Detecção e Identificação de Fungos de Importância Médica

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1 Detecção e Identificação de Fungos de Importância Médica Como Fazer??? Dra. Marilene Rodrigues Chang Mestre em Análises Clínicas, área de Micologia USP/SP Doutora em Ciências, área de Bacteriologia FIOCRUZ/RJ Docente do Depto. de Farmácia e Bioquímica da UFMS: Microbiologia Clínica Quando Valorizar o Isolamento de Fungos em Cultura? Qualquer amostra biológica com resultado positivo ao exame microscópico Micose cutânea Fluídos corporais normalmente estéreis Tecidos obtidos por biópsias ou peças operatórias Urina, obtida por sondagem ou cistoscopia, independente da contagem de colônias Raspado de córnea Paciente imunodeprimido (transplantado ou com Aids) Paciente em uso de antibióticos por longo tempo, internado em UTI ou submetido a ventilação, cateterismo ou outras manipulação Paciente de hemodiálise ou debilitado que apresente algum sintoma ou sinal de doença infecciosa independente do tipo de amostra clínica Além desses casos, têm importância as culturas de fungos: Dimórficos Isolados mais de uma vez, do mesmo tipo de amostra biológica, coletada em diferentes dias e procedentes do mesmo paciente Isolados de ponta de cateter (alimentação parenteral, infusões venosas, etc.) IMPORTÂNCIA de se identificar os fungos na atualidade Grande valor diagnóstico Diagnóstico preciso Terapêutica mais específica Exames Micológicos Fluxograma para Exames Micológicos Micológico Direto A fresco com KOH 20% ou DMSO A fresco com Tinta nanquim Corado Gram Giemsa Croccott Azul de orto - toluidina PAS, HE Mucicarmin Cultura ASD com e sem antibiótico ASD com antifúngico (cicloheximida( cicloheximida) ) * Ágar BHI Ágar Batata Provas de Identificação Leveduras Fungos Filamentosos Antifungigrama Difusão em ágar Microdiluição em caldo (CLSI) Cultura do sedimento Cultura do triturado KOH e Tinta nanquim Gram KOH e Tinta nanquim Giemsa HE, PAS, Groccot (Sidrim, 1999) 1

2 Exame direto - Leveduras Exame Micológico Direto com KOH a 20% Exames de pelo, pele, unha, tecidos e exsudatos espessos Dermatófitos causando Tinea pedis Pé de atleta Resutado: Filamentos micelianos hialinos septados e artroconídeos sugestivo de dermatófitos ++ Exames Micológico Direto com KOH a 20% Cuidado... Material: escamas de pele de lesões Hipo ou hipercrômicas: Pitiríase Versicolor Exames Micológico Direto com KOH a 20% Resultado: Presença de filamentos micelianos curtos e tortuosos e blastoconídeos agrupados sugestivos de Malassezia spp +++ Exames Micológico Direto de fio de cabelo com KOH a 20% Presenças de blastoconídeos e pseudo hifas: ++ 2

3 Exames Micológico Direto com KOH a 20% Exames Micológico Direto com KOH a 20% Coleta: material abaixo das crostas HD: cromomicose Resultado: Presença de estruturas com morfologia característica de Paracoccidioides brasiliensis: ++ Presença de corpos escleróticos sugestivos de agentes de cromomicose Exames Micológicos Exame Micológico com Tinta Nanquim?? Materiais: Sedimento de LCR, urina e outros líq biológicos, escarro, Lavado brônquico, aspirado de medula Óssea e biópsia. Líquido cérebro espinal examinado com Tinta nanquim (100 X) Biópsia de Pulmão examinada com KOH 20% ( 400 X) Exame Micológico Técnica de Gram Material: Secreção vaginal com aspecto de leite coalhado Resultado: Presenças de leveduras (blastocinídeos) e pseudo-hifas sugestivos de Candida spp: ++ ( 1000X) Resultado: presença de leveduras capsuladas sugestivas de Cryptococcus spp +++ Exame Micológico Técnica de Gram Presença de Grãos actinomicóticos sugestivos de Micetoma: +++ ( 400 x) 3

