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1 BIO-FLASH Rubella IgM testes BIO-FLASH Rubella IgM é um ensaio imunológico quimiluminescente de dois passos totalmente automatizado para a determinação qualitativa de anticorpos IgM contra o vírus da rubéola em soro ou plasma humano com o instrumento BIO-FLASH. Sumário A rubéola, também chamada sarampo alemão, é uma doença infecciosa causada por um togavírus do gênero Rubivirus. Quando afeta a adultos, é geralmente leve e benigna. A rubéola se caracteriza por um exantema maculopapular, febre, mal-estar geral e linfadenopatia. No entanto, durante a gravidez o vírus pode ter efeitos potencialmente devastadores sobre o feto em desenvolvimento, especialmente durante os três primeiros meses de gravidez. 1 O vírus da rubéola pode produzir infecção intra-uterina e causar morte fetal, aborto espontâneo ou grande diversidade de anomalias congênitas. Estima-se que em todo o mundo nasçam cada ano mais de 100 bebês com síndrome de rubéola congênita. 2 A identificação e imunização das mulheres suscetíveis é fundamental para prevenir a síndrome da rubéola congênita. Está demonstrado que a persistência de anticorpos IgG contra o vírus da rubéola, seja por infecção natural ou por vacina, é eficaz na proteção contra a infecção. 3-6 A triagem de anticorpos contra a rubéola por métodos sorológicos permite estabelecer o estado imunológico dos indivíduos em relação à sua resistência ou suscetibilidade à infecção primária por rubéola. O diagnóstico preciso da infecção primária aguda por rubéola durante a gravidez é primordial e requer ensaios sorológicos, já que um número significativo de casos são sub-clínicos. 1 Na rubéola aguda aparecem IgM específicas pouco depois da aparição dos primeiros sintomas permanecendo durante uns três meses e sua detecção permite estabelecer o diagnóstico de infecção recente. Princípio Quando as micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH Rubella IgM são misturadas e incubadas com a amostra, se esta apresenta anticorpos IgM, estes se combinam com os anticorpos monoclonais murinos anti-igm humana que recobrem as micropartículas. Depois de uma separação magnética e lavagem para eliminar resíduos da amostra, se adiciona um traçador que consiste em antígeno de rubéola marcado com isoluminol que se une aos anticorpos IgM específicos anti-rubéola capturados pelas micropartículas. Depois de uma segunda incubação, separação magnética e lavagem, se adicionam os reagentes que ativam a reação quimiluminescente. O luminômetro do BIO-FLASH mede a luz emitida como unidades relativas de luz (URL) que são diretamente proporcionais à concentração de IgM anti-rubéola da amostra. O BIO-FLASH utiliza um método de redução de dados com ajuste a uma curva logística de 4 parâmetros (4PLC) para gerar uma Curva de Calibração Mestre (CCM). Esta curva vem predefinida, depende do lote e é guardada no instrumento através do código de barras do cartucho. Com a leitura dos calibradores (que se fornecem em um kit separado), a CCM predefinida se transforma em uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT) nova e específica para o instrumento. As concentrações dos calibradores estão incluídas nos códigos de barras dos tubos dos calibradores. Esquema da reação: LER ALTERAÇÕES DESTACADAS Ativadores (Triggers) URL Partícula magnética Amostra Traçador Emissão de luz

2 Componentes Cartucho de reagentes O kit BIO-FLASH Rubella IgM contém um cartucho de reagentes para 50 determinações (REF ). Nota: O desenho do cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Desenho CE ) Composição do cartucho de reagentes: O cartucho está composto por 4 frascos que contêm: A. 1 frasco cilíndrico de suspensão de micropartículas recobertas com anticorpo monoclonal murino anti-igm humana em tampão fosfato. Contém < 0,1% de azida sódica. B. 1 frasco de tampão de ensaio. Contém < 0,1% de azida sódica. C. 1 frasco opaco de traçador que consiste em antígeno de rubéola marcado com isoluminol. Contém < 0,1% de azida sódica. D. 1 frasco de diluente do traçador. Contém < 0,1% de azida sódica. Preparação Veja a figura seguinte. Cartucho: as micropartículas sedimentam durante o transporte e o armazenamento, por isso é preciso misturá-las para voltar a ressuspendê-las. Antes de utilizar o cartucho pela primeira vez, inverta-o suavemente 30 vezes evitando a formação de espuma (as bolhas podem fazer com que