AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOATIVO DE RESÍDUO DA EXTRAÇÃO DO ÓLEO DE GIRASSOL (Helianthus annus): COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA O FRACIONAMENTO DO FARELO

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1 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOATIVO DE RESÍDUO DA EXTRAÇÃO DO ÓLEO DE GIRASSOL (Helianthus annus): COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA O FRACIONAMENTO DO FARELO T. S. P Souza 1, V. A. Reis 2, K. C. Ladeira 3, M. G. B. Koblitz 4 1 Núcleo de Bioquímica Nutricional Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, (21) (thaizasps@gmail.com) 2 Núcleo de Bioquímica Nutricional Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, (21) (vicanjo@hotmail.com) 3 Núcleo de Bioquímica Nutricional Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, (21) (karinexd@gmail.com) 4 Núcleo de Bioquímica Nutricional Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, (21) (mkoblitz@gmail.com) RESUMO - O farelo de girassol é um dos subprodutos do processo de extração de óleo de girassol, rico em proteínas, fibras e compostos fenólicos. Os ácidos fenólicos presentes causam alterações significativas no farelo e no extrato proteico, pois tendem a interagir com as proteínas. O objetivo deste estudo foi comparar três diferentes metodologias para fracionar o farelo de girassol, de modo a avaliar sua eficiência pelo teor de compostos fenólicos em cada fração - extrato fenólico, extrato proteico e fração fibrosa. Foram testadas duas formas de extração dos fenólicos, com água e etanol 70% e duas formas de solubilizar as proteínas, em ph 9,0 e pela adição de NaCl, mas nas três metodologias foi utilizada precipitação isoelétrica das proteínas, em ph 4,5. O rendimento em proteínas foi baixo nas três metodologias testadas: M1 (4,4%), M2 (16,3%) e M3 (14,4%). M1 apresentou o maior rendimento de compostos fenólicos na fração fenólica (1200 mggae/g) e M3 foi a fração proteica com o menor residual de fenólicos (16 mggae/g). ABSTRACT - Sunflower meal is one of the by-products of the sunflower oil extraction process, high in protein, fiber and phenolic compounds. The presence of phenolic acids cause significant changes in the meal and in the protein extract, as they tend to interact with proteins. The aim of this study was to compare three different methodologies for the fractioning of sunflower meal and to evaluate their effectiveness by the amount of phenolic compounds in each fraction - phenolic extract, protein extract and fiber fraction. Two methods of extraction of phenolic compounds were tested, with water and 70% ethanol, and two ways to solubilize the proteins, at ph 9.0 and adding NaCl, but the isoelectric precipitation of proteins at ph 4.5 was applied in the three methodologies tested. The protein yield was low in all three tested methodologies: M1 (4.4%), M2 (16.3%) and M3 (14.4%). M1 showed the highest yields of phenolic compounds in the phenolic fraction (1200 mg GAE/g) and M3 produced the protein fraction with the lowest residual phenolic content (16 mggae/g). PALAVRAS-CHAVE: resíduo, extração, compostos fenólicos, proteína, fibra. KEYWORDS: residue, extraction, phenolic compounds, protein, fiber

2 . 1. INTRODUÇÃO O girassol (Helianthus annuus L.) é uma planta oleaginosa originária da América do Norte, cultivada em várias partes do mundo, que contém um dos óleos vegetais de melhor qualidade nutricional e sensorial (Fernandes et al., 2013; Santos et al., 2014). Um dos subprodutos do processo de extração de óleo é o farelo de girassol, que contém um elevado teor de proteínas, fibras e compostos fenólicos (González-Pérez e Vereijken, 2007). Este resíduo é considerado uma fonte de proteínas para a nutrição humana e apresenta pequena quantidade de compostos antinutricionais e ausência de substâncias tóxicas, mas sua principal aplicação atualmente é na alimentação animal (Pickardt et al., 2011). O farelo de girassol é composto principalmente por uma fração de fibra lignocelulósica (40% da matéria seca) e por uma fração proteica (cerca de 30% da matéria seca). O conteúdo de compostos fenólicos pode variar entre 3-4%, respondendo