POLIMORFISMO MOLECULAR EM POPULAÇÕES DE Hypostomus (SILURIFORMES: LORICARIIDAE) DO RIO IVAÍ

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1 20 a 24 de outubro de 2008 POLIMORFISMO MOLECULAR EM POPULAÇÕES DE Hypostomus (SILURIFORMES: LORICARIIDAE) DO RIO IVAÍ Alignéia Aparecida de Souza Guedes 1 ; Elisângela Pereira Bimbato 2 ; Alessandra Valéria de Oliveira 3 ; Rosilene Luciana Delariva 4 ; Alberto José Prioli 5 ; Sônia Maria Alves Pinto Prioli 56 RESUMO: Os Loricariidae, da ordem Siluriformes, constituem a segunda maior família de peixes neotropicais em número de espécies, sendo Hypostomus o gênero mais especioso. Conhecidos popularmente como cascudos, possuem ampla distribuição e diversidade biológica e são considerados animais de acentuada importância ambiental, uma vez que atuam como pré-mineralizadores da matéria orgânica antes que essa reingresse na cadeia alimentar. Sua ampla variação intraespecífica na morfologia e no padrão de coloração são problemas que dificultam a identificação de espécies. Na região do município de Maringá-PR, têm sido encontrados alguns exemplares do gênero e alguns morfótipos ainda não identificados, o que se torna pré-requisito fundamental para estudos ecológicos e para elaboração de estratégias de manejo. Dessa forma este trabalho teve por objetivo obter marcadores moleculares espécieespecíficos que pudessem ser utilizados na identificação de espécimes do gênero Hypostomus na região. Foram analisados através da técnica ISSR, exemplares de sete espécies de Hypostomus, coletados no rio Ivaí. Foram obtidos marcadores diagnósticos que poderão constituir ferramenta para a correta identificação das espécies na região. Palavras-chave: Hypostomus; ISSR; marcadores moleculares. INTRODUÇÃO A região Neotropical tem a fauna de peixes de água doce mais rica e diversificada do globo, com uma estimativa de espécies, distribuídas entre 71 famílias. Destas, espécies ainda não foram descritas taxonomicamente (REIS et al., 2003). Pertencente à Ordem dos Siluriformes, a família Loricariidae possui aproximadamente 600 espécies já descritas, distribuídas em 70 gêneros e 7 subfamílias. Porém, apesar desta extensa variedade de representantes, a existência de estudos genéticos é limitada a poucas espécies. Dentro da subfamília Hypostominae o gênero Hypostomus é o mais especioso e largamente distribuído dentre os peixes da América do Sul, sendo considerado um dos mais complexos da ictiofauna neotropical. Estes peixes apresentam ampla variedade tanto morfológica quanto no seu padrão de cores, o que explica sua taxonomia problemática (WEBER, 2003). Conhecidos popularmente como cascudos são peixes de hábitos noturnos, bentônicos, caracterizam-se por apresentarem corpo delgado revestido de placas ósseas. 1 Acadêmica do Curso de Ciências Biológicas. Universidade Estadual de Maringá UEM. Ex-bolsista do Programa de Bolsas de Iniciação Científica do Cesumar (PROBIC). aligneia@hotmail.com 2 Acadêmica do Curso de Ciências Biológicas. Universidade Estadual de Maringá UEM. Programa de Bolsas de Iniciação Científica do Cesumar (PROBIC). elisangelapb@hotmail.com 3 Orientadora e docente do Curso de Ciências Biológicas do Centro Universitário de Maringá Cesumar. alessoli@cesumar.br 4 Docente do Curso de Ciências Biológicas do Centro Universitário de Maringá Cesumar. rodelariva@cesumar.br 5 Docentes do Curso de Agronomia. Departamento de Biologia Celular. Universidade Estadual de Maringá UEM. ajprioli@nupelia.uem.br; priolis@nupelia.uem.br

