismo parasita P. carinii. O escarro é examinado a fresco com solução de iodo Secreção Urogenital: T. vaginalis secreção urogenital do homem e da mulher Swab Anal: E. vermiculares ovos depositados na região perianal nas fezes: os ovos são detectados em não mais de 5% dos indivíduos infectados Aspirados de Abscessos: Abscessos pulmonares: P. carinii, E. histolytica. Abscessos hepáticos: E. histolytica. Aspiração do líquido hidático: no momento da cirurgia para a extirpação do cisto (hidátide). Material de gânglios linfáticos, baço, fígado e LCR: T. cruzi (doenças de chagas) Conteúdo Duodenal: Recuperar e diagnosticar larvas de S. stercoralis, protozoários como G. lamblia. EXAME FÍSICO DAS FEZES COMPOSIÇÃO DAS FEZES: 75% de água. 25% de material sólido: 30% de bactérias; 0-20% gorduras; 02-03% proteínas. e 30% de resíduos não digeridos. COR: Castanha Parda - NORMAL Esverdeada - VERDURAS / T. I.. Amarelada - LÁCTEA. Preto - esverdeada - FERRO. Negra - BISMUTO / Sg. Digerido. Descoradas - AUSÊNCIA DE ESTERCOBILINA. Avermelhadas - SG. NÃO DIGERIDO. ODOR: Produto de Ação Bacteriana. Patológico: - Rançoso ou butírico. Pútrido. ASPECTO: Normais - pastosa, homogênea e fina.

10 10 CONSISTÊNCIA: Normais - sólidas = 75% de água. Moles = 80% de água. Líquidas = 90% de água. REAÇÃO DE ph: Normal : 6,9 a 7,2 VISCOSIDADE: Teor de Muco. Patológico - Pouco viscoso = fermentação intestinal. Viscosas = colite. VOLUME: Dieta normal a 150g / 24hs. Dieta abundante - 250g / 24hs. Fermentação intestinal - 800g / 24hs. Constipação - Volume diminui. EXAME MACROSCÓPICO. Elementos Anormais: Muco: inflamações ou irritações. Pequenas estrias = colites. Filamentos maiores = colite mucomembranosa. Sangue - vias altas = col. Negra. Vias baixas = col. Vermelha. Pus - associado ao muco e sangue. Coloração acinzentada. Parasitos - Áscaris lumbricóides, Enterobius vermicularis e proglotes de Taenia sp. RESÍDUOS ALIMENTARES: Tecido Conjuntivo-feixes filamentosos = Insuf. Gástrica. Esvaziamento rápido do estômago. Fibras Musculares - fragmentos de carne = Insuf. Pancreática. Transito Intestinal acelerado (TIA) Gorduras - ingestão excessiva de gorduras, T.I.A e sindrome da má digestão. Areia intestinal - fragmentos de Ca ou fosfato de Mg e Ca associados a células vegetais. Falsa areia intestinal - frutas = maçã, banana e alguns vegetais Fragmentos de Pólipos - raro, identificação através de exame histológico. Corpos estranhos. EXAME MICROSCÓPICO. Fibras Musculares - amarelo ou alaranjado. Mal - digeridas = cilindros alongados de arestas agudas e estrias longitudinais e transversais bem nítidas. Pouco digeridas = corpos retangulares de arestas agudas e estrias longitudinais e transversais. Bem digeridas =oval ou em faixas amarelas, sem estrias

11 11 Tecido conjuntivo - filamentos alongados, ou de fibras isoladas sinuosas e refringentes. Gorduras - anormal = esteatorréia da insuficiência pancreática, biliar ou problemas de absorção. Neutras = peq. gotículas coradas pela bile, refringentes (ausência de Lipase). Ác. Graxos = finas agulhas longas. Aquecendo a lâmina, os cristais dissolvem e ficam semelhante às gorduras neutras.(insuf. Biliar). Sabões = fácil reconhecimento. Mg são os mais típicos- círculos concêntricos. Sindrome de má absorção. RESIDUOS ALIMENTARES DE ORIGEM VEGETAL. AMIDO: Intracelular - interior das células. Amorfo - faixas isoladas, às vezes tapetadas de bactérias iodófilas. Cru - pão, frutas e outros alimentos sob a forma de grãos organizados por camadas concêntricas ou massas amorfas. CELULOSE - Digestível = várias formas. Maior quantidade = Trânsito cólico acelerado. Não digestível = cutícula de cereais, pelos de vegetais, grãos de pólen, esporos. CRISTAIS - Ácidos Graxos gordura. Fosfato Amoníaco Magnesiano = Insuficiência digestiva. Fezes alcalinas. Oxalato de cálcio = extracelular - ferm. de coli + Ác. Oxálico. Intracelular - falta de HCl. Charcot-Leyden = cristalização de uma proteína derivada do eosinófilo e basófilo. SUBSTÂNCIAS DE ORIGEM INTESTINAL. HEMÁCIAS. LEUCÓCITOS = úlcera, câncer de cólon de cólon, colites,disenterias amebianas. T.I.A. CÉLULAS EPITELIAIS 7. MÉTODOS E TÉCNICAS: 7.1. MÉTODOS: Envolvem procedimentos diretos. Ex: Exame direto a fresco para a pesquisa de ovos, larvas e cistos nas fezes TÉCNICAS: Incluem condutas, reagentes e instrumentos. Ex: Sedimentação espontânea. OBJETIVO DAS TÉCNICAS: 1ª) Concentração ou enriquecimento: aumentar o número de cistos, ovos ou larvas; 2ª) Eliminar a maioria dos detritos fecais 3ª) Apresentar os organismos em estado inalterado.

12 12 TIPOS DE TÉCNICAS: - FLUTAÇÃO: -FLUTUAÇÃO SIMPLES e CENTRIFUGO FLUTAÇÃO. - SEDIMENTAÇÃO: - SEDIMENTAÇÃO SIMPLES e CENTRÍFUGO SEDIMENTAÇÃO. - TÉCNICAS DE FLUTUAÇÃO: Princípio: Baseia-se na diferença de densidade específica entre os ovos de helmintos, cistos de protozoários e o material fecal, a fim de que esses organismos flutuem na superfície dos reagentes (reagentes de alta densidade). Vantagens: formação na superfície do tubo de uma membrana clara com poucos detritos fecais e a remoção seletiva de ovos e cistos, mesmo quando em pequeno número no bolo fecal. Desvantagens: Alta densidade dos reagentes alteração na parede dos ovos e dos cistos dificultando a identificação exame dentro de 10 a 20 minutos. Técnicas de flutuação mais usadas: - solução saturada de NaCl (WILLIS); - sulfato de zinco (Faust) - TÉCNICAS DE SEDIMENTAÇÃO: Princípio: Os organismos são sedimentados pela gravidade ou centrifugação. Apresenta uma ação inversa à flutuação: os cistos, ovos e larvas são retidos no fundo do tubo, enquanto os detritos são suspensos para a superfície, não interferindo no diagnóstico. Objetivos: Aumento do número de ovos operculados, larvas ou cistos, e a separação das gorduras da maioria dos detritos. Desvantagens: Grande quantidade de detritos fecais no sedimento identificação dos parasitas mais difícil do que pelas técnicas de flutuação. Técnicas de sedimentação mais usadas: - Lutz (água corrente); -Hoffman, Pons & Janer (HPJ) (água corrente); -Ritchie (formalina éter); - Blagg (mertiolato-iodo formaldeído) (MIF)... *OBS: Recomenda-se o uso conjunto das técnicas de flutuação e sedimentação na rotina laboratorial conduta impraticável para a maioria dos laboratórios. 8. PREPARAÇÃO E EXAME DE AMOSTRAS FECAIS: 8.1. EXAME MACROSCÓPICO: Amostras fecais não preservadas exame macroscópico determinar: consistência, odor, cor, presença ou ausência de sangue, muco, proglotes e vermes adultos. *OBS: Exame macroscópico antecede exame microscópico. Material fecal varia quanto a sua consistência e é classificada em: - Fezes formadas. - Semiformadas. - Pastosas. - Líquidas (diarréia).

