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- Thiago Beretta Rocha
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1 BIO-FLASH CMV IgG testes BIO-FLASH CMV IgG é um ensaio imunológico quimiluminescente de dois passos totalmente automatizado para a determinação semi-quantitativa de anticorpos IgG anti-citomegalovírus em soro ou plasma humano com o instrumento BIO-FLASH. Sumário O citomegalovírus (CMV) humano pertence à família dos Herpesvírus, que também inclui os vírus Herpes simplex tipo 1 e 2, o vírus da Varicela Zoster e o vírus Epstein-Barr. Uma característica comum destes vírus é que podem causar infecções latentes. 1 O CMV é um agente ubíquo que normalmente infecta indivíduos de diversas áreas geográficas e econômicas. A maior parte da população é infectada pelo vírus em algum momento da vida sendo que nos Estados Unidos 81% dos indivíduos maiores de 35 anos foram expostos ao vírus. 2 Uma característica do CMV consiste em que depois da infecção primária, o vírus pode persistir em forma latente durante muito tempo e pode reativar-se em um dado momento. A infecção, re-infecção ou reativação do CMV em adultos normais e crianças geralmente é leve ou assintomática. No entanto, pode haver casos clinicamente graves em pacientes imunodeprimidos e com câncer ou como resultado de uma infecção intra-uterina ou peri-natal. 1-8 As transfusões de sangue e o transplante de órgãos são causas importantes de infecção por CMV em pacientes imunodeprimidos. 9 É possível prevenir a transmissão de CMV a receptores de órgãos através da seleção de doadores, que devem ser soronegativos de anticorpos anti-cmv. Outra causa importante de patologia em pacientes imunodeprimidos é a reativação de vírus latentes endógenos, devido a terapias imunossupressoras. 10 O diagnóstico sorológico da infecção por CMV pode ser realizado mediante a detecção de um aumento significativo de anticorpos IgG específicos para CMV em soros pareados e pela detecção de anticorpos IgM específicos para CMV. Os testes sorológicos para a detecção de anticorpos anti-cmv proporcionam uma informação valiosa na determinação da existência de uma infecção prévia, no diagnóstico de uma infecção ativa ou recente e no exame de sangue para realizar transfusões a recém-nascidos e a receptores imunodeficientes. 11 Princípio Quando as micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH CMV IgG são misturadas e incubadas com a amostra, se esta contém anticorpos específicos anti-cmv, estes se combinam com os antígenos de CMV que recobrem as micropartículas. Depois de uma separação magnética e lavagem para eliminar resíduos da amostra, se adiciona um traçador que consiste em um anticorpo monoclonal anti-igg humana marcado com isoluminol que se une aos anticorpos IgG anti-cmv capturados pelas micropartículas. Depois de uma segunda incubação, separação magnética e lavagem, se adicionam os reagentes que ativam a reação quimiluminescente. O luminômetro do BIO-FLASH mede a luz emitida como unidades relativas de luz (URL) que são diretamente proporcionais à concentração de IgG anti-cmv da amostra. O BIO-FLASH utiliza um método de redução de dados com ajuste a uma curva logística de 4 parâmetros (4PLC) para gerar uma Curva de Calibração Mestre (CCM). Esta curva vem predefinida, depende do lote e é guardada no instrumento através do código de barras do cartucho. Com a leitura dos calibradores (que se fornecem em um kit separado), a CCM predefinida se transforma em uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT) nova e específica para o instrumento. As concentrações dos calibradores estão incluídas nos códigos de barras dos tubos dos calibradores. Esquema da reação: LER ALTERAÇÕES DESTACADAS Ativadores (Triggers) URL Partícula magnética Amostra Traçador Emissão de luz
2 Componentes Cartucho de reagentes O kit BIO-FLASH CMV IgG contém um cartucho de reagentes para 50 determinações (REF ). Nota: O desenho do cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Desenho CE ) Composição do cartucho de reagentes: O cartucho está composto por 4 frascos que contêm: A. 1 frasco cilíndrico de suspensão de micropartículas recobertas com antígeno de CMV em tampão de glicina. Contém < 0,1% de azida sódica. B. 1 frasco de tampão de ensaio. Contém < 0,1% de azida sódica. C. 1 frasco opaco de traçador que consiste em anticorpo monoclonal murino anti-igg humana marcado com isoluminol. Contém < 0,1% de azida sódica. D. 1 frasco vazio. Preparação Veja a figura seguinte. Cartucho: as micropartículas sedimentam durante o transporte e o armazenamento, por isso é preciso misturá-las para voltar a ressuspendê-las. Antes de utilizar o cartucho pela primeira vez, inverta-o suavemente 30 vezes evitando a formação de espuma (as bolhas podem fazer com que os sensores de líquido do instrumento dêem leituras errôneas). Comprove que as micropartículas estejam totalmente em suspensão. Se não for assim, continue invertendo o cartucho até que as partículas se ressuspendam totalmente. Se as micropartículas não se ressuspendem ou detecta que o pré-cinto dos reagentes está furado, NÃO UTILIZE O CARTUCHO. Uma vez que as micropartículas estejam em suspensão, coloque o cartucho sobre uma superfície sólida e retire com cuidado a lingüeta vermelha de segurança para o transporte. Mantendo o cartucho sobre a superfície sólida, aperte as duas abas situadas nos dois lados da tapa perfurante (peça cinza) e pressione a parte superior do cartucho até que fique em posição de bloqueio. Uma vez em posição de bloqueio, as abas têm que ficar ocultas. Não inverta o cartucho aberto. Deixe o cartucho repousar durante 5 minutos antes de carregá-lo no instrumento. Uma vez carregado o cartucho, o instrumento mistura seu conteúdo de forma automática em intervalos periódicos.
