ROTEIROS PARA AS AULAS PRÁTICAS

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1 1 Instituto de Biociências IBB Departamento de Microbiologia e Imunologia Disciplina de Microbiologia Veterinária ROTEIROS PARA AS AULAS PRÁTICAS CICLO DE MICOLOGIA MEDICINA VETERINÁRIA Aluno (a): Botucatu 2012

2 2 CICLO DE MICOLOGIA ASPECTOS GERAIS DA CARACTERIZAÇÃO MACROSCÓPICA DAS COLÔNIAS FÚNGICAS A cultura de um microrganismo refere-se à capacidade que este tem de crescer em meios nutritivos artificiais. Esse crescimento é evidenciado macroscopicamente pela formação de uma unidade estrutural, denominada colônia. As colônias de determinados fungos geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através dos seus aspectos macro-estruturais de uma colônia, é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Sendo assim, o conhecimento do aspecto macro-morfológico das colônias é de extrema utilidade para a sugestão da identificação preliminar de determinada espécie fúngica. Na observação das características culturais de determinado fungo, devemos ressaltar os seguintes aspectos, segundo proposto por SIDRIM, JJC, BRILHANTE, RSN, ROCHA, MFG. (Cap. 8 - Aspectos Gerais de fungos filamentosos e dimórficos na apresentação filamentosa. In: SIDRIM, JJC, ROCHA, MFG. Micologia Médica a luz de autores contemporâneos. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004, p ), com algumas modificações: a) tamanho da colônia: pode ser bastante variável na dependência da quantidade e qualidade de substrato ofertado e da espécie fúngica. Por exemplo, os fungos zigomicetos apresentam velocidade de crescimento rápido e suas colônias tendem a ocupar toda a superfície da placa. O mesmo ocorre com as espécies do gênero Aspergillus quando cultivadas a 35 o C. Já o fungo Piedraia hortae apresenta crescimento muito lento, sendo sua colônia restrita ao centro da placa de Petri. b) bordas: na periferia das colônias fúngicas podem ser observados muitos desenhos que vão desde morfologias bem delimitadas até achados de projeções irregulares que lembram franjas. Além disso, também pode ser observada, nas bordas das colônias uma variação da coloração em relação ao centro. Esse achado é peça-chave para indicar o possível patógeno implicado, como por exemplo, nas colônias de Sporothrix schenckii, onde se observa que as bordas tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura. c) textura: é a característica mais importante utilizada na caracterização de uma colônia fúngica. A textura descreve a altura das hifas aéreas.

3 As colônias podem ser classificadas quanto à textura em diversos tipos: colônias algodonosas: aquelas que se assemelham com algodão, colônias furfuráceas: aquelas que lembram um punhado de substância farinácea espalhada em uma superfície, colônias penugentas: aquelas nas quais se evidenciam estruturas que lembram penas de aves dispersas na superfície do meio, colônias arenosas ou pulverulentas: aquelas que lembram areia de praia, colônias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido aveludado, colônias membranosas: aquelas que são bem aderidas à superfície do meio de cultura, recobrindo-o como uma película, colônias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriáceo, podendo ter superfície lisa ou irregular e sempre com ausência de filamento, ou seja, não algodonosa, colônias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual cremoso, sendo comumente observados no grupo das leveduras e da maioria das colônias bacterianas. d) relevo: diz respeito à topografia da colônia e pode ser: colônias cerebriformes: apresentam topografia de altos e baixos, fazendo circunvoluções que lembram as observadas no cérebro, colônias rugosas: nada mais são do que variações da cerebriforme, porém as pregas topográficas são menos evidentes, sendo as vezes radiais partindo do centro da colônia, colônias apiculadas: caracterizam-se pela presença de uma saliência na parte central lembrando um pequeno cume, colônias crateriformes: são aquelas que se aprofundam no meio de cultura, assumindo o aspecto de cratera. e) pigmentação: quando se fala em pigmentação de uma colônia fúngica deve-se levar em consideração alguns aspectos primários: - se o pigmento é encontrado na superfície da colônia ou no reverso, - se o pigmento é encontrado tanto na superfície quanto no reverso da colônia, - se o pigmento é ou não difusível no meio de cultura, 3