13 13 Estágios morfológicos de enteroparasitas em relação às varias categorias de consistência das fezes: - Trofozoítas de protozoários fezes líquidas, pastosas ou nas mucossanguinoletas. - Cistos de protozoários fezes formadas ou semiformadas. - Ovos e larvas de helmintos todos os tipos de amostras fecais. *OBS: Formas trofozoíticas degeneram mais rapidamente do que as formas císticas amostras fecais líquidas ou pastosas devem ser examinadas o mais rápido possível. (1ª amostras líquidas ou pastosas 2ª amostras semiformada ou formadas). - Amostras fecais e relação clínica: Presença de sangue e muco manifestações patológicas do trato gastrointestinal. Sangue oculto infecção parasitária ou outras condições anormais. Fezes com colorações variadas ingestão de diferentes produtos químicos, medicamentos ou alimentos. * verduras ricas em clorofila- fezes esverdeadas. * dieta láctea- coloração amarelada. * sais de ferro preto esverdeado. Realização do exame macroscópico: A. Simples observação: Examinar e revolver com bastão de vidro todo o material fecal evacuado anotar as características coletar vermes adultos ou proglotes de tênias desejadas. B. Tamização: Emulsionar as fezes com água. Coar a emulsão através de peneira metálica- pia com jato fraco de água corrente. vantagens: demonstração e coleta de vermes adultos (pequenos helmintos), proglotes e escólices. * OBS: Poderão ser encontrados helmintos adultos nas amostras fecais e ausência dos ovos EXAME MICROSCÓPICO: A. Método Direto: esfregaços a fresco mais usado na rotina do laboratório- permite visualizar: protozoários (trofozoítas e cistos) e helmintos (ovos, larvas e pequenos adultos). B. Técnicas de Concentração: obtenção de melhores resultados. C. Exame Microscópico das fezes evidência: - Elementos fecais normais. - Ovos, larvas e pequenos adultos de helmintos. - Trofozoítas, cistos e oocistos de protozoários. - Hemácias (raramente encontradas, pois são lisadas com rapidez pelas enzimas digestivas) presença: ulceração ou problemas hemorrágicos. - Leucócitos (neutrófilos): indicativos de inflamação. - Leucócitos (eosinofilos): resposta imune pode ou Ter relação com infecção parasitária. - Outras informações: cristais de oxalato de cálcio, fungos e leveduras, fibras vegetais,etc...

14 14 9. PRECAUÇÕES NO LABORÁTORIO DE PARASITOLOGIA: luvas, avental, cuidados na manipulação, uso de hipoclorito de sódio (bactérias e vírus patogênicos). 10. RESULTADO DO E.P.F.: É qualitativo deve-se usar: Negativo para Helmintos e Protozoários na amostra analisada *OBS: Resultados quantitativos: depende do diagnóstico e da pesquisa. 11. Corante a ser utilizado na rotina do exame parasitológico de fezes: SOLUÇÃO DE LUGOL: Lugol g Iodeto de Potássio KI ,0g Água destilada q.s.p ml 12. Conservantes a serem utilizados na preservação das amostras fecais: Solução de Formaldeído a 5% e 10% (v/v) Formaldeído 37-40% 5ml 10ml Água destilada-deionizada 95ml 90ml Obs: A solução acima permite somente o exame a fresco, não sendo indicada para a preparação de esfregaços corados para identificação de protozoários intestinais. O formaldeído comercial apresenta a concentração de de solução de HCHO, embora para a diluição considera-se 100%. Pode-se também fazer a correção.

15 15 MÉTODOS DE EXAMES COPROLÓGICOS São vários os métodos de exames coprológicos descritos na literatura, os quais podem ser qualitativos ou quantitativos, apresentando diferentes sensibilidade na detecção de ovos e larvas de helmintos e cistos de protozoários 1. MÉTODO DE LUTZ OU DE HOFFMAN, PONS E JANER - Sedimentação espontânea OBJETIVO: sedimentação de elementos parasitários em água por ação gravitacional. Ovos e larvas de helmintos. Cistos de protozoários. TÉCNICA: 1 - Dissolver 2 a 5g de fezes em um frasco com 10ml de água, triturar bem com um bastão de vidro. 2 - Filtrar a suspensão para um cálice cônico de 100ml de capacidade, por intermédio de tela metálica ou tecido de nylon com cerca de 80 a 100 malhas/cm 2, ou gaze cirúrgica dobrada 4X. 3 - Os detritos contidos na gaze são lavados com mais 20ml de água. 4 - Completar a solução com água. 5 - Deixar sedimentar de 2 a 24hs. 6 - Com uma pipeta fina, obturada pelo dedo indicador, tocar o fundo cônico do cálice e deixar o sedimento ser parcialmente aspirado pela pipeta. 7 - Colocar o material em uma lâmina de vidro, adicionar lugol, cobrir com lamínula.

