AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE PROBIÓTICA DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁTICAS ISOLADAS DE QUEIJO MINAS ARTESANAL DA REGIÃO DE ARAXÁ-MG

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1 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE PROBIÓTICA DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁTICAS ISOLADAS DE QUEIJO MINAS ARTESANAL DA REGIÃO DE ARAXÁ-MG M.T. Ribeiro 1*, L.S.Silva 1, J.G.Silva 2, L.M.P. Luiz 2, M.R. Souza 2, A.M. Silva 1 1-Departamento de Engenharia de Alimentos Universidade Federal de São João del Rei - Campus Sete Lagoas, CEP: Sete Lagoas MG Brasil, Telefone: 55 (31) (micaelribeiroo@outlook.com) 2- Departamento de Tecnologia e Inspeção de Produtos de Origem Animal Universidade Federal de Minas Gerais CEP: Belo Horizonte MG Brasil RESUMO O queijo Minas artesanal, produto típico e reconhecido nacionalmente, tem como ingredientes leite cru, soro fermento endógeno, coalho e sal. A utilização de leite cru pode veicular tanto microrganismos patógenos e deteriorantes, quanto microrganismos benéficos, incluindo potenciais probióticos. Assim, o presente trabalho buscou avaliar parte da capacidade probiótica de espécies de bactérias ácido láticas isoladas de queijo Minas artesanal da região de Araxá pelos testes de antagonismo in vitro e teste de resistência à antibióticos. Pôde-se verificar que todas as bactérias ácido láticas testadas se comportaram como boas inibidoras das bactérias patogênicas usadas como reveladoras. E ainda, houve um perfil heterogêneo de sensibilidade aos antibióticos, sendo a amostra CQ2T4 (Lactobacillus rhamnosus) a mais resistente. Conclui-se que as bactérias ácido láticas avaliadas apresentaram potencial para, junto com testes complementares, serem inseridas na classificação de probióticos, levando a elaboração de um possível queijo com alegação de funcionalidade. ABSTRACT The Minas artisanal cheese, typical and nationally recognized product, has as ingredients raw milk, endogenous whey yeast, rennet and salt. The use of raw milk can vehicle both microorganisms pathogens and spoilage, as beneficial microorganisms, including potencials probiotics. Thus, this study aimed to evaluate part of probiotic ability of species of lactic acid bacteria isolated from Minas artisanal cheese of Araxá region by in vitro antagonism tests and antibiotic resistance testing. It was verified that all lactic acid bacteria tested behaved as good inhibitors of pathogenic bacteria used as revealing. Also, there was a heterogeneous profile of sensitivity to antibiotics being more resistant the CQ2T4 (Lactobacillus rhamnosus) sample. We conclude that the bacteria evaluated lactic acid showed potential, along with additional tests, be inserted in the probiotics classification, leading the development of a possible cheese with functional claim. PALAVRAS-CHAVE: queijo Minas artesanal, probióticos, alimento funcional, Araxá. KEYWORDS: Minas artisanal cheese, probiotics, functional food, Araxá. 1. INTRODUÇÃO O modo de se fazer o queijo Minas artesanal foi reconhecido em 2008 como patrimônio imaterial através do registro no Inventário Nacional de Referências Culturais do Instituto do

2 Patrimônio Histórico e Artístico Nacional (IPHAN), tendo na composição do produto: leite cru, soro fermento endógeno (pingo) e coalho industrializado (Nobrega, 2012). Devido à utilização de leite sem um processamento térmico na produção do queijo Minas artesanal, o produto apresenta uma variabilidade grande da sua microbiota, podendo veicular microrganismos patogênicos e deteriorantes, mas também microrganismos que podem ser benéficos aos consumidores. Dentre os microrganismos benéficos, inclui-se os conhecidos como probióticos, definidos como microrganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas, oferecem benefícios para a saúde do hospedeiro (FAO/OMS, 2002). Como representantes dos probióticos estão algumas espécies de bactérias