3 Precauções Os reagentes BIO-FLASH são para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profissionais. A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar os restos de reagentes, fazê-lo em abundante volume de água. ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO. Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Por favor, não reutilize nem reintroduza reagentes nos cartuchos ou frascos. Classe de perigo Não classificado. Advertências de perigo Nenhuma. Recomendações de prudência P280: Usar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial. P : SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contato, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar. Coleta e conservação das amostras Usar soro fresco (também se pode utilizar tubos com gel separador de soro) ou plasma (EDTA, Li-heparina, Li-heparina em tubo com gel separador, Na-heparina e Na-citrato). Outros anticoagulantes devem ser comprovados antes de utilizar-se. Os anticoagulantes líquidos como o Na-citrato exercem um efeito de diluição e podem reduzir a concentração de amostras de pacientes. As amostras não devem ser inativadas por calor. As partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Nas diretrizes CLSI H18-A3 e H21-A5 encontrará mais informação sobre o manuseio, o transporte, o processamento e a conservação das amostras. Soro As amostras de soro podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. As amostras podem congelar-se/descongelar-se no máximo 3 vezes. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Plasma As amostras de plasma podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. Descongelar o plasma a 37 C. Descongelar as amostras somente uma vez. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Volume de amostra O volume de amostra necessário para realizar um único teste com BIO-FLASH CMV IgG varia em função do tipo de recipiente que se utilize. Um teste requer ao menos 10 µl mais o volume morto, que é de 200 µl se é utilizada a copa de amostra recomendada (REF ). Outros materiais Os seguintes materiais não são fornecidos com o cartucho de reagentes e devem ser comprados por separado. REF REF BIO-FLASH CMV IgG Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH CMV IgG Controls (Controles) Leia com atenção as instruções correspondentes se deseja mais informação. Não utilize outros calibradores. A informação que necessita o instrumento BIO-FLASH para calibrar o ensaio BIO-FLASH CMV IgG está incluída nos códigos de barras dos tubos. Utilizar controles de outros fabricantes pode dar lugar a resultados imprevistos. Assegure-se de que no instrumento BIO-FLASH haja uma quantidade suficiente dos seguintes consumíveis antes de processar amostras, calibradores ou controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) Nota: O desenho das cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Desenho CE ) REF BIO-FLASH Triggers (Ativadores) REF BIO-FLASH System Rinse (Solução do sistema)
4 O seguinte consumível é necessário se a opção de re-run automático for ativada. REF BIO-FLASH Sample Diluent (Diluente das amostras) Instrumento / realização do ensaio No Manual do Usuário do BIO-FLASH encontrará as instruções completas para realizar o ensaio. Calibração O código de barras do cartucho contém uma Curva de Calibração Mestre (CCM) que é válida para o lote de reagentes. No entanto, para todos os reagentes se necessita uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT), que é específica para cada lote e válida até a data de validade do lote. É preciso obter uma nova CCT quando os resultados dos controles saiam fora do intervalo de aceitação ou quando se tenha realizado ajustes no instrumento. Leia com atenção o Manual do Usuário do BIO-FLASH para configurar uma CCT. Controle de qualidade Para realizar um programa completo de controle de qualidade é recomendável passar dois níveis de controles. Os controles BIO-FLASH CMV IgG negativo e positivo foram desenhados para tal programa. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça a sua própria média e desvio padrão e um programa de controle de qualidade para monitorizar seus resultados. Os controles devem ser analisados ao menos cada 24 horas por dia de utilização. Se os controles estão fora do intervalo pode ser necessário recalibrar o instrumento. No Manual do Usuário do instrumento encontrará mais informação. Para a identificação e resolução de situações anormais de controle de qualidade, consulte Westgard et al. 12 Conservação e estabilidade Os reagentes que não tenham sido abertos se mantêm estáveis até a data de validade indicada no rótulo do cartucho se forem conservados a 2-8 C em posição vertical. Uma vez aberto, a estabilidade do cartucho carregado no