LER ALTERAÇÕES DESTACADAS

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1 BIO-FLASH anti-hcv testes BIO-FLASH anti-hcv é um ensaio imunológico quimiluminescente de dois passos totalmente automatizado para a determinação de anticorpos IgG contra o vírus da hepatite C (HCV) em soro ou plasma humano com o instrumento BIO-FLASH. Sumário A hepatite C é uma infecção viral do fígado que foi denominada como hepatite não A, não B de transmissão parenteral até 1989 quando foi identificado o agente causal. A descoberta e caracterização do vírus da hepatite C (HCV) levou à compreensão do seu papel primordial na hepatite pós-transfusional e da sua tendência em induzir infecção persistente. 1 O HCV é um vírus de RNA de cadeia simples de sentido positivo, que possui envelope. O vírus infecta as células do fígado onde pode causar inflamação severa com complicações a longo prazo. 2 O início da doença é geralmente insidioso, com anorexia, vago desconforto abdominal, náuseas e vômitos, febre e fadiga, progredindo para icterícia em cerca 25% dos pacientes. Das pessoas expostas à hepatite C, cerca de 40% se recuperam totalmente, mas os restantes, tenham ou não sintomas, tornam-se portadores crônicos. Destes, 20% desenvolvem cirrose. Dos que apresentam cirrose, até 20% desenvolvem câncer hepático. 3,4 O HCV é a principal causa de hepatite aguda e doença crônica hepática, incluindo cirrose e câncer de fígado. Globalmente, estima-se que 170 milhões de pessoas estejam cronicamente infectadas com o HCV e que entre 3 e 4 milhões de pessoas são infectadas cada ano por primeira vez. O HCV se dissemina primordialmente por contato direto com sangue humano. As principais causas de infecção por HCV no mundo são as transfusões de sangue não controladas e a re-utilização de agulhas e seringas que não foram adequadamente esterilizadas. 5 A presença de anticorpos anti-hcv não pode ser confirmada até semanas depois da exposição, criando um período de janela de soronegatividade e potencial infecciosidade. 6 Princípio Quando as micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH anti-hcv são misturadas e incubadas com a amostra, se esta apresenta anticorpos específicos anti-hcv, estes se combinam com os antígenos de HCV que recobrem as micropartículas. Depois de uma separação magnética e lavagem para eliminar resíduos da amostra, se adiciona um traçador que consiste em um anticorpo monoclonal anti-igg humana marcado com isoluminol que se une aos anticorpos IgG anti-hcv capturados pelas micropartículas. Depois de uma segunda incubação, separação magnética e lavagem, se adicionam os reagentes que ativam a reação quimiluminescente. O luminômetro do BIO-FLASH mede a luz emitida como unidades relativas de luz (URL) que são diretamente proporcionais à concentração de IgG anti-hcv da amostra. O BIO-FLASH utiliza um método de redução de dados com ajuste a uma curva logística de 4 parâmetros (4PLC) para gerar uma Curva de Calibração Mestre (CCM). Esta curva vem predefinida, depende do lote e é guardada no instrumento através do código de barras do cartucho. Com a leitura dos calibradores (que se fornecem em um kit separado), a CCM predefinida se transforma em uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT) nova e específica para o instrumento. As concentrações dos calibradores estão incluídas nos códigos de barras dos tubos dos calibradores. Esquema da reação: LER ALTERAÇÕES DESTACADAS Ativadores (Triggers) Ativadores (Triggers) URL URL Partícula magnética Amostra Traçador Emissão de luz

2 Componentes Cartucho de reagentes O kit BIO-FLASH anti-hcv contém um cartucho de reagentes para 100 determinações (REF ). Nota: O desenho do cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Desenho CE ) Composição do cartucho de reagentes: O cartucho está composto por 4 frascos que contêm: A. 1 frasco cilíndrico de suspensão de micropartículas recobertas com antígenos recombinantes de HCV que representam os seguintes epitopos de HCV: core, NS3, NS4 e NS5. B. 1 frasco de tampão de ensaio. Contém < 0,1% de azida sódica e 1,0% de Triton X-100. C. 1 frasco opaco de traçador que consiste em anticorpo monoclonal murino anti-igg humana marcado com isoluminol. Contém < 0,1% de azida sódica e 8,0% de etilenoglicol. D. 1 frasco com diluente de amostra. Contém < 0,1% de azida sódica Preparação Veja a figura seguinte. Cartucho: as micropartículas sedimentam durante o transporte e o armazenamento, por isso é preciso misturá-las para voltar a ressuspendê-las. Antes de utilizar o cartucho pela primeira vez, inverta-o suavemente 30 vezes evitando a formação de espuma (as bolhas podem fazer com que os sensores de líquido do instrumento dêem leituras errôneas). Comprove que as micropartículas estejam totalmente em suspensão. Se não for assim, continue invertendo o cartucho até que as micropartículas se ressuspendam totalmente. Se as micropartículas não se ressuspendem ou detecta que o pré-cinto dos reagentes está furado, NÃO UTILIZE O CARTUCHO. Uma vez que as micropartículas estejam em suspensão, coloque o cartucho sobre uma superfície sólida e retire com cuidado a lingüeta vermelha de segurança para o transporte. Mantendo o cartucho sobre a superfície sólida, aperte as duas abas situadas nos dois lados da tapa perfurante (peça cinza) e pressione a parte superior do cartucho até que fique em posição de bloqueio. Uma vez em posição de bloqueio, as abas têm que ficar ocultas. Não inverta o cartucho aberto. Deixe o cartucho repousar durante 5 minutos antes de carregá-lo no instrumento. Uma vez carregado o cartucho, o instrumento mistura seu conteúdo de forma automática em intervalos periódicos.

