CARACTERIZAÇÃO DE CEPAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO ISOLADAS DE JABUTIS (Geochelone carbonaria)

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1 CARACTERIZAÇÃO DE CEPAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO ISOLADAS DE JABUTIS (Geochelone carbonaria) Jean Carmona de Figueiredo 1, Silmara Cadene 2, Elza Maria Galvão Ciffoni 3 1- Acadêmico do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 2- Tecnóloga em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 3- Médica Veterinária, Prof. MSc. da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR). Endereço eletrônico para correspondência: Elza Maria Galvão Ciffoni, elzaelza.ciffoni@utp.br ou eciffoni@bol.com.br Endereço: Rua Sydnei A. Rangel Santos, N 238, Curitiba, PR CEP Telefone:

2 RESUMO Os probióticos são bactérias usadas para prevenir e tratar doenças tanto em humanos quanto em animais, produzem efeitos benéficos no hospedeiro, como promotores de crescimento, imunoestimulantes e capazes de produzir metabólitos que impedem a colonização de outras bactérias patogênicas. O objetivo desta pesquisa foi o isolamento, caracterização da atividade antagonista in vitro frente às cepas patogênicas ATCC de E.coli, Salmonella typhimurium, E. aureus, Pseudomonas aeroginosa, Klebsiella pneumoniaee Bacillus subtilis e a ação do fermentado concentrado 15, 25, 50, 60 e 80%, de cepas isoladas de jabutis (Geochelone carbonaria). A cepa isolada foi identificada como Enterococcus faecalis a qual apresentou resistência à bile 10%, salinidade 5 e 10% e inibiu o crescimento de E.coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeroginosa e klebsiella pneumoniae. Este artigo constitue o primeiro estudo relacionado a microbiota benéfica e propriedades de cepas probióticas isoladas de répteis, bem como os critérios de seleção aplicados, o que poderia ajudar a controlar ou prevenir doenças infecciosas causadas por bactérias patogênicas que acometem esses animais. PALAVRAS CHAVES: Geochelone carbonaria, probiótico, Enterococcus faecalis e prebiótico. ABSTRACT: Probiotics are bacteria used to prevent and treat diseases in both humans and animals; they produce beneficial effects in the host, such as growth promoters, and immunostimulants capable of producing metabolites that prevent colonization by other pathogenic bacteria. The objective of this research was the isolation, characterization of in vitro antagonistic activity against the ATCC strains of pathogenic E. coli, Salmonella typhimurium, E. aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniaeand the action of concentrated fermented 15, 25, 50, 60 and 80% of isolated strains from turtles (Geochelone carbonaria). The isolated strain was identified as Enterococcus faecalis which was resistant to bile 10%, salinity 5 and 10%, moreover it inhibited the growth of E. coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa and klebsiella pneumoniae. This article constitutes the first study related to microbiota and beneficial properties of probiotic strains isolated from reptiles, as well as the selection criteria applied, which could help control or prevent infectious diseases caused by pathogenic bacteria that affect these animals. KEY-WORDS: Geochelone carbonaria, probiotic, Enterococcus faecalis and prebiotic 2

3 INTRODUÇÃO Os probióticos são bactérias Gram positivas, usadas para prevenir e tratar doenças tanto em humanos quanto em animais (Santos & Gil-Turnes, 2005), pois produzem efeitos benéficos no hospedeiro, como promotores de crescimento e imunoestimulantes (Coppola & Turnez, 2004). Estes microrganismos vivos, ao serem ingeridos em quantidades adequadas exercem influência positiva na saúde e na fisiologia do hospedeiro (Badaró et al. 2008); são capazes de produzir metabólitos que impedem a colonização de outras bactérias patogênicas (Jatobá et al. 2008) pela produção de bacteriocinas, ou simplesmente com o abaixamento do ph (Nascimento, Moreno & Kuaye, 2008), assim exercem a capacidade de produzir biosurfactantes que as auxiliam na própria sobrevivência dentro do intestino. Conforme citado por Ciffoni et al, (2007), atuando como imuno-suplemento, conhecidos como pré e probiótico, estes microrganismos têm a propriedade de inibir outras bactérias patogênicas ou tornar o indivíduo mais resistente através da bioestimulação que pode chegar ao nível sistêmico, sem causar patogenicidade ou inflamações, pois contribuem com a homeostase e o bom funcionamento do organismo. São capazes de formar uma camada que funciona como barreira contra a colonização de outros organismos; algumas cepas convertem a lactose em ácido lático que acaba baixando o ph do meio, e outras são amilolíticas, convertendo o amido em ácido lático (Ciffoni, 2005; Capellari, 2010) e assim como a produção de diacetil que é umas das bacteriocinas produzidas pelos probióticos (Guedes et al. 2005). O termo probiótico é bastante usado para denominar alimentos funcionais, embora hajam várias definições, atualmente a mais aceita foi sugerida pela reunião conjunta de especialistas da Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas (FAO) e pela Organização Mundial da Saúde (OMS) realizada em 2002: probióticos são organismos vivos que administrados em quantidades adequadas, conferem um efeito benéfico à saúde do hospedeiro. Portanto um bom probiótico deve cumprir vários critérios como: capaz de resistir e sobreviver ao efeito da passagem pelo estômago (ácido gástrico, secreções biliares e pancreáticas) a fim de alcançar o intestino grosso (Morais & Jacob, 2006). Muitos dos produtos denominados como suplementos alimentares não são compostos de vida bacteriana e, portanto, não cumprem a definição estrita de probióticos e são denominados de prebióticos que referem-se a não vivos, indigestos, e de baixo peso molecular. São polissacarídeos que são metabolizados pela biota intestinal e causam modificações físicas na 3