ácido láticas (BAL), assim como as bifdobactérias, tendo essas espécies a capacidade de resistir a ambientes de baixo ph como o estômago e de suportar a ação dos ácidos biliares presentes no intestino (Ferreira, 2012). Como existem poucos trabalhos científicos que caracterizam e identificam o queijo Minas artesanal, o objetivo desse trabalho foi realizar parte da caracterização do potencial probiótico de bactérias ácido láticas isoladas de queijo Minas artesanal amostrados na região de Araxá, por meio de testes de antagonismo in vitro frente à patógenos frequentemente relacionados à doenças de origem alimentar e testes de resistência das BAL aos antibióticos frequentemente empregados na medicina. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Cultura de Bactérias Ácido Láticas As bactérias ácido láticas (BAL) utilizadas no projeto foram isoladas de queijo Minas artesanal da região de Araxá-MG e gentilmente cedidas pelo professor Marcelo Resende de Souza (Escola de Veterinária/ Universidade Federal de Minas Gerais). Os testes foram realizados com cinco amostras de Lactobacillus rhamnosus (AQ2T3, AQ10T6, CQ2T4, CQ3T4 e CQ6T6) e uma amostra de Lactobacillus casei (BQ3T4) utilizadas como produtoras de compostos potencialmente inibidores das bactérias patogênicas Teste de Antagonismo In Vitro O antagonismo in vitro foi realizado segundo a técnica spot on the lawn (difusão em dupla camada) (Branco et al., 2010). Como bactérias reveladoras foram utilizados patógenos frequentemente vinculados a doenças de origem alimentar: linhagens de Escherichia coli ATCC 25922, Listeria monocytogenes ATCC 15313, Salmonella enterica var. typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC e Lactobacillus rhamnosus (isolada do leite utilizado para fabricação dos queijos). O resultado do teste foi medido com a ajuda de um paquímetro digital (Zaas precision), através dos halos de inibição formados Teste de Resistência à Antibióticos O teste de resistência aos antibióticos foi realizado pelo método de difusão de discos contendo antibióticos (Guedes Neto, 2004). Para a realização do teste, foram utilizados discos antimicrobianos contendo Ceftazidima (30μg), Clindamicina (2μg), Ciprofloxacina (5μg), Eritromicina (15μg), Gentamicina (10 μg), Oxacilina (1μg), Penicilina G (10 UI), Estreptomicina (10μg), Tetraciclina (30μg) e Vancomicina (30μg). O resultado do teste (halos de inibição formados) foi medido com a ajuda de um paquímetro digital (Zaas precision).

3 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Teste de Antagonismo In Vitro A capacidade de inibição por parte de todas as BAL foi satisfatória (Tabela 01 e Figura 01), não havendo diferença significativa (p>0,05) entre os microrganismos produtores testados. Portanto, as BAL estudadas se caracterizaram como boas inibidoras de microrganismos patogênicos. Tabela 01: Médias dos halos de inibição e desvio padrão (mm) do teste de antagonismo in vitro das amostras de Lactobacillus casei e Lactobacillus rhamnosus isolados de queijo Minas artesanal de Araxá-MG. AMOSTRA EC LM SA ST LR AQ2T3 45,25 (±6,34) 46,97 (±5,12) 22,12 (±3,55) 59,27 (±5,65) 0 (0) AQ10T6 38,80 (±5,78) 28,76 (±4,87) 26,80 (±4,38) 37,80 (±3,98) 30,84 (±4,55) BQ3T4 43,04 (±7,43) 49,08 (±7,21) 34,90 (±4,93) 62,80 (±9,34) 0 (0) CQ2T4 58,53 (±7,22) 48,05 (±8,77) 33,45 (±5,76) 71,88 (±8,53) 0 (0) CQ3T4 56,73 (±4,90) 48,95 (±5,76) 37,16 (±5,21) 66,39 (±8,21) 0 (0) CQ6T6 49,09 (±9,32) 51,98 (±5,70) 27,26 (±4,57) 43,40 (±7,24) 30,07 (±3,90) Legenda: EC: Escherichia coli ATCC 25922; LM: Listeria monocytogenes ATCC 15313; SA: Staphylococcus aureus ATCC 25923; ST: Salmonella enterica var. typhimurium ATCC 14028; LR: Lactobacillus rhamnosus (isolada do leite usado na fabricação dos queijos. AQ2T3, AQ10T6, CQ2T4, CQ3T4 e CQ6T6: Lactobacillus rhamnosus; BQ3T4: Lactobacillus casei; M: Média; DP: Desvio Padrão. Figura 01: Capacidade de inibição das BAL isoladas de queijo Minas artesanal da região de Araxá.