4 Exame Microscópico com Coloração Panótica (Giemsa, Giemsa, Leishman ou Wright) Wright) Processamento de Biópsia para Exames Micológicos 1 Cortar o tecido em pedaços peqs Em placa estéril com NaCl 2 Aspirar com pipeta Pasteur e Semear em ASD e ABHI c/ atb 3 Incubar a 30 e 35ºC 3 Fazer lâminas c/ KOH e T. nanquim 4 Fazer lâmina para Giemsa Leveduras intracelulares sugestivas de Histoplasma capsulatum. Materiais: sangue periférico e Biópsia de pele ( 1000 X) Processamento de Biópsia para Exames Micológicos Exames Histopatológicos Exame Micológico Técnica de Groccott Biópsia: Coloração com PAS Fiilamentos ramificados sugestivos de actinomicetos ( 1000 x) Blastoconídeos e pseudo hifas de Candida albicans em rim de Camudongo Balb-c (1000 x) 4

5 Biópsia: Coloração com HE Mucicarmim Parede de artéria hepática em zona de anastomose com hifas de Zigomicetos (HE 400 X) Arteríola retroperitoneal com trombose oclusiva e hifas de Zigomicetos (HE 400 x) Procedimentos Laboratoriais Diagnóstico laboratorial Exame direto: levedura ou fungo filamentoso? Cultura: isolamento e identificação Condições adequadas de incubação Meio de cultivo Temperatura Tempo IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS Cultura de Amostras Biológicas para Isolamento de Fungos Candida albicans em ágar sangue manuais/microbiologia/mod_7_2004.pdf Amostra semeada em estrias em tubo tamponado com algodão hidrófobo Armazenamento em saco plástico à temperatura ambiente Isolamento primário: Agar Sabouraud Dextrose Ágar batata (PDA) Ágar BHI com Clo, Clo, Pn ou Estrep Meio Seletivo para fungos patogênicos* patogênicos*: ASD + cicloheximida (Mycosel, Mycosel, Mycobiotic) Mycobiotic) Meio Presuntivo: Ágar níger Dermatophyte teste Candida test ChromAgar 2 tipos de Meio a temp ambiente Colônias de cor creme, com formação de franjas que lembram estrelas. 5

6 Hemocultura IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS Metodologia Convencional Características morfológicas macroscópica (colônia), microscópicas (tamanho, cápsula, hifas e/ou pseudopseudo-hifas, produção de tubo germinativo e de clamidósporo) Testes bioquímicos (capacidade de assimilação, fermentação de carboidratos e assimilação de nitrato, nitrato, hidrólise da uréia); uréia); Testes Sorológicos Sistemas manuais e/ou com Kits Auxacolor Api 20 Cromoagar Sistemas automatizados VITEK (Bio (Bio Merieux) Merieux) Walk away (Dade Behring) Behring) Metodologia Convencional Teste do tubo germinativo negativo 1 - Pesquisa do tubo germinativo CUIDADO! Tubo de ensaio + 0,5 ml de soro humano, coelho ou cavalo Incubar a 37º até 3 h Adicionar ao 1 gota entre lâmina e lamínula e observar a constricção entre a célula mãe (blastoconídio) e o início da formação da pseudohifa. observar ao microscópio Tubo germinativo +: identificação presuntiva de C. albicans METODOLOGIA CONVENCIONAL 2 Auxanograma Assimilação de fontes de Carbono e Nitrogênio 2 ml da suspensão da levedura Inóculo: escala 1 McFarland (2mL) Meio YNB fundido Placa de Petri, estéril e previamente numerada no verso Aplicação de discos ou açúcar in natura Halo de turvação Incubação 30oC por 24-48h 6