4 mucosa, na biota e no ambiente intestinal. Eles promovem e favorecem seletivamente o crescimento da própria biota intestinal do hospedeiro. Assim, uma vez que os probióticos são ingeridos, ocorrem mudanças que repercutem de maneira positiva no estado de saúde e bem estar. É importante ressaltar que a biota intestinal é uma comunidade interativa de organismos com funções específicas para manter o estado de saúde (Tamboli et al. 2003). Estas funções são em síntese, o resultado das diferentes atividades combinadas das organizações que os compõem, a interação desses microrganismos, tais como substratos de fermentação dietéticos não-digeríveis, e muco produzido pelo epitélio com a produção de ácidos graxos de cadeia curta, favorecendo a recuperação e a absorção de cálcio, ferro e magnésio na regulação do metabolismo da glicose através da redução da glicose do sangue pós-prandial, assim como a síntese de vitamina K e as sínteses das vitaminas do grupo B. Alguns benefícios incluem a melhora nas doenças infecciosas, doenças crônicas intestinais, como colite ulcerativa, imunomodulação, biodisponibilidade de nutrientes, doenças cardiovasculares, diabetes mellitus, osteoporose, obesidade e câncer. Estes efeitos podem ser causados, direta ou indiretamente pela regulação da microbota intestinal e resposta imunológica (Varavallo, Thomé & Teshima, 2008; Santos & Cançado, 2009; Del Piano et al ; Nomoto, 2005). Atualmente existe um aumento na procura pelos produtos que possam substituir o uso dos antibióticos como promotores de crescimento e controle de organismos patogênicos, e isso vem influenciando as indústrias e pesquisadores na busca por novas alternativas, pois o uso desses produtos atinge o mercado de exportações, assim como, também podem desenvolver resistência bacteriana e hipersensibilidade nos seres humanos pelo uso indiscriminado e falta de informações dos produtores (Rutz & Lima, 2001). Também o sistema de produção orgânica é um incentivo a descoberta de novas tecnologias de produção animal, no marco de sustentabilidade e saúde do consumidor (Ciffoni & Arns, 2009). Portanto, um produto que contenha probiótico, para ser considerado eficiente terá que suprir as seguintes exigências: ter uma produção industrial bastante viável, resistir às condições de transporte e estocagem sem perder suas propriedades, permanecer ativo após o processo de digestão no estomago e proporcionar efeitos benéficos ao hospedeiro. Ele poderá conter uma ou mais espécies de microrganismos, sendo as bactérias probióticas mais utilizadas para o consumo humano e animal, as bactérias ácidas lácticas (BAL) que incluem as seguintes espécies: Lactobacillus acidophilus, L. plantarum L. casei, L. casei ssp. 4