instrumento BIO-FLASH ou guardado a 2-8 C é de 5 semanas. Rastreabilidade de calibradores e controles Dado que não há um standard internacional disponível, os resultados são expressos em UA/mL e foram estabelecidos por meio de múltiplos ensaios com o instrumento BIO-FLASH utilizando lotes específicos de reagentes, com referência a padrões internos. Interpretação de resultados A quantidade de analito em cada amostra se determina a partir da luz emitida (URL) por interpolação na Curva de Calibração de Trabalho guardada. A determinação de IgG anti-cmv com o ensaio BIO-FLASH CMV IgG ajuda a avaliar o estado imunitário do paciente: As amostras com uma concentração < 8,0 UA/mL são consideradas não reativas (negativas). As amostras com uma concentração 8,0 e < 10,0 UA/mL são consideradas indeterminadas (zona cinza). As amostras que se interpretem como indeterminadas deverão ser re-analisadas Se ao repetir se obtém um resultado indeterminado, deve-se reportar como tal e deve ser realizado outro ensaio com um método alternativo ou obter e testar uma segunda amostra. As amostras com uma concentração 10,0 UA/mL são consideradas reativas (positivas) para IgG anti-cmv. Um resultado positivo indica uma infecção passada ou aguda por CMV. Um aumento significativo na concentração de anticorpos IgG anti-cmv em amostras pareadas tomadas com intervalo de 2-4 semanas, analisadas ao mesmo tempo, pode ser indicativo de uma infecção recente ou de reativação. Não obstante, para o diagnóstico recomenda-se acompanhar este procedimento com a detecção do ADN viral em leucócitos ou no sangue mediante técnicas de amplificação e com a detecção de anticorpos IgM específicos anti-cmv. O ensaio BIO-FLASH CMV IgM REF é adequado para este fim. Limitações O resultado de uma única amostra não é suficiente para diagnosticar uma infecção recente por CMV ou uma reativação. Portanto, além dos resultados de BIO-FLASH CMV IgG é preciso levar em conta outros dados como, por exemplo, a sintomatologia, a história clínica, os resultados de outras provas, e toda a informação adicional relevante. O ensaio é semi-quantitativo. Não dilua as amostras que se encontrem dentro dos limites de trabalho.
5 Se a opção de re-run automático estiver ativada, algumas das amostras com valores superiores ao limite superior podem reportar resultados inferiores aos esperados. Resultados esperados A prevalência da infecção por CMV em populações adultas varia enormemente em diversas áreas do mundo, e inclusive entre diferentes grupos socioeconômicos e etários na mesma área geográfica. Em um estudo interno, a prevalência de soro-positividade encontrada em 642 amostras aleatórias de doadores de sangue de Barcelona, Espanha, se situava em 70%. Cerca de 50% dos adultos jovens da Europa Central estão infectados por CMV. Na população de idade mais avançada, a soro-positividade alcança 70-80%. 13 Características funcionais Nota: os seguintes dados são representativos; os resultados em experimentos isolados podem variar respeito a estes dados. Comparação de métodos BIO-FLASH CMV IgG foi avaliado em estudos comparativos com outros ensaios comerciais. Avaliação interna Foi analisado com BIO-FLASH CMV IgG um painel de amostras de distinta procedência que incluía soros positivos e negativos de anticorpos IgG anti-cmv e os resultados foram comparados com os obtidos com um método de EIA CMV IgG comercial. Os resultados indeterminados não se tiveram em conta para os cálculos. Método de referência BIO-FLASH CMV IgG NEG POS Total IND NEG POS Total Foram obtidos os seguintes resultados iniciais de sensibilidade e especificidade relativas e concordância global: Sensibilidade relativa Especificidade relativa Concordância global ,8% 98,7% a 100,0% 100,0% 98,2% a 100,0% 99,8% 99,1% a 100,0% Foram utilizados outros métodos comerciais de CMV IgG para provar amostras deste painel e alguns dos resultados discrepantes se resolveram. O resumo dos resultados de consenso, excluindo as 5 amostras indeterminadas com BIO-FLASH CMV IgG e as 3 amostras para as quais não se chegou a um consenso, se mostra na seguinte tabela: Consenso BIO-FLASH CMV IgG NEG POS Total NEG POS Total Em relação ao consenso forem obtidos os seguintes resultados de sensibilidade, especificidade e concordância global: Sensibilidade vs. consenso Especificidade vs. consenso Concordância vs. consenso ,8% 98,7% a 100,0% 100,0% 98,1% a 100,0% 99,8% 99,1% a 100,0% Avaliação externa Foi realizada uma avaliação externa no Servei de Microbiologia do Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (Espanha). As amostras foram caracterizadas mediante outro método MEIA CMV IgG comercial e analisadas com BIO-FLASH CMV IgG. Os resultados indeterminados não foram considerados para os cálculos.