4 Legenda: CQ3T4, CQ2T4, CQ6T6, AQ2T3 e AQ10T6: Lactobacillus rhamnosus; BQ3T4: Lactobacillus casei. Por outro lado, Andrade (2012), ao avaliar o potencial probiótico de BAL isoladas de queijo Minas artesanal por Resende et al. (2011), observou que apenas a amostra de L. plantarum (B17) foi capaz de inibir a bactéria patogênica Salmonella var. typhimurium. O presente estudo realizado mostra que todas as produtoras foram capazes de inibir a reveladora em questão. Quanto às outras bactérias reveladoras patogênicas, todas elas foram inibidas por todas as BAL produtoras. Esse fato também foi encontrado por Costa et al. (2013) que identificaram atividade antagonista de Lactobacillus spp. frente à Staphylococcus spp., Escherichia coli e Listeria monocytogenes e ainda, baixa inibição do mesmo produtor frente a microrganismos do mesmo gênero, L. rhamnosus e L. fermentum, assim como no presente estudo Teste de resistência a antibióticos Os resultados deste teste foram expressos na Tabela 02 que representa a inibição causada pelos antibióticos em relação às BAL testadas. Tabela 02 - Níveis de susceptibilidade aos antimicrobianos avaliados em duas repetições em triplicata, das amostras de Lactobacillus casei (BQ3T4) e Lactobacillus rhamnosus (AQ2T3, AQ10T6, CQ2T4, CQ3T4 e CQ6T6) isolados de queijo Minas artesanal da região de Araxá-MG. Amostras Antibióticos AQ2T3 AQ10T6 BQ3T4 CQ2T4 CQ3T4 CQ6T6 CAZ MD R MD R MD MD GN S S R R S S CIP S S S S S S E S S S S S S DA S S MD MD S S OX R R R R R R P S S S MD S S S MD S R R MD MD TE S S S S S S VA R R R R R R Legenda: ceftazidima - CAZ (30 μg), clindamicina - DA (2 μg), ciprofloxacina - CIP (5 μg), eritromicina - E (15 μg), gentamicina - GN (10 μg), oxacilina - OX (1 μg), penicilina - P (10 UI), estreptomicina S (25 μg), tetraciclina - TE (30 μg), vancomicina - VA (30 μg). Todas as amostras de BAL estudadas (100%) foram sensíveis à ciprofloxacina, eritromicina e tetraciclina. Assim como Silva et al. (2013) e Sant ana (2014), o presente estudo detectou que todas as amostras de BAL foram resistentes à oxacilina e vancomicina. A resistência a esses antibióticos tem se demonstrado intrínseca por parte de bactérias ácido láticas, sendo que estudos mostraram que em

5 100% dos casos, bactérias do gênero Lactobacillus de origens diferentes apresentaram resistência à essas drogas (Mathur e Singh, 2005; Ouoba et al., 2008). Em relação aos outros antibióticos (ceftazidima, clindamicina, gentamicina, penicilina, e estreptomicona), houve um perfil heterogêneo de sensibilidade por parte das BAL isoladas. A produtora CQ2T4 (Lactobacillus rhamnosus) foi a BAL que apresentou maior resistência aos antibióticos testados (5/10), sendo ainda moderadamente sensível aos outros dois antibióticos, o que sugere cuidados com relação a necessidade de tratamentos médicos. 4. CONCLUSÕES O antagonismo in vitro realizado mostrou resultados promissores para todas as espécies de bactérias ácido láticas estudadas frentes aos patógenos frequentemente envolvidos em doenças de origem alimentar. Entretanto, o teste de resistência a antibióticos realizado mostrou uma distribuição heterogênea de sensibilidade, sendo algumas BAL mais sensíveis a um número maior de antibióticos. Assim, as bactérias ácido láticas avaliadas apresentaram potencial para, junto com testes complementares, serem inseridas na classificação de probióticos, levando a elaboração de um possível queijo com alegação de funcionalidade. 