16 16 8 Examinar com aumento de 10X e 40X. Observação: MELVIN & BROOKE, (1982) e ASH & ORIHEL (1987) apresentaram a seguinte conduta depois de concluída a etapa 4 (1) decantar com cuidado 2/3 do líquido sobrenadante sem perder nenhuma porção do seguimento; (2) ressuspender o sedimento em água corrente, e deixar a suspensão em repouso por mais 1 h; (3) esse procedimento de lavagem pode ser repetido até o líquido sobrenadante fique relativamente claro. Após seguir as etapas 5 e 6 na técnica acima descrita. 2) MIF (Método de Blagg e cols): fezes conservadas em MIF FUNDAMENTO: centrífugo-sedimentação em um sistema éter-mertiolate. INDICAÇÃO: é indicado na pesquisa de larvas, ovos de helmintos e cistos de protozoários. A técnica á ser desenvolvida é a mesma no formol-éter. 3) MÉTODO DE RITCHIE (Formol-éter) : FUNDAMENTO: centrífugo-sedimentação em sistema formol-éter (a solução de formol-éter a 10% deve ser preparada paralela a execução da técnica). INDICAÇÃO: tem como atributo principal a concentração que realiza de cistos de protozoários, ovos e larvas de helmintos. Esta técnica é também referida como processo pelo formol- éter (sua concentração é superior a técnica de Faust). 01. Preparar uma suspensão de fezes em água de torneira, aproximadamente 2.0 g para 20 ml. Misturar bem. 02. Filtrar através de gaze dobrada, com auxílio de um pequeno funil, para 2 tubos de centrifugação. 03. Centrifugar o filtrado por 60 segundos a 2500 r.p.m 04. Decantar. 05. Adicionar 2 ml de solução de formol a 10% agitar vigorosamente e deixar em repouso por 3 minutos. 06. Adicionar 2 ml de éter comercial ou acetato de etila. Agitar bem e centrifugar por um minuto a 2500 r.p.m.

17 Decantar. Juntar 2 gotas de lugol ao sedimento, agitar e examinar ao microscópio. 4) MÉTODO DE WILLIS: FUNDAMENTO: flutuação de ovos de helmintos e cistos de protozoários em uma solução saturada de NaCl em água a 30%. INDICAÇÃO: é indicado na pesquisa de ovos de helmintos e cistos de protozoários. 01. colocar num pequeno vidro de 3 cm 1 g de fezes, mais ou menos, mistura-las com uma solução de NaCl saturada, de maneira que a superfície do líquido atinja a borda superior do recipiente. 02. Colocar uma lâmina sobre a boca do vidro e deixá-la nesta situação por 20 minutos. 03. Levantar a lâmina, invertendo rapidamente sua posição para evitar a queda dos ovos; examinar sob pequeno aumento todo o material assim obtido. 5) MÉTODO DE FAUST E COLS.: A técnica de Willis (1921) foi modificada por Faust et al. (1939), na qual a solução saturada de cloreto de sódio foi substituída pela solução de sulfato de zinco. OBJETIVO: emprega-se uma solução de Sulfato de Zinco com densidade igual a 1.180g/cm 3 - flutuação dos elementos pesquisados. Cistos de Protozoários; Oocistos de coccídeos; Esporos de microsporídeos e Ovos leves de Helmintos. TÉCNICA: 1. Em um frasco apropriado, efetuar a suspensão de 1 parte de fezes para 10 partes de água.

18 18 2. Filtrar através de tamis metálico (80 a 100malhas/cm 2) ou de gaze dobrada 4X, em um tubo de Wassermann. 3. Centrifugar por 1minuto a 2500rpm. 4. Decantar o sobrenadante, adicionar 2 a 3 ml de água ao sedimento, homogeneizar, juntar em seguida mais água até 1 cm da borda do tubo. 5. Repetir a operação anterior até o sobrenadante se tornar límpido. 6. Depois da última lavagem, despreza-se o sobrenadante, e coloca-se 2 a 3ml de uma solução de sulfato de zinco a 33% com densidade de 1, Centrifugar novamente por 1minuto a 2500rpm. 8. Retirar a película da solução de sulfato de zinco por meio de alça de platina. 9. Corar com lugol. Examinar ao microscópio 10X / 40X. 6) 6)MÉTODO DE BAERMANN MORAES OBJETIVO: Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas que saem do material, migrando para a água quente. Por gravidade se depositam no fundo do funil. Pesquisa de larvas de Helmintos. TÉCNICA: 1. Tomar 8 a 10g de fezes ou terra, colocar em uma gaze dobrada em quatro. 2. Sobre o funil colocar uma tela metálica e em cima desta, depositar as fezes, protegidas pela gaze. 3. Encher o funil com água à temperatura de 44ºC, de modo que as fezes fiquem praticamente submersas. Deixar em repouso por 1h.

19 19 4. Findo este tempo, colher 5 a 7 ml de líquido em vidro de relógio, abrindo-se a pinça que oblitera o tubo de borracha colocada na haste do funil. 5. Examinar em lupa, ou coletar em tubo para centrifugação, centrifugar a 100 r.p.m por 1 min, e examinar o sedimento em microscópio, com ou sem lugol. 7) MÉTODO DE RUGAI E COLS. OBJETIVO: Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas que saem do material, migrando para a água quente. Por gravidade se depositam no fundo do funil. Pesquisa de larvas de Helmintos. TÉCNICA: 1. Tomar 8 a 10g de fezes ou terra. 2. Colocar em uma gaze dobrada em quatro, e fezes - pequena trouxa. 3. Colocar o material assim preparado em um cálice de sedimentação, cheio de água quente (44ºC), até o meio. 4. Deixar 1hora em repouso. 5. Colher no fundo do cálice as larvas existentes, com auxílio de uma pipeta de Pasteur ou canudo. 6. Examinar em lupa ou em microscópio, com ou sem lugol. Obs: Fezes líquidas não são adequadas para método de Baerman-Moraes e Rugai.

20 20 8) MÉTODO DE GRAHAM (OU FITA ADESIVA) OBJETIVO: Ovos de Enterobius vermicularis. TÉCNICA: 1. Corta-se um pedaço de 8 a 10 cm de fita adesiva transparente; 2. Coloca-se a mesma com a parte adesiva para fora, sobre um tubo de ensaio; 3. Afastando os glúteos do paciente, encostar rápida e firmemente a fita adesiva sobre o ânus; 4. Coloca-se a fita sobre uma lâmina de vidro 5. Examinar ao microscópio, 10X / 40X. OBS: Pode-se utilizar 1 a 2 gotas de lugol entre a fita adesiva e a lâmina. - É freqüente o encontro de ovos de Taenia sp., Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e outros. - Outros métodos com papel de celofane não superam a técnica descrita e são menos higiênicos. 9) MÉTODO DE KATO-KATZ E COLS Objetivo diagnóstico e contagem de ovos de S. mansoni, A lumbricóides e T. trichiuris. Amostra Biológica: fezes frescas ou conservadas em MIF ou formol, mas não em fezes diarréicas. TÉCNICA: QUANTITATIVO 1. Colocar sobre um pedaço de papel absorvente, a amostra de fezes a ser examinada; 2. Comprimir a parte superior com um pedaço de tela metálica- 0,09 mm; 3. Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-las, com auxílio da espátula para um cartão retangular, contendo no seu centro um orifício de 6 mm de diâmetro; 4. Após encher completamente o orifício, retirar o cartão cuidadosamente, deixando as fezes sobre a lâmina de vidro;

