QUANTIFICAÇÃO DE β-sitosterol E ESTIGMASTEROL NAS CASCAS DO TRONCO E FOLHAS DE SCUTIA BUXIFOLIA REISSEK 1

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1 QUANTIFICAÇÃO DE β-sitosterol E ESTIGMASTEROL NAS CASCAS DO TRONCO E FOLHAS DE SCUTIA BUXIFOLIA REISSEK 1 BOLIGON, Aline Augusti 2 ; DE BRUM, Thiele Faccim. 3 ; FROHLICH, Janaína Kieling 3 ; ZADRA, Marina 3 ; FROEDER, Amanda Luana Forbrig 4 ; GINDRI, Amanda Leitão 3 ; ATHAYDE, Margareth Linde 5 1 Trabalho de Pesquisa - UFSM 2 Doutoranda em Farmacologia, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil. 3 Mestranda em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil. 4 Aluna do Curso de Farmácia, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil. 5 Profª Adjunta do Departamento de Farmácia Industrial, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil. alineboligon@hotmail.com; thi_chaim@yahoo.com.br; marizadra@hotmail.com; janafrohlich@yahoo.com.br; amandafroeder@hotmail.com; amanda_gindri@hotmail.com; margareth@smail.ufsm.br RESUMO O fracionamento cromatográfico da fração em diclorometano obtida do extrato hidroalcóolico (70%) das cascas do tronco e das folhas de Scutia buxifolia Reissek (Rhamnaceae) conduziu a identificação e quantificação de dois esteróides, β-sitosterol e estigmasterol, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Os compostos são descritos pela primeira vez para a espécie S. buxifolia. Palavras-chave: Scutia buxifolia; CLAE; esteróides. 1. INTRODUÇÃO A família Rhamnaceae abrange plantas com os mais variados hábitos, desde ervas até árvores, ocorrendo em florestas tropicais e subtropicais de todo o mundo, sendo constituída por 58 gêneros com aproximadamente 900 espécies (HOUR et al., 1999). A espécie Scutia buxifolia, conhecida popularmente como coronilha, é uma planta nativa da América do Sul, ocorrendo principalmente no Rio Grande do Sul, Argentina e Uruguai. É usada popularmente como cardiotônica, hipotensora e diurética através da infusão em água da casca do tronco e folhas (WASICKY, WASICKY, JOACHIMOVITS, 1964). Apesar da 1

2 utilização popular, pouco se sabe sobre seus metabólitos secundários, com a exceção de alguns alcalóides ciclopeptídicos isolados por Morel et al. (2005) que demonstraram atividade antimicrobiana e quatro flavonóides isolados da fração acetato de etila das folhas de S. buxifolia por nosso grupo de trabalho (BOLIGON et al., 2009). Os esteróides são componentes importantes em vegetais e, devido a seus efeitos benéficos, nos últimos anos cresceu o interesse em quantificá-los em diferentes plantas (AGATER, LLEWELLYN, 1982; LING, JONES, 1995; ALASALVAR et al., 2003). O β- sitosterol é um dos mais prevalentes fitoesteróides, podendo ser relacionado estruturalmente com o colesterol; quimicamente o β-sitosterol é um parente muito próximo de colesterol, diferindo pela presença de um grupo etila na posição de carbono 24 da cadeia lateral. É também conhecido como (3 β)-estigmast-5-en-3-ol; 22:23-diidroestigmasterol; α- diidrofucosterol; σ-5-estigmasten-3-β-ol; 24 β-etil-5-σ-cholesten-3 β-ol ; α-fitoesterol; cinchol; cupreol; rhamnol; quebrachol e sitosterin. β-sitosterol é extremamente insolúvel em meio aquoso e pouco solúvel em meios lipídicos. É encontrado na natureza na forma de éster e glicosídeo, ambas as formas são mais solúveis do que o β-sitosterol em si (PEGEL, 1997). O β-sitosterol tem uma grande variedade de benefícios reconhecidos cientificamente para disfunções imunes, doenças inflamatórias e artrite reumática (BOUIC et al., 1996), hipercolesterolemia (LAW, 2000), câncer de mama e de cólon (AWAD, GAN, FINK, 2001) e hipertrofia benigna da próstata (AWAD, WILLIAMS, FINK 2001; AWAD et al., 2001). A ausência de estudos sobre a espécie, que é utilizada para fins terapêuticos, motiva o presente trabalho, que descreve os principais resultados obtidos no estudo fitoquímico da fração em diclorometano das cascas do tronco e das folhas de S. buxifolia. 2. METODOLOGIA Instrumentação e procedimentos gerais Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi realizada com Cromatógrafo a Líquido (Shimadzu, Kyoto, Japão), com injetor automático (SIL-20A), bombas DGU 20A5, com integrador CBM 20ª e detector UV-VIS (DAD-SPDM20A), Software LC SP1. Coleta e extração da planta As cascas do tronco e as folhas de S. buxifolia foram coletadas em Dom Pedrito (RS), em outubro de 2007 (coordenadas S e 54º27 44 W). A exsicata está arquivada no herbário do Departamento de Biologia na Universidade Federal de Santa Maria com número de registro SMBD As cascas e folhas foram secas à temperatura 2