4 4 - se o pigmento está presente apenas nos esporos e ausente nas hifas, como observado na maioria das espécies de Aspergillus e Penicillium, ou em ambos (hifa e esporos), como observado nas espécies de fungos causadores de cromoblastomicose (Ex. Fonsecae pedrosoi). Observa-se uma grande variedade de cores na pigmentação fúngica que passam pelos tons de verde, amarelo, vermelho e castanho até ao preto. Portanto, a caracterização de uma colônia visando a auxiliar a identificação de determinada espécie fúngica, nada mais é do que um conjunto de características subjetivas, de expressão fenotípica, encontradas em determinada espécie. Dessa forma, deve-se sempre ter em mente que, embora a colônia fúngica possa sugerir, indicar e muitas vezes até acertar o caminho da identificação, não se deve, contudo, considera-la como única ou principal forma de identificação fúngica. Quando empregada como único critério pode levar a diagnósticos pouco precisos ou errôneos. PRÁTICA 1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS EXERCÍCIO 1 ASPECTOS MACROSCÓPICOS DE CULTURAS DE FUNGOS LEVEDURIFORME E FILAMENTOSO a) finalidade: auxiliar na identificação das colônias fúngicas. b) fundamento: As colônias de determinados microrganismos geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através do aspecto macromorfológico da colônia é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Entretanto, antes de se determinar as características da cultura de determinada colônia, é preciso certificar-se de que a cultura

5 5 está pura, ou seja, não deve ser evidenciada a presença de outros microrganismos através da observação de colônias diferentes em uma mesma placa ou tubo. Os estudos macroscópicos devem ser baseados nas seguintes características: tamanho, bordas, textura, relevo (no verso e reverso da colônia) e pigmentação. Exemplo: Frente: colônia de fungo (Filamentoso ou Leveduriforme), de textura (algodonosa, aveludada, pulverulenta, glabra, cremosa, etc), de relevo (cerebriforme, rugoso, crateriforme, apiculado, liso) de coloração (...), com bordos (regulares ou irregulares). Verso: (presença ou ausência) de fendas ou dobras, coloração (...), e (ausência ou presença) de pigmento difusível no meio de cultura. Descrever as características coloniais das culturas de Aspergillus sp. e Sacharomyces sp., conforme o modelo que segue. Aspergillus sp. Saccharomyces sp.

6 6 EXERCÍCIO 2 - ASPECTOS MICROSCÓPICOS DAS CULTURAS DE FUNGOS -COLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL ALGODÃO a) finalidade: O método de coloração com Lactofenol Azul Algodão é usado para preparar exame microscópico de colônias de fungos. É uma técnica que tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo e reprodutor de um fungo filamentoso, como também as características da célula vegetativa e reprodução por brotamento de leveduras. b) técnica: 1. Colocar uma gota de lactofenol azul-algodão sobre a lâmina. 2. Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alíquota da cultura de levedura, utilizando alça ou fio de platina. 3. Colocar o fragmento da cultura ou a alíquota de levedura sobre a gota de lactofenol.e homogeneizar. 4. Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio nas objetivas de 10 e 40 vezes. Desenhar as estruturas observadas: Aspergillus sp. Saccharomyces sp.