21 21 5. Cobrir as fezes com lamínula de papel celofane, comprimindo a lâmina, após tê-la invertido, contra uma folha de papel absorvente; 6. Aguardar 1-2 horas e examinar ao microscópio todos os campos; 7. O n de ovos, encontrados no esfregaço fecal, multiplicado por 23, corresponderá ao número de ovos/g de fezes. QUALITATIVO 1. Colocar sobre um pedaço de papel absorvente, a amostra de fezes a ser examinada; 2. Comprimir a parte superior com um pedaço de tela metálica; 3. Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-las, com auxílio do palito, para uma lâmina; 4. Cobrir as fezes com a lamínula de papel celofane, comprimindo a lâmina, após tê-la invertido, contra uma folha de papel absorvente; 5. Deixar a preparação clarificar durante 1 a 2 horas, à temperatura de 34 40ºC ou sob luz artificial, com evaporação da água, ocorre diafanização de material pela glicerina; 6. Examinar integralmente a preparação com aumento de 10x. Solução de verde de malaquita Glicerina...100ml Água destilada...100ml Verde malaquita a 3%... 1ml

22 22 10) IDENTIFICAÇÃO DE PROGLOTES DE TAENIA - MÉTODO PELO ÁCIDO ACÉTICO. 01. Colocar a(s) proglote(s) a ser (em) identificada(s) em pequeno recipiente contendo ácido acético glacial. 02. Decorridos pelo menos 15 minutos, retira-la e comprimi-la entre duas lâminas. 03. Examinar sob iluminação intensa (artificial). 04. Os caracteres do útero e suas ramificações permitirão distinguir se a proglote grávida em exame: T. solium ou T. saginata. 05. Aconselhável utilizar lâminas largas para comprimir as proglotes, como medida de cautela para uma eventual contaminação do examinador, 06. O mecanismo de ação do ácido acético está baseado na dissolução de sais, calcários e carbonato de cálcio que impregnam o corpo do parasita. Taenia saginata: proglotes grávidas: útero com ramificações laterais finas, dicotômicas e numerosas. Taenia solium: proglotes grávidas: útero com ramificações espessas, dendríticas e em pequena quantidade. *OBS.: pelo encontro de ovos de taenia nas fezes não podemos dizer se a espécie é solium ou saginata. RESULTADO: OVOS DE Taenia sp. Somente pelo encontro de proglotes, podemos determinar a espécie, após executar a técnica diferencial. FIXAÇÃO E COLORAÇÃO Mergulhar a preparação em fixador de Raillet e Henry, durante 12 horas ou mais, dependendo das dimensões do helminto. Retirar cuidadosamente o helminto das lâminas e lavá-lo com solução salina. Mergulhar o helminto em Carmim Acético, por determinado tempo, variando de acordo com a espessura do parasita. Tempo varia de 30 até 24 horas. Retirar o excesso do corante, lavando o helminto durante alguns minutos no álcool a 70%. Colocar no álcool clorídrico a 0,5%, para diferenciar. Colocar no álcool 70% minutos. Colocar no álcool 90% minutos. Colocar no álcool absoluto minutos. Creosoto de Faia horas. Montar em bálsamo do Canadá. 11) COLORAÇÃO PELA HEMATOXILINA REAGENTES: Preparo das Soluções: 1 Solução de Sulfato Férrico Amoniacal a 2% (Alúmen de ferro) Sulfato férrico amoniacal % Água destilada-deionizada ml

23 23 Dissolver os cristais violeta de sulfato férrico amoniacal (alúmen de ferro III) em água. Essa solução mordente deve ser preparada fresca imediatamente antes do uso e estocada á temperatura do refrigerador. Preparar uma solução com volume final 300ml 2 Solução Corante de Hematoxilina a 0,5% a) Solução estoque de Hematoxilina a 10% Hematoxilina, forma cristalina g. Álcool etílico a 95% (v/v) ml Preparar uma solução estoque de 300ml b) Solução corante de Hematoxilina a 0,5% Solução estoque de hematoxilina, amadurecida ml. Água destilada-deionizada ml Adicionar água na solução estoque de hematoxilina e misturar. Essa solução diluída a 0,5% não é estável e deve ser preparada diariamente. Preparar uma solução de uso de 500ml FIXADOR DE SCHAUDINN MODIFICADO 1) Solução de Sulfato de Cobre Sulfato de cobre II (5H) g Água destilada-deionizada ml Dissolver o CuSO4.5H2O em água destilada-deionizada quente. Deixar esfriar. Armazenar em recipiente de vidro com tampa esmerilhada. 2) Solução Estoque Solução de sulfato de cobre II ml Álcool etílico a 95% ml Glicerina ml Armazenar até o momento do uso 3) Solução fixadora Solução estoque ml Ácido acético glacial ml Adicionar o ácido acético glacial, imediatamente antes do uso. Coloração pela Hematoxilina Férrica, segundo Heidenhain, modificada por Burrows Objetivo: coloração de rotina de esfregaços fecais para a pesquisa de protozoários intestinais. Técnica:

24 24 1 Fixador de Schaudinn 10minutos 2 - Álcool etílico a 70% iodado 3minutos 3 - Álcool etílico a 70% - 2 minutos 4 Álcool etílico a 50% - 1minuto (pode ser omitido) 5 Álcool destilada 3 a 3 minutos (duas lavagens) 6 - Solução de alúmen de ferro a 2% (mordente) 10 minutos 7 Água destilada 1 minuto 8 - Solução corante de hematoxilina a 0,5% - 5 minutos 9 Água destilada 1 minuto 10 - Solução de alúmen de ferro a 2% (diferenciador) 1 minuto 11 - Água corrente 2 minutos (duas lavagens) 12 - Observar a diferenciação ao microscópio. Se necessário repetir as etapas 10 e 11, deixando tempos maiores Quando o grau de diferenciação desejado é obtido, proceder á etapa seguinte 14 - Água corrente, várias lavagens 30 minutos 15 álcool etílico a 50% - 2 minutos (pode ser omitida) 16 álcool etílico a 70% - 1 minuto 17 álcool etílico a 95% - 1 minuto 18 Álcool etílico absoluto 1 minuto 19 Partes iguais de álcool etílico absoluto e xilol 1 minuto 20 Xilol (2 lavagens) 1 minuto cada 21 - Montagem com resina sintética. Observação: com a finalidade de garantir a melhor fixação, as lamínulas são colocadas na solução de Schaudinn com a face do esfregaço virada para baixo. O fixador de Schaudinn ataca o metal, por isso usam-se pinças de madeira. ANÁLISE MICROSCÓPICA DAS FEZES EXAME DIRETO: Utilizado para a pesquisa de cistos de protozoários e ovos de helmintos. Método pouco sensível, apresentando resultados positivos em infecções intensas. Procedimento: Adicionar solução de lugol ás fezes, preparar a lâmina e observar direto ao microscópio em aumento de 100X e 400X. a) Identificar a lâmina com um lápis de cera; b) Colocar uma gota de salina no centro da metade esquerda da lâmina e uma gota de lugol na metade direita da lâmina; c) Com o auxílio de um abaixador de língua ou um palito, peque uma pequena porção da amostra e misture com a gota de solução salina;