5 rhamnosus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. fermentum, L. reuteri, Lactococcus lactis spp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Bifidobaterium bifidum, B. infantantis, B. longum, B. breve, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, entre outras (Gonzales-Martinez, Gómez-Treviño & Jeménez-Salas, 2003). Os jabutis são quelônios, animais ectotérmicos de hábitos terrestres, pertencentes à família Testudinidae, a segunda maior família da ordem Testudines em número de espécies, e representam uma grande proporção dos animais atendidos na clínica de animais selvagens, e são muito visados como animais de companhia (Matias et al, 2006). A criação mundial de animais silvestres exóticos vem aumentando, por se tratar de animais que estão em constante contato com humanos, isso pode trazer risco à saúde com manipulação desses bichos, assim seus patógenos poderão ser transmitidos a pessoas, e isso se torna um fator importante na dispersão de enfermidades, não só por conta da ausência de controle sanitário durante a movimentação e manipulação desses animais, mas também pela debilidade física e imunológica a que são submetidos em virtude da fome ou alimentação inadequada, sede e densidades elevadas em espaços inadequados, que são características do trato com esses animais (Nunes, 2010). Os répteis de vida livre assim como os domésticos são considerados os principais reservatórios naturais de Salmonella sp, pois ela faz parte da sua microbiota normal e podem desenvolver a doenças sob determinadas condições (Argôro, 2007). A Salmonella sp cresce em ph entre 6,5 e 7,5, mas pode tolerar entre 4,5 e 9,0 e que valores menores que ph 4,1 causam a sua inativação (Nogueira, 2010). A importância de cepas com potencial probiótico isoladas do trato intestinal desses animais é que estas poderão ser utilizadas como suplemento alimentar de outras espécies animais, para prevenir e combater as infecções de salmonela entre outros patógenos. Sendo que, os probióticos devido as suas características de colonizar o intestino do hospedeiro, depois de passar pelo estômago, poderão assim competir com essas bactérias patogênicas no trato intestinal, pelos sítios ativos e a produção de lantibióticos (atuam como antibióticos), e com isso promover a eliminação ou redução dos patógenos, sem o uso ou associados aos antibióticos, produzindo animais com qualidade e sanidade sem acarretar risco aos criadores e/ou riscos a saúde humana. O objetivo desse estudo foi o isolamento e caracterização de cepas com potencial probiótico isolado do trato intestinal de jabutis. 5

6 E teste das cepas frente aos patógenos E.coli ATCC 35218, Salmonella typhimurium ATCC, E. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeroginosa ATCC, Klebsiella pneumoniae ATCC e Bacillus subtilis ATCC. MATERIAIS E MÉTODOS Foram colhidas amostras intestinais de seis jabutis (Geochelone carbonaria), escolhidos aleatoriamente, oriundos do Passeio Público de Curitiba, aparentemente saudáveis, que não haviam recebido tratamento com antibióticos recentemente. O projeto foi submetido ao CEUA-UTP (Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Tuiuti do Paraná). As amostras intestinais foram colhidas com swab estéril, introduzido diretamente na cloaca através de uma sonda feita com seringa de 1/2 polegadas, com aproximadamente 10 cm, esterilizada. Após colheita, os swabs foram transportados em caldo MRS (de Man, Rogosa e Sharp OXOID) adicionado de 10% de bile canina, colhida no laboratório de patologia clínica da Universidade Tuiuti do Paraná (UTP) e cristalizada por uma semana em estufa de secagem 1 a 60 C, autoclavada a 121 o C, por 15 min. No laboratório de microbiologia da UTP, os tubos foram para estufa bacteriológica a 37 C/24 horas. As bactérias resistentes a bile foram isoladas pela técnica da semeadura, com esgotamento da alça de platina, em placas com ágar MRS onde foram incubadas em jarra de anaerobiose a 37 C e observado o crescimento por 48 horas, em estufa bacteriológica 2. Após este período as cepas foram submetidas à coloração de Gram para identificação morfológica. As cepas isoladas e identificadas foram incubadas em caldo MRS, verificando-se o ph (com phmetro) 3 antes e após fermentação em estufa por 37ºC/ 24h. As cepas foram semeadas em ágar sangue para testar a atividade hemolítica. Seleção das cepas probióticas. A seleção das cepas foi baseada na coloração de Gram e morfologia em microscópio óptico, resistência à salinidade 5, 10 e 18% em caldo MRS, resistência à bile 10%, consumo 1 Estufa de circulação de ar mod. 400/3ND, Nova Ética. 2 Estufa para Cultura Bacteriológica mod. 502A, Fanem. 3 phmetro mod. Q400A, Quimis. 6