os ácidos clorogênico e cafeico por até 70% desse total (Ivanova et al., 2013). Os ácidos fenólicos presentes causam alterações significativas no farelo e no extrato proteico, pois tendem a interagir com as proteínas e reduzir a sua solubilidade, digestibilidade e vida-de-prateleira (Shchekoldina e Aider, 2014), o que pode ser visualmente verificado por alterações na cor do produto. A combinação entre ácidos fenólicos e proteínas pode ocorrer de duas formas: 1) via ligação de hidrogênio não-covalente e interações hidrofóbicas e 2) de forma covalente através da oxidação das quinonas. A oxidação de compostos fenólicos a quinonas ocorre em condições alcalinas ou pela ação da enzima polifeniloxidadase (González-Pérez e Vereijken, 2007). Estas substâncias diminuem o valor nutricional do produto final, devido à sua interação com os aminoácidos lisina e a metionina. Assim a remoção de compostos fenólicos é importante para aumentar a utilização do farelo de girassol na alimentação humana e animal. Muitos métodos têm sido propostos para remoção dos compostos fenólicos de farelo desengordurado de girassol: extração com solventes orgânicos e água, soluções ácidas ou salinas, filtração com membranas ou combinações desses processos. Apesar de serem eficientes na remoção de ácidos fenólicos, os processos de extração com solventes orgânicos promovem alterações na qualidade e no rendimento do extrato proteico obtido, em virtude de desnaturação, redução de solubilidade e perdas na recuperação das proteínas (González-Pérez, et al., 2002, González-Pérez e Vereijken, 2007). Este estudo consistiu na comparação de diferentes metodologias para a extração dos compostos fenólicos presentes no farelo de girassol desengordurado, de modo a avaliar sua eficiência pelo teor destes compostos em cada fração - extrato fenólico, extrato proteico e fração fibrosa. Desta forma, pretendeu-se indicar o método mais eficiente de remoção dos compostos fenólicos do farelo de girassol e avaliar o teor residual de ácidos fenólicos ligados a cada fração. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material Material vegetal. O farelo de girassol peletizado utilizado neste trabalho foi cedido pela Empresa Caramuru, situada no município de Itumbiara GO, Brasil. Este material foi enviado seco, desengordurado e peletizado e foi posteriormente moído em moinho de rotor tipo ciclone até tamanho de partícula inferior a 0,22 mm. Reagentes e enzimas. Os reagentes químicos utilizados (sais, ácidos, bases, álcoois) foram todos de grau analítico ou superior.

3 2.2 Metodologia Foram avaliados três métodos de fracionamento distintos a saber. A Metodologia 1 (M1), foi baseada no processo proposto por Shchekoldina e Aider (2014) com modificações. A 10 g de farelo de girassol foram adicionados 150 ml de água destilada, esta mistura foi então agitada a 45ºC por 30 minutos e centrifugada a x g, 20ºC por 15 minutos. O sobrenadante foi recolhido (correspondendo à fração fenólica) e foi realizada a extração dos compostos mais uma vez. Os sobrenadantes das duas extrações foram misturados e congelados para análises posteriores. O precipitado foi recolhido (fração de proteínas e fibras) e foi adicionado NaCl 10% na proporção 1:8. Esta mistura foi agitada a 45ºC por 1 hora e centrifugada nas condições acima descritas. O precipitado (fração de fibras) foi lavado com água destilada por três vezes, congelado e liofilizado. O ph do sobrenadante foi ajustado para 4,5 com ácido succínico (4%) e deixado em repouso por 1 hora, após este tempo, a mistura foi centrifugada e o precipitado (fração de proteína) foi congelado e liofilizado. A Metodologia 2 (M2), foi baseada no processo proposto por Salgado et al. (2011) com modificações. Ao farelo de girassol foi adicionado etanol 70% na proporção de 1:15, esta mistura foi agitada a 45ºC por 30 minutos e centrifugada a x g, 20ºC por 15 minutos. O sobrenadante (compostos fenólicos) foi recolhido e congelado e ao precipitado (proteína e fibra) foi adicionada água destilada na proporção de 1:10, então o seu ph foi ajustado para 9,0 com NaOH 2 N e a mistura foi agitada a 45ºC por 1 hora e centrifugada, processo que foi repetido uma segunda