os sensores de líquido do instrumento dêem leituras errôneas). Comprove que as micropartículas estejam totalmente em suspensão. Se não for assim, continue invertendo o cartucho até que as partículas se ressuspendam totalmente. Se as micropartículas não se ressuspendem ou detecta que o pré-cinto dos reagentes está furado, NÃO UTILIZE O CARTUCHO. Uma vez que as micropartículas estejam em suspensão, coloque o cartucho sobre uma superfície sólida e retire com cuidado a lingüeta vermelha de segurança para o transporte. Mantendo o cartucho sobre a superfície sólida, aperte as duas abas situadas nos dois lados da tapa perfurante (peça cinza) e pressione a parte superior do cartucho até que fique em posição de bloqueio. Uma vez em posição de bloqueio, as abas têm que ficar ocultas. Não inverta o cartucho aberto. Deixe o cartucho repousar durante 5 minutos antes de carregá-lo no instrumento. Uma vez carregado o cartucho, o instrumento mistura seu conteúdo de forma automática em intervalos periódicos.

3 Precauções Os reagentes BIO-FLASH são para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profissionais. A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar os restos de reagentes, fazê-lo em abundante volume de água. ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO. Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Por favor, não reutilize nem reintroduza reagentes nos cartuchos ou frascos. Coleta e conservação das amostras Usar soro fresco (também se pode utilizar tubos com gel separador de soro) ou plasma (EDTA, Li-heparina, Li-heparina em tubo com gel separador, Na-heparina e Na-citrato). Outros anticoagulantes devem ser comprovados antes de utilizar-se. Os anticoagulantes líquidos como o Na-citrato exercem um efeito de diluição e podem reduzir a concentração de amostras de pacientes. As amostras não devem ser inativadas por calor. As partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Nas diretrizes CLSI H18-A3 e H21-A5 encontrará mais informação sobre o manuseio, o transporte, o processamento e a conservação das amostras. Soro As amostras de soro podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. As amostras podem congelar-se/descongelar-se no máximo 3 vezes. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Plasma As amostras de plasma podem ser conservadas a 2-8 C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C. Descongelar o plasma a 37 C. Descongelar as amostras somente uma vez. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise. Volume de amostra O volume de amostra necessário para realizar um único teste com BIO-FLASH Rubella IgM varia em função do tipo de recipiente que se utilize. Um teste requer ao menos 10 µl mais o volume morto, que é de 200 µl se é utilizada a copa de amostra recomendada (REF ). Outros materiais Os seguintes materiais não são fornecidos com o cartucho de reagentes e devem ser comprados por separado. REF REF BIO-FLASH Rubella IgM Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH Rubella IgM Controls (Controles) Leia com atenção as instruções correspondentes se deseja mais informação. Não utilize outros calibradores. A informação que necessita o instrumento BIO-FLASH para calibrar o ensaio BIO-FLASH Rubella IgM está incluída nos códigos de barras dos tubos. Utilizar controles de outros fabricantes pode dar lugar a resultados imprevistos. Assegure-se de que no instrumento BIO-FLASH haja uma quantidade suficiente dos seguintes consumíveis antes de processar amostras, calibradores ou controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) NOTA: O desenho das cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Desenho CE ). REF REF BIO-FLASH Triggers (Ativadores) BIO-FLASH System Rinse (Solução do sistema) Instrumento / realização do ensaio No Manual do Usuário do BIO-FLASH encontrará as instruções completas para realizar o ensaio. Calibração O código de barras do cartucho contém uma Curva de Calibração Mestre (CCM) que é válida para o lote de reagentes. No entanto, para todos os reagentes se necessita uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT), que é específica para cada lote e válida até a data de validade do lote. É preciso obter uma nova CCT quando os resultados dos controles saiam fora do intervalo de aceitação ou quando se tenha realizado ajustes no instrumento. Leia com atenção o Manual do Usuário do BIO-FLASH para configurar uma CCT.