3 Precauções Os reagentes BIO-FLASH são para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profissionais. O tampão de ensaio contém azida sódica < 0,1% e Triton X-100 1,0%. Nocivo por ingestão (R 22). Em caso de ingestão, procurar assistência médica (S 46). O traçador contém azida sódica < 0,1% e etilenoglicol 8,0%. Nocivo por ingestão (R 22). Em caso de ingestão, procurar assistência médica (S 46). A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar os restos de reagentes, fazê-lo em abundante volume de água. ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO. Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Por favor, não reutilize nem reintroduza reagentes nos cartuchos ou frascos. Coleta e conservação das amostras Usar soro fresco (também se pode utilizar tubos com gel separador de soro) ou plasma (EDTA, Li-heparina, Na-heparina, citrato e ACD). Outros anticoagulantes devem ser comprovados antes de utilizar-se. As amostras não devem ser inativadas por calor. As partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Nas diretrizes CLSI H18-A3 e H21-A5 encontrará mais informação sobre o manuseio, o transporte, o processamento e a conservação das amostras. Soro As amostras de soro podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. As amostras podem congelar-se/descongelar-se no máximo 3 vezes. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Plasma As amostras de plasma podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. Descongelar o plasma a 37 C. Descongelar as amostras somente uma vez. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Volume de amostra O volume de amostra necessário para realizar um único teste com BIO-FLASH anti-hcv varia em função do tipo de recipiente que se utilize. Um teste requer ao menos 26 µl mais o volume morto, que é de 200 µl se é utilizada a copa de amostra recomendada (REF ). Outros materiais Os seguintes materiais não são fornecidos com o cartucho de reagentes e devem ser comprados por separado. REF REF BIO-FLASH anti-hcv Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH anti-hcv Controls (Controles) Leia com atenção as instruções correspondentes se deseja mais informação. Não utilize outros calibradores. A informação que necessita o instrumento BIO-FLASH para calibrar o ensaio BIO-FLASH anti-hcv está incluída nos códigos de barras dos tubos. Utilizar controles de outros fabricantes pode dar lugar a resultados imprevistos. Assegure-se de que no instrumento BIO-FLASH haja uma quantidade suficiente dos seguintes consumíveis antes de processar amostras, calibradores ou controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) Nota: O desenho das cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Desenho CE ). REF REF BIO-FLASH Triggers (Ativadores) BIO-FLASH System Rinse (Solução do sistema) Instrumento / realização do ensaio No Manual do Usuário do BIO-FLASH encontrará as instruções completas para realizar o ensaio.