7 Auxanograma METODOLOGIA CONVENCIONAL 3 Microcultivo em ágar fubá com Tween 80, a 25ºC Aplicação de compostos nitrogenados Peptona (controle positivo) Nitrato de potássio Incubação 30oC por h até 7 dias Resultados: presença de zona de crescimento (leitura visual) 72 h a 25º C Técnica de cultivo em câmara úmida Aspectos Microscópicos de Leveduras de Interesse Médico Candida albicans Observação de filamentos micelianos hialinos septados, blastoconídeos Agrupados e clamidoconídios terminais (100 X e 400X) Candida Tropicalis Candida parapsilosis Colônias de cor creme. Podem lembrar renda. Pseudo-hifas e blastoconídios intercalados ao longo dos filamentos (400 X) Pseudo hifas ramificadas, blastoconídeos alongados e ligeiramente curvos; às vezes, presença de hifas gigantes 7

8 Candida glabrata C. krusei Macromorfologia (ágar Sabouraud) Sabouraud) Micromorfologia Colônias de cor branca a creme, de textura cremosa. Blastoconídios pequenos, ovais ou com gemulação terminal única. Não há formação de pseudohifa. Trichosporon Colônias de cor creme, podem escurecer com o tempo. Aspecto seco e rugoso Cryptococcus spp Pseudohifas com blastoconídios alongados e ramificados, por vezes com aparência de arvoredos Rhodothorula spp Colônias de cor laranja a vermelha, aspecto cremoso. Blastoconídios: células redondas ou ovais, com gemulação e raramente apresentam pseudohifa. METODOLOGIA CONVENCIONAL 5 - Produção de urease 6 - Produção de fenol oxidase Blastoconídios arredondados, sem pseudo-hifa 8

9 METODOLOGIA CONVENCIONAL Fluxograma para Identificação de Leveduras de Importância Médica Cultura positiva 4 - Crescimento a 42 ºC Bactéria Exame direto Levedura Cultura Pura Sim Não Obter Colônia Pura por isolamento Cápsula C. albicans X C. dubliniensis Candida albicas + Macromorfologia Colônia bege: Criptococcus spp Colônia salmão/laranja: Rhodothorula sp - Tubo Germinativo - + C. albicans Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua) Cultivo em Lâmina Provas Bioquímicas Blastoconídios - Urease positiva: Inositol - : Rhodotorula Inositol + : Cryptococcus Presença de artrósporos(=artroconidios artroconidios) Urease - : Geotrichum Urease + : Trichosporon (brotamento +) Métodos Comerciais para Identificação de Leveduras Chromoagar Candida API 20C AUX (BioMérieux( BioMérieux) ID 32C (BioMérieux( BioMérieux) Candifast (International Microbio) Microscan (Dade Beringh) Vitek (BioMérieux) Meios Cromogênicos Detectam enzimas através de substratos específicos ou substratos cromógenos Permitem detecção de colônias mistas Rápida identificação de C. albicans 9

10 Chromoagar Candida API-20 C h r o m A g a r C. albicans Candida Cromogenic Agar (Oxoid) Verde = C. albicans Azul = C. tropicalis Pink = C. krusei Bege = C. parapsilosis Amarelo/bege/pink = C. glabrata 19 testes assimilativos Incubação 30 o C - 24, 48 e 72 horas Leitura: verificação de crescimento - turbidez Necessidade de correlação com a análise morfológica Informa a necessidade de testes adicionais Método de referência Acurácia entre 96 e 98% para as espécies patogênicas mais comuns, sem testes adicionais C. krusei API-20 Kit comercial Auxacolor (Sanofi-Pasteur) 345 H Assimilação de 13 açúcares + Resistência à cicloheximida C. tropicalis Candifast (International Microbio) Identificação e teste de sensibilidade Gêneros: Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula e Saccharomyces Único inóculo e leitura colorimétrica Resultados em 24 a 72 horas (37 o C) Identificação sensibilidade actidione fermentação de 7 açúcares hidrólise da uréia Teste de Sensibilidade sete antifúngicos: : 1 concentração Uni-Yeast Tek Plate 11 pocinhos periféricos com teste de hidrólise da uréia, assimilação de carboidratos e nitrato. No pocinho central ágar batata com Tween para exame morfológico Pacote com 10 placas 10