3 ambiente e moídas separadamente em moinho de faca até formação de pó, resultando em uma massa de 651,52 g e 372,34 g, respectivamente, que foram submetidas a maceração em temperatura ambiente com etanol 70% por uma semana, com agitação diária. Após filtração, os extratos foram evaporados sob pressão reduzida, para remover o etanol, e após esta etapa, o extrato aquoso foi particionado sucessivamente com diclorometano, acetato de etila e n-butanol. Condições cromatográficas As análises cromatográficas foram realizadas em condições isocráticas utilizando coluna C 8 (4,6 mm x 150 mm) empacotada com partículas de diâmetro 5 µm. A fase móvel foi metanol:água (95:5, v/v) contendo 1,0% de ácido acético (NAIR, KANFER, HOOGMARTENS, 2006). A fase móvel foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,45 µm e desgaseificada em banho ultrassônico. O fluxo, o volume de injeção e o comprimento de onda foram 1,0 ml/min, 20 µl e 210 nm, respectivamente. Todas as operações cromatográficas foram realizadas em triplicata e em temperatura ambiente. Preparação das soluções do padrão e amostras para quantificação por CLAE Soluções de referência de β-sitosterol e estigmasterol foram preparadas na fase móvel, nas concentrações de 0,3 a 2,4 mg/ml. As frações diclorometânica das cascas do caule e das folhas foram dissolvidas na fase móvel. Todas as soluções foram previamente filtradas em membrana de 0,45 µm (Millipore) e injetadas em triplicata no aparelho. 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES As frações diclorometano das cascas do tronco e das folhas de S. buxifolia foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência com a finalidade identificar e quantificar os esteróides: β-sitosterol e estigmasterol (Figura 1) HO 5 7 1= 5 2= 5,22 Figura 1: Compostos identificados em S. buxifolia 3

4 Um método simples e rápido, baseado nas curvas de referência de β-sitosterol e estigmasterol, foi utilizado para a quantificação destes compostos por cromatografia líquida nas frações. Curva de calibração de β-sitosterol: Y = x 5410 (r = 0,9950) e curva de calibração para estigmasterol: Y = x 3750 (r = 0,9942). A Figura 2 mostra o cromatograma representativo da fração diclorometano das cascas do tronco (A), das folhas (B) e das soluções de referência (C). As frações de S. buxifolia possuem β -sitosterol (tempo de retenção - t R = 7,3 min, pico 1) e estigmasterol (t R = 8,6 min, pico 2). A fração diclorometano das cascas do tronco apresentou a maior quantidade de esteróides (40,4 % de β-sitosterol + estigmasterol) quando comparada a mesma fração das folhas (20%), sendo o β-sitosterol majoritário nas duas frações (Tabela 1). Figura 2: Cromatograma das cascas do tronco (A), das folhas (B) e das soluções de referência (C). β-sitosterol (pico 1) e estigmasterol (pico 2). 4

5 Tabela 1 - Quantificação de esteróides na fração diclorometano das cascas do tronco e folhas de S. buxifolia. β-sitosterol * Estigmasterol * S. buxifolia mg/g da fração (%) mg/g da fração (%) Casca do tronco 225 ± 0,05 22,5 129 ± 0,11 12,9 Folhas 132 ± 0,09 13,2 68 ± 0,07 6,8 * Resultados expressos na média ± D.P. de três determinações. 4. CONCLUSÃO Os compostos identificados e quantificados (β-sitosterol e estigmasterol) foram descritos pela primeira vez para S. buxifolia. A quantificação por cromatografia liquida comprovou que o β-sitosterol é um dos componentes majoritários na fração diclorometano das cascas do tronco e das folhas dessa espécie. A presença destes compostos na espécie estudada é importante do ponto de vista fitoquímico e farmacológico. No entanto, o potencial químico da espécie merece ainda ser ampliado e sua eficácia biológica avaliada. REFERÊNCIAS AGATER, I.B., LLEWELLYN, J. W. Determination of ß-sitosterol in meats, soya and other protein products. Food Chem., 8: 41-49, ALASALVAR, et al. Turkish tombul hazelnut (Corylus avellana L.). 2. Lipid characteristics and oxidative stability. Agric. Food Chem., 51: , AWAD, A.B., GAN, Y., FINK, C.S. Phytosterols as anticancer dietary components: evidence and mechanism of action. Nutr. Cancer, 36: 74-78, AWAD, A.B., WILLIAMS, H., FINK, C.S. Phytosterols reduce in vitro metastatic ability of MDA-MB-231 human breast cancer cells. Nutr. Cancer, 40: , AWAD, et al. Effect of phytosterols on cholesterol metabolism and MAP kinase in MDA-MB-231 human breast cancer cells Eur. J. Cancer Prev., 10: ,

6 BOLIGON, et al. HPLC Analysis and Phytoconstituents Isolated from Ethyl Acetate Fraction of Scutia buxifolia Reiss. Lat. Am. J. Pharm., 28: , BOUIC, et al. Beta-sitosterol and beta-sitosterol glucoside stimulate human peripheral blood lymphocyte proliferation: implications for their use as an immunomodulatory vitamin combination. Int. J. Immunopharmac., 18: , HOUR et al. Inhibition of eleven mutagens by various tea extracts, (-)epigallocatechin-3-gallate, gallic acid and caffeine. Food Chem. Toxicol., 37: , LAW, M.R. Plant sterol and stanol margarines and health. West J Med., 173: 43-47, LING, W.H., JONES, R.J.H. Minireview Dietary Phytosterols: A Review of Metabolism, Benefits and Side Effects. Life Sci., 57: , MOREL, et al. Cyclopeptide alkaloids from Scutia buxifolia Reiss and their antimicrobial activity Phytochemistry, 66: , NAIR, V.D.P., KANFER, I., HOOGMARTENS, J. Determination of stigmasterol, β-sitosterol and stigmastenol in oral dosage forms using high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 41: , PEGEL, K.H. The importance of sitosterol and sitosterolin in human and animal nutrition. S. Afr. J. Sci., 93: , WASICKY, R., WASICKY, M., JOACHIMOVITS, R. Erstuntersuchungen na Coronilha Scutia buxifolia Reissek. Planta Med., 12: 13-25,