vez. O precipitado (fibras) teve seu ph ajustado para 7,0 e foi lavado por três vezes e por fim foi congelado e liofilizado. O resultado das duas extrações foi misturado, o ph foi ajustado para 4,5 com HCl concentrado e a mistura foi mantida em repouso por 1 hora e em seguida centrifugada. O pellet obtido correspondeu à fração de proteína que foi congelada e liofilizada. A Metodologia 3 (M3) foi também baseada na metodologia proposta por Salgado et al. (2011), mas a extração dos fenólicos foi feita com água e o processo de extração foi realizado por duas vezes. Desta forma, ao farelo de girassol foi adicionada água destilada na proporção de 1:15 e o procedimento restante seguiu conforme a M2. Determinação dos compostos fenólicos: o teor de composto fenólicos totais foi avaliado segundo a metodologia de Neves et al. (2009) com modificações. Para extrair os compostos fenólicos das frações proteína e fibra, foram pesados 0,05 g e 0,50 g, respectivamente, das amostras das metodologias M1, M2 e M3. As frações foram adicionados de 5 ml de acetona 70% e sonicadas por 30 minutos. As misturas foram então filtradas e avolumadas em balão volumétrico de 10 ml com solução de acetona. A fração de compostos fenólicos foi quantificada diretamente. Para a determinação dos compostos fenólicos foram adicionados em tubos de ensaio: 2,5 ml de solução Folin Ciocalteau, a 100 µl de amostra para o extrato de fenólicos puro e a 500 µl do extrato de fibras e fração proteica das M1, M2 e M3 e seus volumes completados com metanol até 3 ml. Após 5 minutos, foram adicionados 2,0 ml de carbonato de sódio (4%) e as amostras ficaram por 2 horas em repouso e ao abrigo da luz e após este tempo foram realizadas as leituras em espectrofotômetro com absorbância de 750 nm. Todas as amostras testadas foram avaliadas em triplicata. O padrão utilizado neste ensaio foi o ácido gálico. Os resultados obtidos foram avaliados por análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey, com nível de significância de 95% aplicando o software GraphPad Prism (5.0)

4 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Fracionamento do farelo de girassol De uma forma geral, a principal finalidade do fracionamento do farelo de girassol é a obtenção de alto rendimento de extrato proteico livre de compostos fenólicos, porém com os novos conhecimentos sobre os efeitos benéficos da ingestão regular de antioxidantes, a recuperação dos ácidos fenólicos do farelo vem recebendo maior atenção recentemente. As metodologias testadas incluíram uma etapa inicial de remoção de compostos fenólicos, que na M1 e na M3 consistiram de extração aquosa, indicada por Shchekoldina e Aider (2014) como a forma mais eficiente de solubilizar os ácidos fenólicos, e que na M2 utilizou solução aquosa de etanol a 70%, recomendada por Salgado et al. (2011) e também por Ye et al. (2015). Em seguida as metodologias apresentaram uma etapa de solubilização das proteínas, que promoveu a separação da fração de fibras. Na M1 essa solubilização foi feita por adição de NaCl, de modo a favorecer a extração de globulinas, solúveis em soluções salinas e que correspondem a cerca de 60% das proteínas de armazenamento da semente de girassol, sem necessariamente prejudicar a extração das albuminas solúveis em água e que correspondem aos 40% restantes (Franke et al., 2016). Para M2 e M3 a solubilização foi feita em ph 9,0, pois, de acordo com Damodaran et al. (2010), a maior parte das proteínas é solúvel em ph alcalino e a extração comercial de proteínas vegetais é feita nesse valor de ph. Por fim as metodologias de fracionamento apresentam uma forma de precipitação das proteínas extraídas, para sua recuperação. Nas três metodologias testadas no presente estudo foi utilizada precipitação isoelétrica das proteínas, em ph 4,5, método aplicado na totalidade dos trabalhos recentes disponíveis na literatura. No entanto, na M1 o ph foi ajustado com ácido succínico, pois no estudo de Shchekoldina e Aider (2014), o uso desse ácido garantiu menor interação entre ácidos fenólicos e proteínas, gerando isolados proteicos mais claros, enquanto na M2 e na M3 foi utilizado ácido clorídrico. Em todas as metodologias