4 Calibração O código de barras do cartucho contém uma Curva de Calibração Mestre (CCM) que é válida para o lote de reagentes. No entanto, para todos os reagentes se necessita uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT), que é específica para cada lote e válida até a data de validade do lote. É preciso obter uma nova CCT quando os resultados dos controles saiam fora do intervalo de aceitação ou quando se tenha realizado ajustes no instrumento. Leia com atenção o Manual do Usuário do BIO-FLASH para configurar uma CCT. Controle de qualidade Para realizar um programa completo de controle de qualidade é recomendável passar dois níveis de controles. Os controles BIO-FLASH anti-hcv negativo e positivo foram desenhados para tal programa. Os controles devem ser analisados ao menos cada 24 horas por dia de utilização. Assegure-se de que os resultados dos controles se encontram dentro dos limites de aceitação já que, se não for assim, pode ser indicativo de resultados não válidos, ante os quais o usuário deverá tomar medidas corretivas. Neste caso, verifique todos os resultados obtidos desde a última comprovação de controle de qualidade aceitável do analito em questão. Pode ser necessário re-calibrar o instrumento. No Manual do Usuário do instrumento encontrará mais informação. Para a identificação e resolução de situações anormais de controle de qualidade, consulte Westgard et al. 7 Conservação e estabilidade Os reagentes que não tenham sido abertos se mantêm estáveis até a data de validade indicada no rótulo do cartucho se forem conservados a 2-8 C em posição vertical. Uma vez aberto, a estabilidade do cartucho carregado no instrumento BIO-FLASH ou guardado a 2-8 C é de 6 semanas. Interpretação de resultados A quantidade de analito em cada amostra se determina a partir da luz emitida (URL), por interpolação na Curva de Calibração de Trabalho guardada. Os resultados obtidos com o BIO-FLASH anti-hcv são expressos como S/CO (Sinal da amostra/valor de corte). Como o ensaio é qualitativo, o valor numérico do resultado só é indicativo da quantidade de anticorpo presente. A determinação de anti-hcv utilizando o ensaio BIO-FLASH anti-hcv é interpretada como segue: As amostras com resultado < 0,90 S/CO são consideradas não reativas (negativas). As amostras com resultado 0,90 e < 1,00 S/CO são consideradas indeterminadas (zona cinza). As amostras com resultado 1,00 S/CO são consideradas reativas (positivas). Amostras com resultado inicialmente reativo ou indeterminado devem ser re-analisadas por duplicado. Se na repetição ambos os valores são inferiores a 0,90 a interpretação final do ensaio é de resultado negativo para anticorpos anti-hcv. Se algum dos resultados é positivo ou indeterminado, a amostra deve ser investigada com um teste suplementar para confirmar o resultado. Um resultado repetidamente positivo é indicativo de infecção pelo HCV. Limitações O resultado de uma única amostra não é suficiente para diagnosticar uma infecção por HCV. Portanto, os resultados de BIO-FLASH anti-hcv devem ser utilizados em conjunção com outros dados como, por exemplo, a sintomatologia, a historia clínica, os resultados de outras provas, e toda a informação adicional relevante. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição ou infecção por HCV. Como em todos os ensaios imunológicos sensíveis, existe a possibilidade de obter resultados positivos que não se repitam. Resultados esperados A incidência do HCV em escala global não é bem conhecida, porque a infecção aguda é geralmente assintomática. 5 Entre 2 e 4 milhões de pessoas podem estar cronicamente infectadas nos Estados Unidos, 5 a 10 milhões na Europa e cerca de 12 milhões na Índia e não sabem que estão infectadas. Cerca de novos casos ocorrem anualmente nos EUA e na Europa Ocidental e cerca de no Japão. Destes, aproximadamente 25% são sintomáticos, mas 60-80% pode evoluir para doença hepática crônica, dos quais 20% desenvolvem cirrose. Cerca de 5% a 7% dos pacientes podem vir a morrer das conseqüências da infecção. 1, 2 A maioria dos países europeus registra uma prevalência do HCV na população geral entre 0,5 e 2%. 1 A OMS estima que cerca de 3% da população mundial tenha sido infectada com o HCV e que existem mais de 170 milhões de portadores crônicos que estão em risco de desenvolver cirrose hepática e / ou câncer de fígado. 3 Índices muito altos de presença de anticorpos HCV (> 70%) foram descritos em usuários de drogas injetáveis e hemofílicos. Prevalências médias de 20 a 30% tem sido observadas em pacientes que recebem hemodiálise. 1 A incidência vem declinando desde que a transmissão através de produtos derivados de sangue foi reduzida a quase zero e que precauções universais são seguidas em contextos médicos. 3