2 Demonstram grande capacidade adaptativa, que está relacionada com sua respiração, sendo além das brânquias realizada também por paredes vascularizadas do estômago, fato este, que lhe permite ficar fora da água por longo período de tempo. Além da importância ecológica, representada por seu hábito alimentar detritívoroherbívoro, algumas espécies representam grande fator bioeconômico, onde se constituem um vantajoso recurso pesqueiro por serem uma das maiores famílias de peixes de água doce. Apesar da grande importância biológica e extensa distribuição por todo neotrópico, a identificação correta dessas espécies se torna cada vez mais difícil, pois sua morfologia é muito semelhante em todas as espécies. Na bacia do rio Paraná, por exemplo, há mais de 16 espécies de Hypostomus que não apresentam um consenso em relação a sua taxonomia, havendo a necessidade de mais estudos para uma identificação específica. Na região do município de Maringá-PR, têm sido encontrados alguns exemplares do gênero e alguns morfótipos ainda não identificados. O reconhecimento dessas espécies constitui requisito fundamental para futuros estudos de ecologia e biologia do gênero Hypostomus, principalmente em ambientes que vem sofrendo com a ação antrópica. Desde os primórdios da biologia evolutiva, uma das principais questões têm sido a caracterização e a explicação da variabilidade genética intra e interpopulacional. Técnicas moleculares se tornaram valiosas para realizar a identificação de espécies e indivíduos. As metodologias baseadas na Polymerase Chain Reaction (PCR), aumentaram muito a eficiência na detecção de polimorfismos no nível de DNA, traduzida em redução de tempo, custo e complexidade (MATIOLI et al., 2001). A técnica molecular conhecida como Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) ou Single Primers Amplifications Reactions (SPAR), se baseia na amplificação de DNA via PCR, com o emprego de um único primer com a seqüência repetitiva de um microssatélite. Os primers ISSR com seqüências tetranucleotídicas constituem marcadores estáveis, mostrando serem eficientes na produção de padrões polimórficos informativos intraespecíficos (GUPTA et al., 1994) e interespecíficos (FERNANDES- MATIOLI, 1999), uma vez que amplificam regiões que se encontram entre dois blocos de microssatélites. Esses marcadores são de fácil utilização, especialmente por não requererem conhecimento prévio sobre a seqüência de DNA, gerando alto grau de polimorfismo com o uso de pequenas quantidades de DNA por reação. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo obter marcadores moleculares espécie-específicos para as diferentes populações de Hypostomus do rio Ivaí. Esses marcadores diagnósticos podem auxiliar a identificação dos espécimes do gênero na região. MATERIAL E MÉTODOS Foram coletados exemplares de Hypostomus em pontos distintos do rio Ivaí, no período de agosto de 2007 a março de De cada espécime coletado foram retiradas amostras de tecido muscular, que posteriormente foram fixadas em álcool etílico comercial e estocadas em freezer a -20 C. Dentre o s exemplares capturados foram identificadas cinco espécies: Hypostomus albopunctatus; H. ancistroides; H. hermanni; H. regani e H. cf. topavae. Duas espécies ainda não estão identificadas: Hypostomus sp. e Hypostomus sp2. A metodologia utilizada para a extração de DNA total foi baseada em fenol/clorofórmio. Amostras de tecido muscular retiradas de cada indivíduo foram maceradas em nitrogênio líquido e homogeneizadas em tampão PS (Tris-HCl 0,2 M, EDTA 30 mm, SDS 2% e Sacarose 5%), tampão TH (Tris-HCl 10 mm, NaCl 60 mm, EDTA 10 mm, Sacarose 5%, Espermina 0,15 mm e Espermidina 0,15 mm) ph 8,0 e

3 proteinase K (20 µg/µl) por 90 minutos em banho-maria a 37 C. Posteriormente, o DNA foi purificado por extração com fenol/clorofórmio (1:1) e clorofórmio, respectivamente, e precipitado com solução salina (NaCl 5 M) e etanol absoluto gelado. O pellet foi ressuspendido em tampão TE (Tris 10 mm, EDTA 1 mm) com RNAse. Foi feita a quantificação através de eletroforese em gel de agarose 0,8%, por meio de comparação com DNA de fago λ de concentração conhecida. As análises moleculares foram realizadas a partir de uma amostra de 27 exemplares, com representantes de sete espécies distintas que primeiramente foram identificadas por critérios morfológicos. Para a análise molecular foram utilizados 2 primers (GGAC) 3 A e (GGAC) 3 T. Cada um dos indivíduos teve seu DNA submetido à amplificação em um termociclador, que foi realizada via ISSR, com o uso de um único primer com seqüências de microssatélites. Além destes também foram utilizados tampão Tris-KCl (Tris-HCl 20mM ph 8,4 e KCl 50mM), MgCl 2 2mM, dntp 0,19 mm, 1 U/reação de Taq-polimerase e água suficiente para completar 13 µl. Após a amplificação, os fragmentos de DNA foram separados em gel de agarose 1,4 %, corado com brometo de etídio. A visualização foi feita em um transluminador sob luz UV. A análise foi realizada pelo registro dos comprimentos, em pb, das bandas produzidas. RESULTADOS E DISCUSSÃO Variações interpopulacionais e interespecíficas, em peixes, têm sido detectadas através da técnica ISSR, principalmente em função da grande quantidade de primers disponíveis e que podem ser utilizados, cada um detectando variações em algumas regiões do genoma (ALBERT et al., 1999; ALMEIDA, 2005). Neste estudo a técnica tem discriminado, sem conhecimento prévio do genoma analisado, sete diferentes populações de peixes. Os fragmentos observados nos 27 indivíduos mostraram alto grau de polimorfismo, e grande parte deles foram exclusivos de uma ou outra população (Figura 1). Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1,4% de fragmentos de DNA amplificados a partir de diferentes espécimes do gênero Hypostomus, utilizando o primer (GGAC) 3 T. Colunas 1, 2 e 3 (H. ancistroides); 4 e 5 (H. regani); 6, 7 e 8 (Hypostomus sp.); 9 e 10 (Hypostomus sp2.); 11, 12, 13 e 14 (H. hermanni); 15 e 16 (H. regani) 17 e 18 (H. albopunctatus). L (Marcador de peso