testadas, o extrato proteico apresentou coloração verde clara, isto ocorreu devido à interação entre as proteínas e os compostos fenólicos, que são substratos da enzima polifenoloxidase que gera esta coloração indesejada no produto, indicando que a etapa de remoção de fenólicos não foi altamente eficiente em nenhuma das metodologias testadas. A Tabela 1 mostra o rendimento percentual em proteína e fibra das três metodologias testadas, considerando que o farelo original continha 41% de proteínas solúveis e 43% de fibras. Em todos os casos, o rendimento em proteínas foi muito baixo, especialmente quando comparado aos resultados obtidos na literatura: Ivanova et al. (2012) obtiveram cerca de 50% de rendimento na extração de proteína, em condições otimizadas, enquanto a melhor metodologia do presente trabalho (M2) apresentou apenas 16,3% de recuperação da proteína solúvel do farelo. Os resultados das metodologias 1 e 3 parecem indicar que o uso de água para remoção de compostos fenólicos influencia negativamente o rendimento em proteínas, em comparação com a aplicação de solução etanólica. Possivelmente, parte das albuminas presentes na fração proteica foi solubilizada nesta etapa, ficando indisponível para extração, posterior à lavagem. A comparação dos resultados tanto para proteína quanto para fibra, da M1 com a M3, indica que a solubilização de proteínas do farelo de girassol foi mais eficientemente alcançada em ph alcalino do que em ph neutro com adição de NaCl. Possivelmente uma porção significativa da fração proteica permaneceu insolúvel em todos os métodos testados, mas esse fato é mais marcante na M1.

5 Tabela 1 - Rendimento do fracionamento em porcentagem (%) Metodologia Proteína Fibra M1 4,4% 158,6% M2 16,3% 153,2% M3 14,4% 132,1% 3.2 Teor de compostos fenólicos Na Tabela 2 são apresentadas as concentrações de compostos fenólicos relativas a cada fração do farelo de girassol obtida pelas três metodologias testadas. Foi possível verificar que o uso de água como solvente de extração foi mais eficiente do que a aplicação de solução etanólica. Este resultado está de acordo com o obtido por Salgado et al. (2011), que também obtiveram maior rendimento na extração de fenólicos utilizando água como solvente. No presente trabalho verificou-se que na M1 foi obtido maior rendimento de compostos fenólicos na fração fenólica e na M3 obteve-se a fração proteica com o menor residual de ácidos fenólicos, ambas metodologias que aplicaram água para remoção de fenóis. Fica claro também pela observação da Tabela 2, que o arraste de compostos fenólicos pela fração fibra é várias vezes inferior ao que acontece com a fração proteica, de acordo com o esperado, visto que há a ocorrência de interação química covalente e não covalente entre proteínas e ácidos fenólicos. Verifica-se ainda que o teor total de compostos fenólicos quantificado na M1 é várias vezes superior aos teores obtidos nas demais metodologias, levando a suspeitar que parte importante da fração fenólica do farelo foi descartada após a precipitação isoelétrica das proteínas, nas metodologias 2 e 3. Tabela 2 Concentração de compostos fenólicos das frações do farelo de girassol Compostos Fenólicos Fibras Proteína Metodologia (mg de ácido gálico/100 g) (mg de ácido gálico/100 g) (mg de ácido gálico/100 g) M1 1200,19 a 96,33 a 322,89 a M2 41,07 b 60,90 b 284,13 b M3 50,13 b 16,77 c 229,43 c Letras sobrescritas diferentes na coluna indicam diferença significativa com 95% de confiança. 4. CONCLUSÃO Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que a extração de compostos fenólicos do farelo de girassol foi mais eficientemente alcançada pela aplicação de água como solvente, no entanto, essa extração parece ter interferido negativamente no rendimento em proteína do fracionamento. A solubilização das proteínas do farelo em ph 9,0 foi mais eficiente do que por adição de NaCl e a aplicação de ácido succínico na precipitação isoelétrica não se mostrou mais eficiente do que a do HCl comumente utilizado. Nas três metodologias testadas parece ter havido perdas de proteína para a fração de fibras, assim como possível descarte de compostos fenólicos, sobretudo nas M2 e M3.