5 Características funcionais NOTA: os seguintes dados são representativos; os resultados em experimentos isolados podem variar respeito a estes dados. Especificidade A avaliação de especificidade foi baseada em testar amostras de soro de doadores de sangue não selecionados, incluindo doadores de primeira vez e de pacientes internados. Foram testadas em total 5022 amostras frescas de soro, não selecionadas, provenientes de dois bancos de sangue, 3509 das quais eram do Banc de Sang i de Teixits de Catalunya (Espanha), e 1513 do Centro EFS Atlantique de Tours (França). Além disso, 250 amostras não selecionadas de soro de pacientes internados no Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Espanha) foram também avaliadas. As amostras "repetidamente reativas" foram re-analisadas usando um teste suplementar. A especificidade foi então calculada, com os resultados mostrados na tabela seguinte: Amostras testadas Inicialmente reativas (IR) Repetidamente reativas (RR) RR indeterminadas RR positivas confirmadas Especificidade n n n n n % Doadores de sangue ,7 Pacientes hospitalizados Sensibilidade A sensibilidade foi avaliada testando amostras comprovadamente positivas anti-hcv. A sensibilidade foi calculada para cada grupo de amostras, obtendo-se os resultados mostrados na tabela seguinte: Amostras Amostras Sensibilidade testadas reativas n n % Não genotipado dia depois da coleta genotipo genotipo genotipo genotipo 4 (não-c, não-d) genotipo 4c/4d genotipo genotipo Total de amostras genotipadas Sensibilidade para soroconversão Foram realizados estudos adicionais de sensibilidade pela análise de espécimes de 30 painéis comerciais de soroconversão para HCV. Os resultados foram comparados com os de outros métodos comerciais autorizados. Com nove (9) painéis a reatividade observada foi precoce, com vinte (20) painéis a reatividade foi equivalente e com apenas um (1) painel de soroconversão o BIO FLASH anti-hcv apresentou reatividade mais tarde. Precisão A precisão intra-ensaio e a total (ensaio a ensaio e dia a dia) foram avaliadas em múltiplos ensaios, conforme as diretrizes CLSI EP05-A2. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte: Média (S/CO) CV% (intra-ensaio) CV% (Total) Controle negativo 0,26 7,1 12,3 Controle positivo 3,16 4,3 9,2 Cerca do valor de corte 0,94 4,6 8,1

6 Reprodutibilidade A repetibilidade entre réplicas, entre lotes e entre instrumentos foi avaliada utilizando 50 amostras. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte: n Co-negatividade Co-positividade Réplica 2 vs. Réplica % 100% Lote 2 vs. Lote % 100% Instrumento 2 vs. Instrumento % 100% Interferências Estudos segundo as diretrizes CLSI EP7-A demonstraram que as seguintes substâncias potencialmente interferentes não alteram os resultados de BIO-FLASH anti-hcv: Substância potencialmente interferente Concentração % Interferência Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indireta 18 mg/dl 10 Bilirrubina direta 18 mg/dl 10 Triglicérides 1300 mg/dl 10 Fator reumatóide 800 UI/mL 10 HAMA (anticorpo humano anti-murino) 1 µg/ml 10 Reatividade cruzada Foram analisadas com o ensaio BIO-FLASH anti-hcv 134 amostras positivas para condições que potencialmente poderiam produzir reação cruzada, incluindo de mulheres grávidas. Considera-se que ocorre uma reação cruzada quando o diagnóstico muda de positivo a negativo ou vice-versa. As amostras reativas foram comparadas com um ensaio de referência para o qual não foi observada reação cruzada com as substâncias potencialmente interferentes. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte: Reação cruzada potencial Concordância anti-toxoplasma 6/6 anti-cmv (citomegalovírus) 6/6 anti-rubéola 6/6 anti-hdv IgG (vírus da hepatite delta) 8/8 IgG elevada 4/4 Mononucleose 5/5 RF (fator reumatóide) 5/5 ANA (anticorpos anti-nucleares) 5/5 anti-hbs 6/6 anti-hbc 5/5 anti-vzv (vírus da varicela zoster) 5/5 RPR (reagina plasmática rápida) 5/5 Grávidas 7/7 Grávidas (multíparas) 5/5 anti-ebv (vírus Epstein-Barr) 4/4 IgM elevada 6/6 anti-hev (vírus da hepatite E) 5/5 HBsAg 6/6 HAV-IgG (vírus da hepatite A) 6/6 HAV-IgM (vírus da hepatite A) 5/5 anti-hiv (vírus da imunodeficiência humana) 3/3 anti-hsv 1 (vírus herpes simplex tipo 1) 6/6 anti-e. coli 15/15 Limite de detecção O limite de detecção (LD), determinado segundo as diretrizes CLSI EP17-A, se situa em 0,08 S/CO.