7 7 c) interpretação Na coloração com lactofenol azul algodão é possível observar que existem dois tipos morfológicos de fungos: as leveduras e os filamentos (bolores ou micélios). As leveduras são unicelulares e podem ter diferentes formatos (oval, circular, naveta, etc) e se reproduzem por brotamento (únicos ou múltiplos) ou por fissão (mais raro). Os bolores são fungos filamentosos possuindo hifas septadas ou cenocíticas. Na sua reprodução assexuada, é possível visualizar no micélio vegetativo os clamidósporos e artrósporos, e no micélio reprodutor, os esporos endógenos (esporangiósporos) em esporângios (estrutura fechada) e esporos exógenos (conidiósporos, também denominados simplesmente conídios ou conídias) em conidióforos. A vantagem desta técnica é de ser fácil e rápida a sua preparação, e a desvantagem é que em muitos fungos não se observa os órgãos de frutificação. CULTURA EM LÂMINA PARA FUNGOS FILAMENTOSOS (MICROCULTIVO) a) finalidade: Utiliza-se este método quando se deseja evidenciar, com o mínimo de deterioração, o arranjo das estruturas de frutificação e ornamentação para estudo morfológico detalhado. b) fundamento: Essa técnica é amplamente empregada para a confecção de lâminas de boa qualidade para fungos filamentosos. Consiste no preparo de placas de Petri contendo lâminas, as quais são apoiadas em um pequeno bastão de vidro e, após esterilização, coloca-se um bloco de 1-2 cm 3 de meio de cultura que servirá de substrato para o crescimento fúngico. A cultura cresce ao redor do bloco de Agar e também adere à lâmina e lamínula. Essa placa é incubada à temperatura ambiente até o aparecimento visual evidente do crescimento fúngico sob a lamínula. Se o micologista julgar necessário, antes de desmontar a preparação, pode-se fazer a observação da placa, em microscópio de campo claro em pequeno

8 8 aumento ou em estereomicroscópio, para se certificar que as estruturas de frutificação e ornamentação foram produzidas, caso contrário, aguarda-se mais alguns dias até que as mesmas sejam obtidas. Dessa maneira o micologista ganha tempo por não ter que refazer a técnica novamente, o que ocorre quando a placa é desmontada antes do tempo requerido pelo fungo para que as estruturas que auxiliarão na sua identificação sejam produzidas. A observação final se faz como descrito no item anterior sobre o preparo de lâmina com latofenol-azul-algodão. c) material: - Placas de Petri com lâminas dispostas sobre bastão de vidro em U ou V, esterilizadas; - Lamínulas; - meio de cultura; - lâmina e cabo de bisturi; - pinça; - alça de platina; - Água destilada esterilizada; - Algodão; - rolinho de filme plástico; - Formol; - pipeta; - Lactofenol-azul-algodão; - Culturas fúngicas d) técnica - Método de Riddel (Ridell RW. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycol 1950; 42: ). 1. Cortar o meio de cultura, com auxílio de lâmina de bisturi estéril, em pequenos fragmentos (± 1 cm 2 );

9 9 2. Colocar, com assepsia, um bloco do meio de cultura sobre a lâmina esterilizada; 3. Semear o fungo em cada lado do bloco do meio de cultura; 4. Colocar uma lamínula limpa e previamente flambada sobre o referido meio; 5. Adicionar, à placa, algodão embebido em água destilada estéril, a fim de manter a umidade no meio; 6. vedar a placa com filme plástico; 7. Incubar a temperatura ambiente e observar diariamente o crescimento; 8. Quando houver desenvolvimento satisfatório, submeter à ação do formol (adicionar 1,0 ml sobre o algodão e deixar agir por 1 hora); 9. Retirar a lamínula e o fragmento do meio; 10. Corar a lâmina, colocando-se uma gota de lactofenol-azulalgodão; 11. Depositar a lamínula e fechar com esmalte; 12. Observar ao microscópio os órgãos de frutificação.