4 Controle de qualidade Para realizar um programa completo de controle de qualidade é recomendável passar dois níveis de controles. Os controles BIO-FLASH Rubella IgM negativo e positivo foram desenhados para tal programa. Os controles devem ser analisados ao menos cada 24 horas por dia de utilização. Assegure-se de que os resultados dos controles se encontram dentro dos limites de aceitação já que, se não for assim, pode ser indicativo de resultados não válidos, ante os quais o usuário deverá tomar medidas corretivas. Neste caso, verifique todos os resultados obtidos desde a última comprovação de controle de qualidade aceitável do analito em questão. Pode ser necessário re-calibrar o instrumento. No Manual do Usuário do instrumento encontrará mais informação. Para a identificação e resolução de situações anormais de controle de qualidade, consulte Westgard et al. 12 Conservação e estabilidade Os reagentes que não tenham sido abertos se mantêm estáveis até a data de validade indicada no rótulo do cartucho se forem conservados a 2-8 C em posição vertical. Uma vez aberto, a estabilidade do cartucho carregado no instrumento BIO-FLASH ou guardado a 2-8 C é de 11 semanas. Interpretação de resultados A quantidade de analito em cada amostra se determina a partir da luz emitida (URL) por interpolação na Curva de Calibração de Trabalho guardada. Os resultados de BIO-FLASH Rubella IgM são expressos como S/CO (Sinal da amostra/valor de corte). Como o ensaio é qualitativo, o valor numérico do resultado só é indicativo da quantidade de anticorpos presentes. A determinação das IgM anti-rubéola com o ensaio BIO-FLASH Rubella IgM ajuda no diagnóstico de uma infecção recente. As amostras com um resultado < 0,90 S/CO são consideradas não reativas (negativas). As amostras com um resultado 0,90 y < 1,10 S/CO são consideradas indeterminadas (zona cinza). As amostras que se interpretem como indeterminadas deverão ser re-analisadas. Se ao repetir se obtém um resultado indeterminado, deve-se reportar como tal e deve ser realizado outro ensaio com um método alternativo ou obter e testar uma segunda amostra. As amostras com um resultado 1,10 S/CO são consideradas reativas (positivas). Como em todos os ensaios imunológicos sensíveis, existe a possibilidade de obter resultados positivos que não se repitam. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de infecção por rubéola. Uma possível soro-conversão deve ser confirmada determinando as IgG específicas com, por exemplo, BIO-FLASH Rubella IgG REF , analisando amostras pareadas tomadas com um intervalo de 2-4 semanas. Limitações O resultado de uma única amostra não é suficiente para diagnosticar uma infecção primária por rubéola. Portanto, além dos resultados de BIO-FLASH Rubella IgM é preciso ter em conta outros dados como, por exemplo, a sintomatologia, a história clínica, os resultados de outras provas, e toda a informação adicional relevante. Resultados esperados Em países com programas de vacinação, mais de 90% dos adultos jovens já são imunes à rubéola, seja por infecção natural ou vacina. 8 Os anticorpos IgM específicos são detectados na infecção primária ou depois da vacinação. Características funcionais NOTA: os seguintes dados são representativos; os resultados em experimentos isolados podem variar respeito a estes dados. Comparação de métodos BIO-FLASH Rubella IgM foi avaliado em estudos comparativos com outros ensaios comerciais. Avaliação interna Foi analisado com BIO-FLASH Rubella IgM um painel de amostras de variada procedência que incluíam soros positivos e negativos de anticorpos IgM anti-rubéola e os resultados foram comparados com os obtidos com um método de EIA Rubella IgM comercial. Os resultados indeterminados não foram considerados para os cálculos.