11 Sistema Microscan Painel cromogênico Identificação em 4h O sistema detecta a presença de enzimas pré-formadas utilizadas pelo microrganismos pela utilização substratos específicos. ID 32 C STRIPS (BioMérieux) 29 testes leitura após 24/48 horas de incubação a 30 o C - visual ou automatizada taxas de identificação variam de 94 a 98 % Ramani et al, 1998 taxa de identificação de 92% para as espécies comuns de leveduras 85 % para isolados raros apresenta uma base de dados bastante ampliada Vitek System (BioMérieux) Sistema automatizado: leitura turbidimétrica 26 substratos baseado nos métodos convencionais Bionúmero - banco de dados do sistema Resultado: percentual de probabilidade de ser a espécie identificada Vitek System (BioMérieux) 16 espécies de Candida 6 espécies de Cryptococcus 3 espécies de Rhodotorula 2 espécies de Trichosporon 3 espécies de Geotrichum 2 espécies de Prototheca, Pichia anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytyca Vitek system (BioMérieux) Percentual de probabilidade é baixo = testes adicionais 93 % das leveduras comuns foram identificadas 55 % das leveduras menos comum foram corretamente identificadas Falhas na identificação: 42% de C. krusei 80 % de C. lambica 88 % de T. beigelli 83 % de Cryptococcus (não C.neoformans) Vitek 2 ID YST Card Vitek 2 47 testes (29 clássicos e 18 enzimáticos) leitura fluorescente automatizada 15 horas de incubação base de dados com 51 espécies inclui Candida dubliniensis dubliniensis e a atualização sistemática dos gêneros Rhodotorula e Trichosporon taxa de identificação de 96,8% 11

12 Considerações... Identificação de Fungos Filamentosos Diversos métodos Diferentes níveis de sensibilidade, especificidade e acurácia em Aspectos cada sistema macroscópicos Necessidade de estudo morfológico e/ou a complementação com testes tradicionais Escolha do(s) método(s) Realidade de cada laboratório Freqüência de isolamento Custo do teste Eficácia do teste Identificação de Fungos Filamentosos Cor Textura da colônia Pigmento difusível Velocidade de crescimento Aspectos Microscópicos de Fungos Filamentosos MICROCULTIVO EM ÁGAR BATATA Aspectos Microscópicos de Fungos Filamentosos Agentes de Dermatofitoses Microsporum canis Aspectos Microscópicos de Fungos Filamentosos, Demácios (pigmento escuro) Epidermophyton flocosum Phialophora verrucosa Trichophyton mentagrophytes Rinocladiella aquaspersa Trichophyton rubrum 12

13 Diagnóstico Laboratorial de Fungos Dimórficos Testes Sorológicos H. capsulatum P. brasiliensis Úteis no diagnóstico da paracoccidioidomicose e também para acompanhamento de tratamento. O teste de imuno difusão é positivo em 80-90% dos casos. Os títulos de anticorpos diminuem com o sucesso do tratamento. Infecções Fungicas Sistêmicas Platelia Aspergillus EIA test (Bio-Rad) Detecta o Ag galactomana de Aspergillus no sg como indicador de infecção invasiva (transplantados, imunocomprometidos, em uso de quimioterapia) Resultado disponível em 3 h Teste de Susceptibilidade aos Antifúngicos Normatizações disponíveis segundo NCCLS Espécies Candida spp. e Cryptococcus neoformans Aspergillus spp, Fusarium spp, M38-P 1998 Rhizopus spp, Pseudollescheria boydii e M38-A 2002 Sporothrix schenckii Candida spp. Documentos M27-P 1992 M27-T 1995 M27-A 1997 M27-A M44-P 2003 M44-A 2004 Variáveis relevantes na padronização do ensaio Solubilização de drogas Tamanho do inóculo Meio de composição definida e tampão Temperatura do ensaio Tempo e critérios de leitura Avaliação da correlação clínica Estabelecimento de breakpoints breakpoints Sheehan et al, CID 17 (suppl 2):S , 1993 Rex et al, Clin Micr Rev 14:643-58, 2001 Rodrigues-Tudela JCM 39: ,