25 25 d) Da mesma forma, misture uma porção de fezes com a solução de lugol; e) Coloque uma lamínula sobre cada uma das gotas, tomando o cuidado para não formar bolhas de ar; f) Percorra todos os campos da lâmina. EXAME LABORATORIAL DAS FEZES ph As fezes são, geralmente, aquosas, ácidas e fermentativas. O ph das fezes está relacionado ao ph da dieta alimentar e com os gases desprendidos durante o processo de putrefação. Normalmente a reação é neutra ou levemente ácida. VARIAÇÃO NORMAL: 6,8 7,2 ph ácido: Predomina a fermentação. É observado na má-absorção de carboidratos, devido a fermentação parcial bacteriana dessas substâncias no intestino delgado. O ph das fezes abaixo de 5,5 é sugestivo, mas a determinação não é válida se o paciente estiver tomando antibióticos orais (pois diminui a flora bacteriana). Em lactentes, o ph varia de 5,0-6,0 (não desenvolveu flora bacteriana) ph alcalino: Predomina a putrefação (liberação de amoníaco) Em crianças entre 3 e 7 dias, o ph é normalmente elevado.

26 26 TÉCNICA: encostar um abaixador de língua ou bastão de vidro nas fezes e sujar uma tira de papel indicador de ph. AVALIAÇÃO DA ABSORÇÃO DE CARBOIDRATOS SUBSTÂNCIAS REDUTORAS Técnica: 1. Colocar uma porção pequena de fezes em um tubo de ensaio; 2. Acrescentar 2 ml de reativo de Benedict; 3. Misturar bem e levar o tubo a um recipiente com água fervente; 4. Ferver por 1 minuto; 5. Observar a alteração de cor. azul ou verde 0 verde com precipitado amarelo + amarelo a oliva ++ marrom +++ alaranjado a vermelho ++++ A reação será positiva para todos os monossacarídeos e dissacarídeos quando estão presentes nas fezes, com exceção da sacarose. PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES A pessoa elimina em torno de 2,0 a 2,5 ml de sangue pelo TGI diariamente. A eliminação de mais de 2,8 ml de sangue nas 24 horas é um sinal importante de hemorragia do TGI. Este teste rastreia úlcera gástrica, carcinoma de cólon, hemorróidas, fissuras, colite ulcerativa, diverticulite, hérnia, além de outras fontes de sangramento oculto. PREPARO DO PACIENTE - Recomenda-se que o paciente consuma uma dieta adequada 4 dias antes da coleta. A dieta deve incluir, preferencialmente, grande quantidade de fibras. Deve-se evitar frutas e vegetais que possuam grande quantidade de peroxidase, como nabo, couve-flor, brócolis, rabanete. O paciente não deve comer cerne vermelha, nem mal passada. Não é recomendada a ingestão de álcool, aspirina ou vitamina C 2 dias antes do exame. FATORES QUE INTERFEREM - Drogas como salicilatos, ferro, esteróides, indometacina, ácido bórico, brometos, iodo, agentes oxidantes; - Vegetais com atividade peroxidase e carne vermelha ou mal cozida; - Não se deve coletar após maratonas e durante o período menstrual. FUNDAMENTO

27 27 A pesquisa de sangue oculto deve ser realizada em material recentemente emitido ao laboratório. A pesquisa é baseada na Reação de Meyer, a qual a fenolftaleína é reduzida pelo zinco para anidro ftálico que, oxidado pela água oxigenada, desprende oxigênio pela ação do sangue, transformando-se novamente em fenolftaleína, assumindo cor vermelha no meio alcalino. METODOLOGIA REAÇÃO DE MEYER-JOHANNESSEN PRINCÍPIO: Fenolftaleína é reduzida pelo Zinco para anidro ftálico, o qual é oxidado pelo oxigênio desprendido do peróxido de hidrogênio pelo sangue, e se transforma novamente em fenolftaleína, assumindo cor vermelha em meio alcalino. REAGENTES: Peróxido de hidrogênio. Reativo de Meyer-Johannessen: Fenolftaleína 2,0g Hidróxido de potássio anidro 20,0g Água destilada q.s.p 100ml Aquecer até a fervura, acrescentando de 10 a 30g de zinco em pó, para obtenção de descoloração completa. Filtrar e guardar em frasco âmbar, com m pouco de zinco em pó, no fundo do frasco. TÉCNICA: Fazer uma suspensão de fezes próximo a 5%. Passar 5 ml para um tubo de ensaio. Juntar 1ml do reativo de Meyer-Johannessen. Inverter várias vezes. Acrescentar 3 a 4 gotas de água oxigenada. INTERPRETAÇÃO: Reação positiva: coloração vermelha IMEDIATA. PESQUISA DE GORDURA NAS FEZES Em uma dieta normal, a gordura nas fezes representa até 20% do total de sólidos. Os lipídios são medidos com ácidos graxos: < 7g/24 h. Este é o teste padrão no diagnóstico da esteatorréia, que apóia o diagnóstico das síndromes de mal absorção. As fezes típicas são espumosas, gordurosas, moles, pastosas e fétidas. IMPLICAÇÕES CLÍNICAS Aumentos da gordura fecal e dos ácidos graxos estão associados à síndrome de mal absorção: - Doença Celíaca (Espru não-tropical); - Doença de Crohn colite ulcerativa

28 28 - Fibrose cística; - Enterite; - Insuficiência pancreática, biliar; - Remoção cirúrgica de uma seção do intestino FATORES QUE INTERFEREM Pode haver aumento da gordura neutra nas seguintes condições não patológicas: - Uso de medicações como bário, bismuto, supositórios e medicações que diminuem a absorção de gorduras; - Ingestão de óleo de rícino ou óleo mineral, maionese dietética de baixa caloria, dieta rica em fibras ou Metamucil; - Período neonatal; - Contaminação com urina; - A amostra aleatória de fezes é de pouco valor diagnóstico. PREPARO DO PACIENTE O ideal é coletar amostras durante 48 a 72 horas. O paciente deve fazer uma dieta de 60 a 100g de gorduras, 100g de proteínas e 180 g de carboidratos, por 6 dias antes e durante a coleta. Após a coleta, o paciente deve seguir dieta normal. PROCEDIMENTO Fazer uma suspensão de fezes e colocar uma gota sobre a lâmina. Acrescentar uma gota de álcool a 96% e uma gota de Sudam III a 1%. As gorduras neutras apresentam-se sob a forma de pequenas gotículas muito refringentes e fracamente coradas pela bile. Coram-se de laranja pelo Sudam III. Os ácidos graxos apresenta-se sob a forma de agulhas finas longas e entrecruzadas. Aquecendo-se a lâmina, dissolvem e assumem o aspecto de glóbulos. Normalmente, aparecem 2 gotas de gorduras neutras por campo. REATIVO DE SATOFF SUDAM III Sudam III 2g Álcool a 96% 10 ml Ácido acético glacial 90 ml PESQUISA DE LEUCÓCITOS NAS FEZES O exame microscópico de leucócitos nas fezes é útil na diferenciação de determinadas doenças bacterianas nas quais os leucócitos estão ausentes. Raramente é observado pus nas fezes. PREPARO DO PACIENTE - O laboratório deve explicar ao paciente o propósito do teste. - O paciente deve trazer ao laboratório uma amostra aleatória de fezes.