7 do citrato (citrato de Simmons) como única fonte de carbono, viabilidade durante a estocagem à temperatura de 4 C, atividade antimicrobiana e resistência a antibióticos. A cepa isolada foi inoculada em caldo MRS e mantida por 24 horas a 37 C em seguida transferida uma alíquota ao nível de 1% (v/v) para frasco contendo 25 ml de caldo MRS e incubada a 37 C por 24 horas com a finalidade de testar frente aos patógenos. Antagonismo frente aos patógenos in vitro O caldo nutriente foi utilizado para ativar as cepas patogênicas, sendo assim, foram semeadas em nível de 2,5% (v/v) em placas de petri contendo ágar nutriente. Após homogeneização, foram deixadas em temperatura ambiente para solidificação. Foi feito de forma asséptica, um orifício no centro da placa, com 0,7cm de diâmetro, onde foram adicionamos 20 µl de caldo MRS com a cepa probiótica isolada; As placas foram incubadas a 37 C por 24 horas. Depois do período de incubação, foram realizadas as leituras como zona clara ao redor do orifício, halo de inibição, e mensurado o diâmetro em centímetros com meio de cultura MRS em ph 6,5 (ph inicial da fermentação) (Cadene, Panisson & Ciffoni, 2010). A cepa selecionada na avaliação da atividade antimicrobiana foi inoculada em frasco erlenmeyer contendo 100 ml do caldo MRS, e incubada à 37 C na estufa bacteriológica. Após 24 horas de fermentação o material foi centrifugado 4 por 30/min a 3000/rpm e o sobrenadante filtrado em papel milipore 0,22 µm e concentrado a 15, 25, 50, 60, e 80% em estufa de circulação de ar, sob temperatura de 60 C. Os testes realizados em duplicata com o concentrado do fermentado. A avaliação da atividade bacteriostática do concentrado do fermentado da cepa selecionada, foi realizada com a adição de 30 µl nos orifícios (0,7 cm) em placa com meio Mueller-Hinton e semeada com patógeno. A verificação da formação de halo foi realizada com 24 horas de incubação (Panisson, Cadene & Ciffoni, 2010). Na atividade bactericida, os patógenos foram semeados em placa (com ágar Mueller- Hinton) e incubados na estufa bacteriológica, à 37 C/ 24 horas; após este período adicionou- 4 Centrifuga mod. DSC -16RV, Presvac. 7

8 se 25 µl do concentrado sobre os patógenos e incubados novamente, com os período de 24 horas foi realizada a verificação do efeito do concentrado nos patógenos. Avaliação da atividade amilolítica Foi preparado o Meio base (MgSO 4 0,2 g.l -1 ; NaCl 0,1g.L -1 ; Extrato de Leveduras 0,4g.L -1 ; KH 2 PO 4 0,4g.L -1 ;K 2 HPO 4 0,1g.L -1 ) e 1% de amido, e colocados 10 ml em tubo de ensaio e autoclavados por 15 minutos a 121º C. Em seguida, após o resfriamento, as bactérias foram inoculadas, e incubadas por 48 h a 37ºC. A revelação foi com solução de lugol conforme Oliveira, Watanabe & Rodrigues (2010). As BAL, são microrganismos que podem atuar no processo fermentativo para a conservação da massa ensilada, produzem principalmente ácido lático como produto da fermentação dos açúcares (Santos et al,2010). Identificação da cepa probiótica selecionada A cepa com potencial probiótico foi identificada pelo método de Automatizado MicroScan WalkAway no LANAC- Laboratório de Análises Clinica. O exame realizado segundo as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute 2010 (CLSI/NCCLS). Interpretação segundo critérios preconizados pela ANVISA 01/2010. Realizou-se o antibiograma com os antibióticos: Tetraciclina(TET 30), Oxacilina (OXA 01), Eritromicina (ERI 15),Vancomicina (VAN 30) e Clorafenicol (CLO 30). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os métodos fenotípicos para a identificação de bactérias ácida láticas (BAL) são os mais utilizados (Curk et al citado por Ciffoni, Pachaly & Socool, 2007). O que diferencia uma cepa bacteriana lática, entre as espécies, como homo ou heteroláticas, é a porcentagem de ácido lático produzido e as heteroláticas produzem 50% de ácido lático e os outros componentes como acetato, etanol, anidrido carbônico, ácido fórmico, ácido propiônico, acetona e acetaldeído. Já as bactérias homolácticas, produzem 90% de ácido lático. Das seis amostras intestinais de jabutis (Geochelone carbonaria), foram isoladas 10 cepas de bactérias láticas Gram + cocos e bastões. Dessas, oito foram de bastões e dois de 8