6 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Damodaran, S., Parkin, K. L., Fennema, O. R. (2010). Química de Alimentos de Fennema. (4 ed.) Artmed. Fernandes, R. T. V., Arruda, A. M. V., Silva, L. N. S., Oliveira, R. M. & Vasconcelos, N. V. B. (2013). Grão de girassol e seus subprodutos: potenciais fontes proteicas para alimentação de aves. Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável, 8(5), González-Pérez, S. & Vereijken, J. M. (2007). Review Sunflower proteins: overview of their physicochemical, structural and functional properties. Journal of the Science of Food and Agriculture, 87, González-Pérez, S., Merck, K. B., Vereijken, J. M., Koningsveld, G. A V., Gruppen, H., V &, A. G. J. (2002)Isolation and Characterization of Undenatured Chlorogenic Acid Free Sunflower (Helianthus annuus) Proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, Ivanova, P., Chalova, V., Koleva, L., & Pishtiyski, I. (2013). Amino acid composition and solubility of proteins isolated from sunflower meal produced in Bulgaria. International Food Research Journal, 20(6), Lomascolo, A., Uzan-Boukhris, E., Sigoillot, J. C. & Fine, F. (2012). Rapeseed and sunflower meal: a review on biotechnology status and challenges. Applied Microbiology Biotechnology, 95, Neves, L. C., Alencar, S. M. & Carpes, S. T. (2009) Determinação da atividade antioxidante e do teor de compostos fenólicos e flavonoides totais em amostras de pólen apícola de Apis mellifer. Brazilian Journal of Food Technology, VII BMCFB. Pickardt, C., Weisz, G. M., Eisner, P., Kammerer, D. R., Neidhart, S. & Carle, R. (2011). Processing of low polyphenol protein isolates from residues of sunflower seed oil production. Procedia Food Science 1, Salgado, P. R., Ortiz, S. E. M. Petruccelli, S. & Mauri, A. N. (2012). Functional Food Ingredients Based on Sunflower Protein Concentrates Naturally Enriched with Antioxidant Phenolic Compounds. Journal of the American Oil Chemists' Society, 89, Salgado, P. R; Ortiz, S. E. M; Petruccelli, S; Mauri, A. N. (2011). Sunflower Protein Concentrates and Isolates Prepared from Oil Cakes Have High Water Solubility and Antioxidant Capacity. Journal of American Oil Chemists` Society, 88, Santos, G. L., Dantas, K.A., Bezerra, L. L., Lucena, A. M. A. & Maia, J. M. (2014) Cultivo de Girassol para a Apicultura, forragem e produção de óleo. Universidade Estadual da Paraíba. Disponível em Shchekoldina, T. & Aider, M. (2014). Production of low chlorogenic and caffeic acid containing sunflower meal protein isolate and its use in functional wheat bread making. Journal of Food Science and Technology, 51(10), Thomazini, A. & Martins, L. D. (2011). Qualidade física e fisiológica de sementes de girassol (Helianthus annuus L.) cultivar MG2 em condições de casa de vegetação e laboratório. Enciclopédia Biosfera, Centro Científico Conhecer - Goiânia, 7(12), 1 9. Ye, F., Liang, Q., Li, H. & Zhao, G. (2015). Solvent effects on phenolic content, composition, and antioxidant activity of extracts from florets of sunflower (Helianthus annuus L.). Industrial Crops and Products, 76,