5. AGRADECIMENTOS Agradecimentos a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais FAPEMIG. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS - ANDRADE, C. R. G. (2012). Propriedades probióticas in vitro de Lactobacillus spp. isolados de queijos Minas artesanais da Serra da Canastra MG (Dissertação de mestrado). Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. - BRANCO, K. M., NARDI, R. M., MOREIRA, J. L., NUNES, A. C., FARIAS, L. M., & NICOLI, J. R. (2010). Identification and in vitro production of Lactobacillus antagonists from women with or without bacterial vaginosis. Brazilian Journal of Medical Biological Research, (43), COSTA, H. H. S., SOUZA, M. R., ACURCIO, L. B., CUNHA, A. F., RESENDE, M. F. S. & NUNES, A. C. (2013). Potencial probiótico in vitro de bactérias ácido láticas isoladas de queijo Minas artesanal da Serra da Canastra, MG. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, (65), FAO/WHO (2012). Food and Agricultural Organization/World Health Organization. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. London: FAO/WHO. - FERREIRA, C. L. L. F. (2012). Prebióticos e Probióticos. Atualização e Prospecção. Rio de Janeiro: Rubio Ltda. - GUEDES NETO, L. G. (2004). Produção de queijo de coalho em Pernambuco: isolamento e identificação de Staphylococcus spp. e de bactérias do ácido lático e de sua atividade antagonista in vitro. (Dissertação de Mestrado). Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.

6 - MATHUR, S.; SINGH, R. (2005). Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria - a review. International Journal of Food Microbiology, (105), NÓBREGA, J. E. (2012). Biodiversidade microbiana, descritores físico-químicos e sensoriais dosqueijos artesanais fabricados nas regiões da Serra da Canastra e do Serro, Minas Gerais. (Tese de Doutorado). Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. - OUOBA, L. I. I; LEI, V.; JENSEN, L. B. (2008). Resistance of potential probiotic lactic acid bacteria and bifidobacteria of African and European origin to antimicrobials: Determination and transferability of the resistance genes to other bacteria. International Journal of Food Microbiology, (121), RESENDE, M. F. S., COSTA, H. H. S., ANDRADE E. H. P., ACURCUI L. B., DRUMMOND A. F., CUNHA A. F., NUNES, A. C., MOREIRA J. L. S., PENNA, C. F. A. M., SOUZA, M. R. (2011). Queijo de minas artesanal da Serra da Canastra: influência da altitude das queijarias nas populações de bactérias acidoláticas. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, (63), SANT ANA. F. M. (2014). Bactérias do ácido lático de silagem, água, leite, soro fermento endógeno e queijo Minas artesanal da região de Campo das Vertentes: isolamento, identificação molecular, avaliações in vitro e in vivo do potencial probiótico. (Dissertação de Mestrado). Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. - SILVA, B. C.; JUNG, L. C. R.; SANDES, S. H. C.; ALVIM, L. B.; BOMFIM, M. R. Q.; NICOLI, J. R.; NEUMANN, E.; NUNES, A. C. (2013). In vitro assessment of functional properties of lactic acid bacteria isolated from faecal microbiota of healthy dogs for potential use as probiotics. Beneficial Microbes, (4),