29 29 - Procedimentos com bário e laxativos devem ser evitados por 1 semana antes do teste. - A antibioticoterapia deve ser suspensa até a coleta. METODOLOGIA - Colocar uma gota de solução de Azul de Metileno de Löefler no centro da lâmina. - Com o auxílio de um bastão de madeira ou um palito, peque uma pequena porção da amostra de fezes e misture completa e cuidadosamente com a gota de solução de azul de metileno. Dê preferência pela porção de fezes que tiver muco. - Colocar uma lamínula sobre a mistura e deixar em repouso por 3-5 minutos para corar os núcleos. - Observar no microscópio em campo de 40X. - Focalizar 10 campos microscópicos, contando a eventual presença de leucócitos polimorfonucleares. Quando a soma for igual ou superior a 50 leucócitos em 10 campos, indica agressão do trato intestinal. OBS: Pode-se utilizar também a coloração de GRAM. EXAME PARASITOLÓGICO DE SANGUE esquisa do parasito: malária, filariose, doença de Chagas. Coleta do sangue: polpa digital do anular esquerdo ou lóbulo da orelha. Com um algodão molhado em álcool iodado ou puro, limpa-se a superfície escolhida. Com uma lanceta, faz-se uma pequena picada na pele. Por compressão, sai a gota. Métodos de exame: Direto: a gota é colocada no centro de uma lâmina, coberta com lamínula e examinada imediatamente. Esse exame direto ou à fresco, permite visualizar os parasitas vivos, movimentando-se. Esfregaços: camada delgada e camada espessa.. ESFREGAÇO EM CAMADA DELGADA 1. Colocar uma gota do sangue na extremidade direita de uma lâmina. 2. Pegar outra lâmina, segurar por cima com a mão direita, com uma inclinação de 45º, encostar adiante da gota. 3. Deixar a mesma se espalhar pela superfície de contato das duas lâminas. 4. Puxar a gota espalhada até o fim da lâmina. 5. Secar por agitação vigorosa imediatamente. 6. Corar pelo Giemsa ou Leishman. ESFREGAÇO EM GOTA ESPESSA 1. Colocar 3mm 3 de sangue na lâmina. 2. Com o canto de outra lâmina, espalhar a gota numa área de 1cm Deixar secar ao ar durante seis a 36 horas.

30 30 4. Entre 6 e 36 horas, corar com o Giemsa ( uma gota de solução estoque/ ml de solução tampão). 5. Deixar em repouso por 30 minutos. 6. Lavar e examinar. COLORAÇÃO POR LEISHMAN 1. Cobrir o esfregaço com seis ou sete gotas do corante. 2. Deixar agir (fixar) por 15 segundo no máximo. 3. Adicionar então 12 a 14 gotas de solução-tampão. 4. Homogeneizar, soprando-se o corante com a pipeta e deixar em repouso 20 minutos. 5. Escorrer o corante e lavar em água corrente. 6. Deixar secar e examinar ao microscópio. PROCEDIMENTOS PARA A COLORAÇÃO DE GIEMSA Para observar o pontilhado, os esfregaços devem ser preparados dentro de uma hora após a coleta do material biológico. O citoplasma dos parasitas da malária, tripanosomas e Leishmania cora-se em azul e o material nuclear em vermelho. Glóbulos vermelhos, coram-se em vermelho pálido, os grânulos dos eosinófilos em vermelhopúrpura claro, os grânulos dos neutrófilos coram-se em púrpura-rosa intenso. Todos os parasitas devem ser relatados pelo nome científico, incluindo gênero e espécie, quando possível. Caso o esfregaço tenha secado por mais de 36 horas: - colocar a lâmina com a gota espessa numa vasilha com água destilada; - deixar em repouso por 10 minutos, para desemoglobinizar; - retirar a lâmina cuidadosamente; - deixar secar por alguns minutos; - fixar pelo álcool metílico(2 ) e corar pelo Giemsa (30 ).

31 31 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. NEVES, D. P. Parasitologia humana, 10 ª ed. Rio de Janeiro: Livraria Atheneu, NEVES, D. P. Parasitologia Dinâmica. 1ª ed. São Paulo: Livraria Atheneu, REY, L. Parasitologia, 2 ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, LEVENTHAL, R. Parasitologia Médica. São Paulo: Editorial Premier, DE CARLI, G.A. Parasitologia Clínica: Seleção de Métodos e Técnicas de laboratório para diagnóstico das Parasitoses Humanas. São Paulo: Atheneu, www. pncq.org 7. : página do Center for disea se control and Prevention com imagens e textos sobre parasitos de importância em saúde pública. 8.

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33 33 IMAGENS DE PROTOZOÁRIOS 1. Protozoário Espécie: Cryptosporidium parvum Estágio: Oocistos Forma: Redondo Tamanho: Aproximadamente 10 µm Material coletado: Fezes Características: São oocistos vermelhos, O oocisto constitui a forma infectante da criptosporidíase, pois é eliminado nas fezes e possibilita a infecção por via fecal-oral. 2. Protozoário Espécie: Endolimax nana Estágio: Cistos Forma: Redondo Tamanho: Os cistos são ovais e tem tamanho aproximado de 6 a 10 µm. Material coletado: Fezes Características: Possui quatro núcleos e geralmente aparecem em grandes quantidades. 3. Protozoário Espécie: Entamoeba coli Estágio: Cisto e trofozoíto Forma: Redondo Tamanho: Os cistos medem de 10 a 15 µm. Material coletado: Fezes Características: Tanto os cistos quanto os trofozoítos podem ser encontrados nas fezes, sendo que os primeiros, conforme o grau de desenvolvimento, contêm de um a oito núcleos e, à medida que o número de núcleos aumenta, o diâmetro nuclear e a quantidade de cromatina do cisto reduzem, é uma ameba comensal, ou seja, não pode causar doenças.