10 10 PRÁTICA 2 LEVEDURAS DE IMPORTÂNCIA EM MEDICINA VETERINÁRIA 1 Descrever as características coloniais de Cryptococcus neoformans cultivado em agar Sabouraud (SAB) e Agar Semente de Niger (NSA). Observar as características microscópicas de esfregaço de cultura corado pelo Nankin. Cryptococcus neoformans (cultivado em Agar Sabouraud) Cryptococcus neoformans (cultivado em Agar Semente de Niger) coloração pela tinta da China (Nankin)

11 11 2 Diferenciação entre C. neoformans e C. gattii pelo método de CGB (Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol) Teste CGB positivo Teste CGB negativo Cor: Espécie: Cor: Espécie: 3 - Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas de Candida spp. Candida spp. 4 - Diferenciação de Candida albicans de outras espécies de Candida pelo método de CHROMagar-Candida. Observar o crescimento das colônias e diferenciar pela coloração: Candida albicans cor: Candida tropicalis cor: Candida spp. cor:

12 Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas de Malassezia pachydermatis e Trichosporon asahii: Malassezia pachydermatis Trichosporon asahii

13 13 PRÁTICA 3 FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES CUTÂNEAS - DERMATÓFITOS EXERCÍCIO 1 - CULTURA DE PÊLOS DE ANIMAIS SUSPEITOS DE DERMATOFITOSE EM PLACAS DE AGAR MYCOSEL (MYC) e SABOURAUD (SAB) a) Finalidade: esta técnica é utilizada para pesquisar fungos causadores de micoses cutâneas, presentes nos pêlos, escamas de pele e unhas de humanos e animais. b) Coleta do Material Clínico 1. Pêlos: com auxílio de pinça estéril, coletar os pêlos da área afetada, preferencialmente pelas bordas da lesão, e acondicioná-los em placas de Petri estéril; 2. Pele: com auxílio de lâmina de bisturi estéril, fazer raspado de pele da área afetada, preferencialmente dos bordos da lesão, e acondicionar o material em placas de Petri estéril; 3. Unhas: com auxílio de lâmina de bisturi estéril, espátula ou punch, coletar amostra da porção interior da lesão e acondicioná-la em placa de Petri estéril. c) Processamento Laboratorial do Material Clínico

14 14 1. Abrir cuidadosamente a placa de Petri próximo ao bico de Bunsen, 2. Com o auxílio de uma pinça ou alça estéril, colocar a amostra em contato com o meio de cultura MYC e SAB, 3. Identificar corretamente as placas com o número da amostra, meio de cultura e data, 4. Vedar as placas com filme plástico, 5. Incubar as placas em estufa à 25ºC, por um período de 7-10 dias. d) Interpretação Observar as placas semeadas com os pêlos e verificar se houve o crescimento de fungos dermatófitos. Selecione uma colônia isolada em MYC e outra em SAB e faça a descrição macroscópica no quadro abaixo. MYC SAB

15 15 Prepare lâminas coradas com LFAA das culturas selecionadas e observe ao microscópio. Desenhe as estruturas observadas. MYC SAB Resultado: EXERCÍCIO 2 - DESCREVER AS CARACTERÍSITICAS MACROSCÓPICAS DAS CULTURAS Microsporum canis Microsporum gypseum

16 16 Trichophyton mentagrophytes Epidermophyton flocosum

17 17 PRÁTICA 4 FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SUBCUTÂNEAS 1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: Sporothrix spp. (Fase Micelial) Sporothrix spp. (Fase Leveduriforme)

18 18 Pythium insidosum Coloração com LFAA produção de esporângio em material vegetal EXERCÍCIO 3 - OBSERVAR A PREPARAÇÃO HISTOLÓGICA, CORADA COM PRATA, DE LESÃO DE PACEINTE COM LACAZIOSE. DESENHE AS ESTRUTURAS VISUALIZADAS.

19 19 PRÁTICA 5 FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SISTÊMICAS 1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Micelial) Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Leveduriforme) Histoplasma capsulatum (Fase Micelial)

20 20 Histoplasma capsulatum (Fase Leveduriforme) Você já agradeceu aos fungos hoje?!