9 cocos. Dois animais (33,3%) não apresentaram bactérias Gram positivas. As 10 cepas isoladas fora resistentes a bile 10% em caldo MRS, tendo ocorrido sobrevivência e fermentação (Tabela-01). As cepas isoladas foram testadas frente ao antagonismo de agentes patogênicos como E.coli ATCC 35218, Salmonella typhimurium ATCC, E. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeroginosa ATCC, Klebsiella pneumoniae ATCC e Bacillus subtilis ATCC, apresentando halos de inibição entre 10 e 18mm (Quadro 1). As bactérias foram nomeadas conforme a numeração do animal e respectivas quantidades de colônias. A cepa 5 C 2 isolada da cloaca de jabuti apresentou melhores características inibidoras de patógenos ATCC, apresentando halos de inibição variando 12 a 17 mm, e foi identificada como Enterococcus faecalis pelo método MicroScan que é um equipamento semi-automatizado para microbiologia clínica. Realiza automaticamente a leitura de um painel inoculado com uma suspensão bacteriana padronizada. Utiliza a tecnologia de fibras óticas permitindo a leitura espectrofotométrica de todo o painel simultaneamente, garantindo a mais absoluta precisão nos resultados. Identificação e antibiograma com Concentração Inibitória Mínima ou Breakpoint com uma ampla variedade de antibióticos (Rhoads et al, 1995). No trabalho de Pasteris et al.(2008), estudaram a propriedade benéfica de lactobacillus isolados de rã-touro, que foi testado in vivo para combater Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis que foram isoladas de rãs exibiam a síndrome da perna vermelha, encontraram cepas de Enterococcus faecalis, contradizendo Fuentefria, Einsfeld & Corção (2008) que afirmam que as bactérias do gênero enterococcus estão associadas a animais de sangue quente e Costa et al. (2009) cita que Enterococcus faecalis são microrganismos comensais que colonizam o trato gastrintestinal de humanos e animais de sangue quente. A cepa isolada Enterococcus faecalis foi testada quanto à resistência e susceptibilidade aos antibióticos e mostrou resistência frente aos antibióticos Oxacilina, Eritromicina e Vancomicina. O fato de uma bactéria com propriedades probióticas oferecer resistência, segundo Ciffoni, Pachaly & Soccol (2007), indica que há a possibilidade de uso do probiótico em conjunto com antibióticos, permitindo-se administrar em indivíduos em tratamento, e a cepa probiótica reconstituiria a biota benéfica do hospedeiro. Guarner et al, (2008) recomendam preparações de probióticos para evitar a diarréia causada por antibióticos, ou como parte do tratamento para a disbiose relacionada aos antibióticos. 9

10 Quadro 1- Cepas isoladas de jabutis (Geochelone carbonaria) teste de antagonismo frente a patógenos BACTÉRIAS LÁTICAS Patógenos 5C 2 5C C 1 1C 3 1C 5 E. coli 13 mm 10 mm mm - 12 mm K. pneumoniae 12 mm S. typhimurium 13 mm 14 mm mm P. aeroginosa 17 mm - 16 mm 13 mm 12 mm 18 mm 13 mm S. aureus B. subtilis Figura-01 Halos de inibição da cepa BAL (Enterococcus faecalis) Frente aos patógenos ATCC E. coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Klebsiella pneumoniae A cepa Enterococcus faecalis inoculada em meio MRS líquido cujo ph inicial de 6,50 foi reduzido para valores próximos a 4 em 24 horas de fermentação e em 48 horas ficou abaixo de 4, apresentou resistência a bile 10%, capacidade amilotítica (fig. 2), consumo de citrato, e mostrou-se viável por cinco meses, em geladeira a 4 o C, e em salinidade de 5 e 10% (fig.-02). Quadro 02 - Comportamento da cepa Enterococcus faecalis frente a redução de ph, resistência a bile, teste de amilase, citrato, viabilidade a estocagem e sobrevivência a salinidade ph/24h ph/48h Resistência bile 10% Amilase Citrato de Simmons Viabilidade por 5 meses Salinidade 5 e 10% 4,18 3, O teste de hidrólise do citrato (quadro 2), permite diferenciar microrganismos atendendo à sua capacidade para usar o citrato, como única fonte de carbono. Assim, Bruno & Carvalho (2009) citam que o Lactis biovar diacetylactis é capaz de converter citrato em 10