6 Método de referência BIO-FLASH CMV IgG NEG POS Total IND NEG POS Total Foram obtidos os seguintes resultados iniciais de sensibilidade e especificidade relativas e concordância global: Sensibilidade relativa Especificidade relativa Concordância global ,4% 96,0% a 99,6% 98,3% 95,0% a 99,6% 98,3% 96,6% a 99,3% As amostras discrepantes foram analisadas com um método ELFA CMV IgG comercial. Depois do ensaio adicional foram obtidos os seguintes resultados finais de sensibilidade, especificidade e concordância global: Sensibilidade final Especificidade final Concordância global final ,4% 96,0% a 99,6% 98,8% 95,8% a 99,9% 98,6% 96,9% a 99,5% Painel SeraCare-BBI Foi analisado o painel comercial de BBI painel de título misto anti-cmv PTC202, composto de 11 amostras caracterizadas. Os resultados do ensaio BIO-FLASH CMV IgG concordaram em todos os casos com o consenso de resultados da maioria dos fabricantes. Painel CDC O painel de soros CMV IgG do CDC composto por 53 amostras de soro positivas e 47 amostras de soro negativas foi analisado com o ensaio BIO-FLASH CMV IgG com um resultado de sensibilidade e especificidade de 100,0%. Um resultado indeterminado de BIO-FLASH não foi considerado para os cálculos. Precisão A precisão intra-ensaio e total (ensaio a ensaio e dia a dia) foram avaliadas em múltiplos ensaios, conforme as diretrizes CLSI EP05-A. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte: Média (UA/mL) CV% (Intra-ensaio) CV% (Total) Controle negativo 5,1 7,3 13,3 Controle positivo 121,9 7,2 10,9 Ao redor do valor de corte 12,2 6,8 10,0 Reprodutibilidade Foi avaliada a reprodutibilidade entre réplicas, entre lotes e entre instrumentos. Os resultados se apresentam na tabela seguinte: Pendente Intersecção R Réplica 2 vs. Réplica ,01 1,00 a 1,04 0,00-0,53 a 0,46 1,00 0,99 a 1,00 Lote 2 vs. Lote ,08 1,05 a 1,12-0,08-1,14 a 0,05 0,99 0,98 a 1,00 Instrumento 2 vs. Instrumento ,04 1,02 a 1,08 0,00-2,01 a 0,30 0,99 0,99 a 1,00 Interferências Estudos segundo as diretrizes CLSI EP7-A demonstraram que as seguintes substâncias potencialmente interferentes não alteram os resultados de BIO-FLASH CMV IgG: Substância potencialmente interferente Concentração % Interferência Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indireta 18 mg/dl 10 Bilirrubina direta 18 mg/dl 10 Triglicérides 1300 mg/dl 10
7 Reatividade cruzada Quando foram analisadas 102 amostras com potencial de produzir reação cruzada com o ensaio BIO-FLASH CMV IgG e os resultados foram comparados com ensaios comerciais de CMV IgG, foi obtida a seguinte concordância: Reação cruzada potencial Concordância IgG contra rubéola 4/4 Anti-Toxo IgG (anticorpos contra Toxoplasma gondii) 8/8 Anti-HIV (anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana) 6/6 HAMA (anticorpo humano anti-murino) 5/5 SLE (lupus eritematoso sistêmico) 1/1 ANA (anticorpos anti-nucleares) 10/10 Anti-EBV (anticorpos contra o vírus Epstein-Barr) 4/5 Anti-PV B19 (anticorpos contra Parvovirus B19) 6/6 Anti-HSV 1 (anticorpos contra o vírus Herpes simplex tipo 1) 4/5 Anti-VZV (anticorpos contra o vírus da Varicela Zoster) 4/5 Paraproteínas IgG e IgM 6/6 IgG e IgM elevadas 5/5 Anticorpos heterófilos 4/4 RF (Fator Reumatóide) 10/10 Mulheres grávidas (multíparas incluídas) 22/22 Limite de detecção O limite de detecção (LD), determinado segundo as diretrizes CLSI EP17-A, se situa em 0,3 UA/mL. Limite de quantificação O limite de quantificação (LQ), determinado segundo as diretrizes CLSI EP17-A, se situa em 0,7 UA/mL. Linearidade O ensaio BIO-FLASH CMV IgG é semi-quantitativo e tem um intervalo de trabalho entre 0,7 e 800 UA/mL. Não obstante, o intervalo de trabalho pode ser ampliado até UA/mL por diluição se a opção de re-run automático for ativada. Consulte o Manual do Usuário do BIO-FLASH para ativar a opção de re-run automático.
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