14 CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO Metodologia NCCLS: diluição em caldo NCCLS, Documento M27A2, 2002 Meio: RPMIRPMI-1640 tamponado c/mops INÓCULOS Inóculo: Inóculo: 0,5 a 2,5 x Inóculos cepas ATCC 103 cels/ml Temperatura:35ºC Tempo de leitura: 48 h Controle de esterilidade do meio Controle de crescimento dos inóculos MIC Critério de leitura: AnfoB: inibição total Azóis: inibição significativa (trailing) Descrição da Metodologia Antifungigrama: Antifungigrama: Método Etest Placa de petri 90mm para testar um único antifú antifúngico Placa 120mm para ate 3 antifú antifúngicos Fita plá plástica contendo os antifú antifúngicos RPMI % de agar suplementado com 2% de glicose Microrganismo puro com subcultivo recente (18(18-24h) 0.5 de McFarland (espectrofotômetro (espectrofotômetro)) Swab Temperatura de incubaç incubação: ão: C Tempo de incubaç ólicos e incubação: ão: 24h (az (azó 5FC) e 48h (anfotericina (anfotericina B) Crité Critério de leitura: leitura: inibiç inibição parcial (azó azólicos e 5FC) e total (anfotericina (anfotericina B) Sensibilidade Princípio de Difusão em Disco: Etest e Disco Difusão Ilustração esquemática do gradiente de concentração trailing trailing Disc o Sensibilidade Colombo et al, JCM 33(3):535-40,

15 Resistência Resistência Presença de Macrocolônias indicam subpopulações resistentes Colombo et al, JCM 33(3):535-40, 1995 Peyron et al, JCM 39:339-42, 2001 Disco Difusão DiscoDisco-difusão em ágar: ágar: DISCO DIFUSÃO Ótimos resultados com discos de fluconazol 25 Alta reprodutibilidade Boa correlação com o NCCLS Ótima µg em MuellerMueller-Hinton agar e 2% glicose Documento M44M44-A (aprovado (aprovado)) NCCLS 2004 performance no reconhecimento de isolados sensíveis Adicionar azul de metileno Meis et al Diag Microbiol Infect Dis 36:215-23, 2000 Hoffman & Pfaller, Pharmacotherapy, 21(8s): 111s-123s, 2001 Isolado sensível a fluconazol (presença de trailing) Cuidado na distribuição do inóculo (Halo de inibição 30 mm) Traili ng Traili ng Inadequado Adequado 15

16 Leituras de Ensaio de Disco-Difusão com fluconazol Métodos comerciais e alternativos ao Padrão Ouro Isolado Resistente, sem halo de inibição definido Isolado Sensível, com halo de inibição bem definido Colorimétricos - Sensititre YeastOne (EUA) - Asty (Japão) Mais antigos ATB Fungos (França) Mycostandard (França) Mycototal (França) Concentr. Reduzidas - Fungitest (França) - Candifast (Itália) - Integral System Yeasts (Itália) Difusão em Meios sólidos Difusão em disco Etest Microdiluição - EUCAST (Europeu) Referências Recomendadas marirchang@yahoo.com.br LACAZ, C. S.; PORTO, E.; MARTINS, J. E. C.; HEINS-VACCARI, E. M.; MELO, N. T. TRATADO DE MICOLOGIA MEDICA LACAZ.. 9. ed. São Paulo: Savier,, 2002 LARONE, D.H. Medically Important Fungi: a guide to identification: : 7 ed., Washington: ASM Press, 1995 SIDRIM, J.J.C. e MOREIRA, J.L.B. Fundamentos Clínicos e Laboratoriais de Micologia Médica.. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,, manuais/microbiologia/mod_7_2004.pdf 16