11 diacetil, e Ramirez (2005) cita que o diacetil é um composto produzido pelas bactérias lácticas que têm esta capacidade, além de ser o produto final do ciclo da fermentação butanodiólica, que ocorre em um dos destinos do piruvato, ele possui um efeito antimicrobiano. Bruno & Carvalho (2009) citam que as espécies do gênero Enterococcus em geral apresentam baixa capacidade de reduzir o ph do leite e que E. faecalis tem maior poder de acidificação que o E. faecium. Observaram que o E. faecalis, isolado de queijos artesanais italianos, reduziu o ph de leite desnatado para 4,5 após 24 horas de fermentação o que pode ser comprovado que a cepa que foi isolada de jabutis tem poder de acidificação do meio, pois Ferreira & Kussaka (2009) citam que através da produção do ácido lático, as BAL provocam uma redução no ph intestinal, tornando o meio impróprio para a multiplicação dos agentes patogênicos. Figura-02 Teste de fermentação para cepas amilolíticas, confirmando viabilidade em 5 meses em geladeira com e sem salinidade de 5 e 10%, o amido reage com lugol deixando o meio escuro, indicando que o meio contém amido não hidrolisado O ácido láctico pode ser produzido pela conversão direta do amido em ácido láctico com o uso de bactérias, com a produção de ácido amilolítico e láctico (Ciffoni et al, 2005). A fermentação do meio amilolítico demonstra que o Enterococcus faecalis isolada de jabutis pode fermentar o amido (fig. 02) como a única fonte de carbono. A ocorrência das bactérias lácticas amilolíticas, foi relatada a partir de diferentes amiláceos de alimentos tropicais, elaborados principalmente da mandioca e de cereais como o milho, foram repetidamente isoladas a partir de cereais ou alimentos fermentados tradicionais a base de mandioca no 11

12 qual Capellari (2005) estudou a biossíntese de ácido láctico por Lactobacillus amylovorus realizado em meio similar ao meio MRS sendo substituídos peptona, extrato de carne, extrato de levedura por milhocina in natura e a glicose por melaço ou amido. Quadro 3 - Cepas isoladas de jabutis (Geochelone carbonaria) teste de antagonismo bacteriostático frente a patógenos Fermentado Concentrado Patógenos 15% 25% 50% 60% 80% E. coli 10,5 mm 9 mm K. pneumoniae 9,5 mm 9 mm S. typhimurium 10,5 mm 10 mm 8,5 mm 8 mm 9 mm P. aeroginosa 10 mm S. aureus B. subtilis Figura- 03 Inibição de salmonela nas concentrações 15, 25, 50, 60 e 80% No teste de atividade bacteriostática do concentrado a cepa Enterococcus faecalis apresentou halo de inibição nas concetrações de 15, 25, 50, 60 e 80% (Quando 2) contra aos patógenos ATCC E. coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Klebsiella pneumoniae. Onde podemos observar que a salmonela foi inibida em todas as concentrações testadas neste trabalho (fig. 03). De acordo com Reque (1999) a inibição pode ocorrer pela produção do ácido láctico e conseqüente diminuição do ph do meio, pela produção de bacteriocinas que apresentam propriedades bacteriostáticas, e pela produção dos ácidos acético e fórmico. 12

13 CONCLUSÃO A cepa Enterococcus faecalis é uma bactéria homofermentativa, que produz preferencialmente ácido lático a partir da glicose, usa o citrato como única fonte de carbono, é resistente a 10% de bile, salinidade 5 e 10%, e aos antibióticos Oxacilina, Eritromicina e Vancomicina, e apresenta viabilidade a estocagem por cinco meses e apresenta a capacidade inibitória de patógenos in vitro; É uma cepa amilolítica, pode está envolvida no aproveitamento de resíduos agroindustriais para a produção de ácidos orgânicos; O fato de existir inibição in vitro indica a possibilidade de seu uso como probiótico, necessitando testes in vivo para comprovar inocuidade e eficácia quanto à capacidade de estimular uma flora benéfica de outros animais; A cepa isolada da cloaca de Jabuti e identificada como Enterococcus faecalis, apresenta capacidade de produção de substâncias inibitórias frente às cepas E. coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Klebsiella pneumoniae; O fato de haver inibição nos testes in vitro demonstra que o fermentado tem propriedades necessárias para a sua utilização como prebiótico. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Argôro R. C. F. IDENTIFICAÇÃO, SOROTIPAGEM E DIFERENCIAÇÃO PELA PCR-DGGE DE SOROTIPOS DE SALMONELLA ISOLADOS DE TEIUS CRIADOS EM CATIVEIRO. Ilhéus 96 (Dissertação, Microbiologia e Genética Molecular) UFSC

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