4 molecular Ladder 100pb); B (Controle negativo da reação). As setas indicam a presença de marcadores moleculares espécie-específicos. Os primers analisados produziram diferentes padrões de fragmentos ISSR, embora primers individuais tenham diferido na quantidade de variação que eles detectaram. O número de bandas nítidas e reproduzíveis geradas pelos primers (GGAC) 3 A e (GGAC) 3 T em todas as populações variaram de 17 a 22, respectivamente e o tamanho desses produtos amplificados permaneceu entre pb. Dos 39 locos analisados, aproximadamente 94% revelaram ser polimórficos com o primer (GGAC) 3 A e 96% com o primer (GGAC) 3 T, o que demonstra um elevado grau de polimorfismo entre os indivíduos analisados. Embora em vários casos os alelos não estivessem presentes em todos os indivíduos, alguns foram únicos para uma dada população. Ao analisar os perfis eletroforéticos dos diferentes espécimes através da separação dos fragmentos de DNA, pôde-se observar a existência de bandas espécie-específicas, ou seja, fragmentos que estão presentes em indivíduos de uma única espécie e ausentes nos demais. Como exemplo, na Figura 1 observam-se marcadores espécie-específicos, obtidos com o primer (GGAC) 3 T para as populações de H. ancistroides (fragmentos de 900 e 1100pb), Hypostomus sp. (fragmento de 410 pb) e Hypostomus sp2. (fragmento de 1250 e 1650 pb). Marcadores moleculares, baseados na seqüência do DNA, têm possibilitado grande detecção de polimorfismo interpopulacional em comparação com marcadores morfológicos ou baseados na análise de proteínas. Neste trabalho, os fragmentos amplificados ISSR constituíram marcadores estáveis e com pouca variação intraespecifica, sendo, portanto, uma poderosa técnica a ser utilizada na separação de espécies com problemas taxonômicos, como é o caso do gênero Hypostomus. Estes marcadores moleculares têm sido utilizados na caracterização de outras populações de peixes (PRIOLI et al., 2004; MARTIN, 2007). CONCLUSÃO A técnica ISSR é eficiente na identificação de polimorfismo de DNA entre espécies do gênero Hypostomus, permitindo a análise da variabilidade genética do grupo. Foram obtidos marcadores diagnósticos, ou seja, marcadores monomórficos e exclusivos de cada população, que podem ser utilizados para a identificação de espécimes e a discriminação de espécies dentro do gênero Hypostomus. REFERÊNCIAS ALBERT, J.; FERNANDES-MATIOLI, F. M. C. & ALMEIDA-TOLEDO, L. F. A new specie of Gymnotus (Gymnotiformes, Teleostei) from Southeastern Brazil: towards the descontruction of Gymnotus carapo. COPEIA. n.1, p ALMEIDA, G.C.A. Análise genética via SPAR, de duas espécies do gênero Cichla introduzidas na bacia do Rio Paraná Monografia (Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas) Centro Universitário de Maringá CESUMAR, Maringá-PR, FERNANDES-MATIOLI, Flora Maria Campos. Evolução e estrutura de populações no gênero Gymnotus (Pisces: Gymnotiformes) p. Tese de Doutorado em Genética Instituto de Biociências-USP. São Paulo, 1999.

5 GUPTA, M. et al. Amplification of DNA markers from evolutionary diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics, Gaithersburg, v. 89, n. 7-8 p dez MARTIN, Paula Garcia. Caracterização molecular de populações de Steindachnerina (Pisces: Characiformes) da planície alagável do alto rio Paraná Monografia (Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas) Centro Universitário de Maringá CESUMAR, Maringá-PR, MATIOLI, Sérgio Russo; PASSOS-BUENO, Maria Rita Santos. Métodos baseados em PCR para análise de polimorfismos de ácidos nucléicos. In: MATIOLI, Sérgio Russo. Biologia Molecular e Evolução. Ribeirão Preto. Holos p PRIOLI, A. J., LÚCIO, L. C., MANIGLIA, T. C., PRIOLI, S. M. A. P., JÚLIO JR., H.F, PAZZA R., CARRER, H., PRIOLI, L. M. Molecular Markers and Genetic Variability of Hoplias aff. malabaricus Populations from the Upper Paraná River Floodplain. In: AGOSTINHO, A. A., RODRIGUES, L., GOMES, L. C., THOMAZ, S. M., MIRANDA, L. E., (Eds.) Structure and functioning of the Paraná River and its floodplain: LTER Site 6 (PELD Sítio 6). Maringá: EDUEM. p , 2004 REIS, Roberto E.; KULLANDER, Sven O.; FERRARIS Jr, Carl J. Check list f the freshwater fishes of south and Central America. Porto Alegre: EDIPUCRS, WEBER, C. Family Loricariidae: Subfamily Hypostominae. In: REIS, Roberto E.; KULLANDER, Sven O.; FERRARIS Jr, Carl J. Check list of the freshwater fishes of south and Central America. Porto Alegre: Edipucrs, p