34 34 4. Protozoário Espécie: Entamoeba histolytica Estágio: Cisto Forma: Esférico ou redondos Tamanho: 10 a 20 µm Material coletado: fezes Características: causa amebíase, localização intestino grosso, transmissão fecal/oral, única ameba patogênica, 4 núcleos quando maduro. 5. Protozoário Espécie: Entamoeba histolytica Estágio: Trofozoíto Forma: Amebóide Tamanho: 20 a 60 µm Material coletado: Fezes Características: forma móvel, tempo de vida 15 a 30 minutos. 6. Protozoário Espécie: Giardia lamblia Estágio: Cisto Forma: Arredondado Material coletado: Fezes formadas Características: O cisto possui oito núcleos, quatro corpos parabasais, quatro axonemas e com parede celular grossa, imóveis, mas resistentes e infecciosos. 7. Protozoário Espécie: Giardia lamblia Estágio: Trofozoíto Forma: Forma de pera Tamanho: 15 µm Material coletado: Fezes (diarréia) Características: são móveis, possuindo oito flagelos e dois núcleos, dois corpos parabasais e ainda dois axonemas cada um.

35 35 8. Protozoário Espécie: Iodamoeba butchli Estágio: Trofozoíto Forma: Redonda Tamanho: de 10 a 15 m Material coletado: Fezes Características: Não apresenta cromatina periférica; cariossoma grande e central. 9. Protozoário Espécie: Iodamoeba butschlli Estágio: Cisto Forma: Redonda Tamanho: de 10 a 15 m Material coletado: Fezes Características: Não apresenta cromatina periférica; cariossoma grande e central, apresenta um só núcleo. 10. Protozoário Espécie: Isospora belli Estágio: Oocisto Forma: Oval Material coletado: Fezes Características: Causa isosporíase, possui dois núcleos mais escuros, o oocisto constitui a forma infectante da isosporíase, pois é eliminado nas fezes e possibilita a infecção por via fecal-oral. São finos murado, transparente. Eles podem ser demonstrados nas fezes após formal éter concentração onde elas aparecem como translúcido, oval estruturas medindo 20 a 33 de 10 a 19 m Oocisto Oocisto corado 11. Protozoário Espécie: Leishmania sp Estágio: Amastigota Forma: Redonda Tamanho: 5 m Material coletado: Sangue Características: Possui um núcleo bem escuro, tem forma arrendondada de cor vermelha

36 Protozoário Espécie: Leishmania sp Estágio: Promastigota Forma: Achatada Tamanho: 10 m Material coletado: Sangue Características: Possui um núcleo mais escuro, flagelos, semelhante a uma vagem. 13. Protozoário Espécie: Plasmodium vivax Estágio: Gametócitos Forma: Diversas Tamanho: 1a 2 m de diâmetro (a hemácia tem cerca de 7 m) Material coletado: Sangue Características: São parasitas esporozoides das células sanguineas. Têm diversas formas, de acordo com a fase do ciclo de vida. O seu período de incubação é de cerca de 15 dias. É espalhado em seres humanos pela picada do mosquito Anopheles. 14. Protozoário Espécie: Plasmodium falciparum Estágio: Gametócitos Forma: meia-lua na periferia do glóbulo Tamanho: 1 a 2 m de diâmetro (a hemácia tem cerca de 7 m). Material coletado: Sangue Características: A incubação é curta, de seis a dez dias. Invade todos os eritrócitos, imaturos, envelhecidos ou de meia idade.microscopicamente, é visto como meia-lua na periferia do glóbulo. Infecta mais frequentemente os eritrócitos que se encontram no fígado ou baço, e muitas vezes não é detectado no sangue periférico. As hemácias estão com tamanho aumentado e distorcidas, com grânulos avermelhados

37 Protozoário Espécie: Plasmodium malariae Estágio: Gametócitos Forma: pontos vermelhos à roxos Material coletado: Sangue Características: só infecta eritrócitos envelhecidos; Á microscopia os eritrócitos são de forma normal. Têm pontos vermelhos vivos, e merozoites em forma de barras. Sensível à cloroquina. 16. Protozoário Espécie: Toxoplasma gondii Estágio: Oocistos Forma: Taquizoítos: meia lua; bradizoíto: ovais. Tamanho: Taquizoítos 2 x 7 m; bradizoíto: 10 a 100 m. Material coletado: Sangue Características: Toxoplasma gondii é transmitido ao homem por diversas maneiras: através da ingestão de carne mal cozida contendo cistos de Toxoplasma; pela ingestão de oocistos provenientes de mão contaminada por fezes ou alimento e água; transmissão transplacentária; inoculação acidental de traquizoítos ou pela ingestão de oocistos infectantes na água ou alimento contaminado com fezes de gato. É um parasita unicelular. Taquizoítos (setas) de Toxoplasma gondii Cisto tecidual contendo bradizoíto 17. Protozoário Espécie: Trichomonas vaginails Estágio: trofozoíto Forma: não possui a forma cística, apenas a trofozoítica Tamanho: aproximadamente 15 m Material coletado: Secreção vaginal ou uretral Características: O parasito tem como habitat a vagina, bem como a uretra e a próstata do homem. Possui apenas forma trofozoítica, é transmitido durante o ato sexual e através de fômites, já que o protozoário pode sobreviver durante horas em uma gota de secreção vaginal ou na água, irritam a mucosa vaginal.

38 Protozoário Espécie: Trypanosoma cruzi Estágio: Amastigota, tripomastigota e epimastigota Material coletado: Sangue Características: Possui uma membrana ondulante, o flagelo acompanha a margem externa. Tripomastigota de Trypanosoma cruzi. Seta preta - cinetoplasto; vermelha - núcleo; azul - membrana ondulante; verde - flagelo. Epimastigota de Trypanosoma cruzi Amastigotas de Trypanosoma cruzi HELMINTOS 19. HELMINTOS Espécie: Ancylostoma braziliense Estágio: Ovo e larva Tamanho: O adulto mede de 5 a 10 mm de comprimento Material coletado: Fezes Características: Helminto nematódeo causador de ancilostomose animal e inflamação cutânea no homem (larva migrans); é próprio de felídeos e canídeos domésticos ou silvestres. Apresenta cápsula bucal que caracteriza-se por apresentar um par de dentes bem desenvolvidos. Os machos apresentam bolsa copuladora Ovo Larva rabditóide Larvas filarióides/detalhe da bolsa copuladora

39 HELMINTOS Espécie: Ancylostoma caninum Estágio: Ovos Forma: Arredondados ou elipsóides Tamanho: De 60 x 40 mm Características: parasita comum do intestino delgado de cães e gatos, possuindo na cápsula bucal três pares de dentes subiguais, bem desenvolvidos Os machos apresentam bolsa copuladora Ancylostoma caninum - detalhe da cápsula bucal 21. HELMINTOS Espécie: Ancylostoma duodenale Estágio: Forma: Tamanho: De 0,8 a 1,3 cm Material coletado: Fezes Características: Quando eliminados nas fezes são avermelhados. Tem bolsa copuladora e cápsula bucal com dois pares de dentes. Os ovos são liberados no ambiente e tornam-se larvados. A larva rabditóide leva por volta de uma semana para tornar-se larva filarióide. Essa penetra a pele do homem e o contamina. A larva atinge a circulação linfática ou vasos sangüíneos, passando pelos pulmões e retornando até a faringe para a deglutição. O local preferencial de instalação no intestino é no final do duodeno, onde torna-se o verme adulto Ancylostoma duodenale - cápsula bucal com dois pares de dentes. Ovo Larva rabditóide Larva filarióides