5 Método de referência BIO-FLASH Rubella IgM IND NEG POS Total IND NEG POS Total Foram obtidos os seguintes resultados iniciais de sensibilidade e especificidade relativas e concordância global: Sensibilidade relativa Especificidade relativa Concordância global ,0% 87,2% a 100,0% 88,7% 81,8% a 93,7% 90,7% 84,9% a 94,8% O mesmo painel foi provado com outros métodos comerciais de rubéola IgM e as amostras discrepantes foram resolvidas. O resumo dos resultados de consenso, excluindo as 2 amostras indeterminadas com BIO-FLASH Rubella IgM e as 3 amostras para as quais não se chegou a um consenso, se apresenta na seguinte tabela: Consenso BIO-FLASH Rubella IgM NEG POS Total NEG POS Total Em relação ao consenso foram obtidos os seguintes resultados de sensibilidade, especificidade e concordância global: Sensibilidade vs. consenso Especificidade vs. consenso Concordância vs. consenso ,0% 89,4% a 100,0% 94,8% 89,1% a 98,1% 96,0% 91,4% a 98,5% Avaliação externa Foi realizada uma avaliação externa no Servei de Microbiologia do Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (Espanha). As amostras foram caracterizadas mediante outro método comercial, MEIA Rubéola IgM, e analisadas com BIO-FLASH Rubella IgM. Os resultados indeterminados não foram considerados para os cálculos. Método de referência BIO-FLASH Rubella IgM IND NEG POS Total IND NEG POS Total Foram obtidos os seguintes resultados iniciais de sensibilidade e especificidade relativas e concordância global: Sensibilidade relativa Especificidade relativa Concordância global ,2% 86,8% a 99,5% 98,8% 96,5% a 99,8% 98,3% 96,2% a 99,5% As amostras discrepantes foram analisadas com um método CLIA Rubéola IgM comercial e o resultado de uma delas foi resolvido como negativo a favor de BIO-FLASH Rubella IgM. Depois do ensaio adicional foram obtidos os seguintes resultados finais de sensibilidade, especificidade e concordância global: Sensibilidade final Especificidade final Concordância global final ,0% 89,6% a 100,0% 98,8% 96,5% a 99,8% 98,7% 96,6% a 99,6%

6 Oitenta e duas (82) das amostras da avaliação externa eram de mulheres grávidas. As cifras de sensibilidade e especificidade se mantiveram similares às da população geral. Precisão A precisão intra-ensaio e total (ensaio a ensaio e dia a dia) foram avaliadas em múltiplos ensaios, conforme as diretrizes CLSI EP05-A. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte: Média (S/CO) Intra-ensaio Total Controle negativo 0,21 0,023 SD 0,032 SD Controle positivo 2,32 4,2% CV 5,5% CV Ao redor do valor de corte 0,80 4,3% CV 5,2% CV Interferências Estudos segundo as diretrizes CLSI EP7-A demonstraram que as seguintes substâncias potencialmente interferentes não alteram os resultados de BIO-FLASH Rubella IgM: Substância potencialmente interferente Concentração % Interferência Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indireta 18 mg/dl 10 Bilirrubina direta 18 mg/dl 10 Triglicérides mg/dl 10 Fator reumatóide 225 UI/mL 10 Reatividade cruzada Quando foram analisadas 110 amostras com potencial de produzir reação cruzada com o ensaio BIO-FLASH Rubella IgM e os resultados foram comparados com ensaios comerciais de Rubéola IgM, foi obtida a seguinte concordância: Reação cruzada potencial Concordância Anti-Toxo IgM (anticorpos contra Toxoplasma gondii) 5/5 Anti-CMV IgM (anticorpos contra citomegalovírus) 5/5 Anti-HIV (anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana) 6/6 HAMA (anticorpo humano anti-murino) 5/5 SLE (lúpus eritematoso sistêmico) 10/10 ANA (anticorpos anti-nucleares) 6/6 Anti-EBV (anticorpos contra o vírus Epstein-Barr) 6/6 Anti-PV B19 (anticorpos contra Parvovirus B19) 6/6 Anti-HSV 1 (anticorpos contra o vírus Herpes simplex tipo 1) 5/5 Anti-VZV (anticorpos contra o vírus da Varicela Zoster) 5/5 Paraproteínas IgG e IgM 6/6 IgG e IgM elevadas 11/11 Anticorpos heterófilos 4/4 RF (Fator Reumatóide) 8/8 Mulheres grávidas (multíparas incluídas) 22/22