40 HELMINTOS Espécie: Necator americanus Estágio: Ovo e larva Tamanho: Seu tamanho adulto varia de 0,8 a 1,3 cm Material coletado: Fezes Características: Apresenta lâminas na cápsula bucal e o macho possui bolsa copuladora na região posterior. Quando eliminados nas fezes, são avermelhados; Os ovos são liberados no ambiente e tornam-se larvados. A larva rabditóide leva por volta de uma semana para tornar-se filarióide. A infecção mais comum é por penetração da larva pela pele humana, mas pode ocorrer penetração por mucosas (boca). A larva atinge a circulação linfática ou vasos sangüíneos, passando pelos pulmões e retornando até a faringe para a deglutição. O local preferencial de instalação no intestino é no final do duodeno, onde torna-se adulto. Ovo Larva rabditóide Larvas filarióides/detalhe da bolsa copuladora 23. HELMINTOS Espécie: Strongyloides stercoralis Estágio: Larvas Tamanho: 2 a 3 mm, quando parasitando o intestino humano. Material coletado: Fezes Características: Os ovos são eliminados nas fezes da pessoa contaminada, mas a eclosão e liberação das larvas é muito rápida, podendo haver auto-infecção. As larvas liberadas são rabditóides, podendo tornar-se larvas filarióides e fazer a penetração na mucosa intestinal, ainda no intestino do homem. Só fêmeas podem ser parasitas, possuem corpo cilíndrico, não segmentado. Ausência de ventosas. Aparelho digestivo completo. Adultos dióicos (sexos separados). Larva rabditóide e larva filarióide (notar a ausência de bainha)

41 HELMINTOS Espécie: Ascaris lumbricoides Estágio: Ovo e verme Tamanho: Os ovos têm 50 m; a fêmea com até 40 cm de comprimento bastante maior que o macho, e com o diâmetro de um lápis. Material coletado: Fezes Características: Ascaridíase ou ascaríase é uma parasitose geralmente benigna causada pelo verme nemátode Ascaris lumbricoides, também conhecido popularmente como lombriga.são vermes nemátodes, ou seja fusiformes sem segmentação. Os ovos são ovias, de coloração marrom, com um núcleo mais escuro. Ovos fértil e infértil, respectivamente, de Ascaris lumbricoides Fêmea de Ascaris lumbricoides 25. HELMINTOS Espécie: Enterobius vermicularis Estágio: Ovo e verme Forma: O ovo tem forma arredondada Tamanho: De 0,3 a 1,0 cm Material coletado: Fezes Características: Conhecido como oxiúrus. Morfologicamente, o verme adulto apresenta um par de asas cefálicas. Após o acasalamento, o macho é eliminado com as fezes e a fêmea adulta se dirige até o ânus para fazer a ovipostura, principalmente à noite. Com freqüência, não consegue retornar para a ampola retal, morrendo nesse local. Os ovos maturam rapidamente na pele da região perianal ou no solo, apresentando larvas infectantes. Enterobius vermicularis fêmea Enterobius vermiculares (ovo) 26. HELMINTOS Espécie: Trichuris trichiura Estágio: Ovo Forma: Os ovos têm o aspecto típico de barril ou bola de futebol americano ou a forma de limões Tamanho: Os machos tem em torno de 2,5 a 4 cm, as fêmeas em torno de 4 a 5 cm. Os ovos têm cerca de 45 a 65 de comprimento por 20 a 25 µm de largura. Material coletado: Fezes. Características: Possuem massa mucóide transparente nas duas extremidades (opérculos polares). ovos

42 HELMINTOS Espécie: Schistosoma mansoni Estágio: Ovo e verme Forma: Os ovos são redondos ou elípticos Tamanho: O ovo mede 150 m; machos e fêmeas de 1 a 2 cm de comprimento Material coletado: Fezes Características: O macho é espalmado e mais grosso e tem uma calha longitudinal (canal ginecóforo) no corpo, onde se encaixa e se aloja permanentemente a fêmea, cilíndrica e mais fina e um pouco mais longa. Os ovos tem um espinho afiado (espículo lateral), que lesa os tecidos do hospedeiro quando são expelidos. Ovos Macho e fêmea 28. HELMINTOS Espécie: Hymenolepis diminuta Estágio: Ovos Forma: Arredondada Tamanho: forma adulta mede de 10 a 60 cm Material coletado: Fezes Características: Os ovos se desenvolvem no intestino de artrópodes (pulgas); os artrópodes são ingeridos pelos ratos (acidentalmente pelo homem). A infecção humana é geralmente assintomática, mas pode ocorrer diarréia em crianças. As medidas de prevenção incluem a proteção dos alimentos contra ratos e insetos e o cozimento adequado. Hymenolepis diminuta - ovos 29. HELMINTOS Espécie: Hymenolepis nana Estágio: Ovos Forma: Arredondada Tamanho: Adultos medem de 2 a 4 cm Material coletado: Fezes Características: Pode ter como hospedeiros intermediários alguns insetos (pulgas). Os ovos são a forma infectante, sendo ingeridas pelo homem; é comum a transmissão de homem a homem e auto-infecção. No intestino, as larvas invadem a mucosa e assumem a forma de larva cisticercóide; adultos medem de 2 a 4 cm, formam proglotes, estes contém ovos, são eliminados nas fezes. Hymenolepis nana - ovos.

43 HELMINTOS Espécie: Taenia saginata Estágio: Ovos e verme adulto Tamanho: O adulto possui mais de um metro e meio de comprimento, podendo atingir até doze metros. Material coletado: Fezes Características: Escólex: quadrangular, sem rostro, sem acúleos, tem quatro ventosas mas não tem ganchos. Proglotes: ramificações uterinas muito numerosas, de tipo dicotômico, saem ativamente no intervalo das defecações Escólex Ovo em fezes 31. HELMINTOS Espécie: Taenia solium Estágio: Verme adulto Tamanho: O adulto possui mais de um metro e meio de comprimento, podendo atingir de cinco a seis metros. Material coletado: Fezes com ovos Características: Vive no intestino delgado do homem e possui o corpo alongado, delgado e chato, podendo ser dividido em: cabeça ou escólex, colo e estróbilos ou proglótides. A cabeça é a porção anterior destinada à fixação do hospedeiro e possui, para esse efeito, quatro ventosas e uma dupla coroa de ganchos. O pescoço ou colo é a região em que são produzidos novos anéis por estrobilização. O corpo é constituído por uma série de anéis -proglótides- que são divididos em imaturos, maduros e, no final, grávidos Taenia solium - escólex. Notar coroa de acúleos