Introdução. Coleta das Amostras de Saliva. Hormônios Esteróides na Saliva. Nesta Edição

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2 Análises Hormonais na Saliva Página 2 Métodos Analíticos para Hormônios Salivares A medida precisa da concentração dos hormônios na saliva pode ser realizada por diferentes métodos analíticos uma vez que estes apresentam boa correlação com as amostras de sangue (Figura1). No entanto, alguns métodos apresentam ap algumas restrições, principalmente relacionadas ao sua sensibilidade e especificidade. O método mais comumente utilizado é o Radioimunoensaio (RIE), devido a sua alta sensibilidade e especificidade, o que permite determinar com precisão hormônios de peso molecular muito baixo na faixa de nanogramas (10-9) e picogramas (10-12). Na técnica de Radioimunoensaio utilize-se anticorpos monoclonais específicos conjugados com radioisótopos para quantificar os ensaios. O isótopo mais utilizado é o Iodo 125, fator que Figura1.Correlação dos níveis de cortisol sérico e salivar requer do laboratório algumas medidas operacionais especiais algumas vantagens, porém muitas restrições. Dentre as como: maior investimento em biossegurança, profissionais vantagens estão a simplicidade, rapidez, baixo custo e altamente qualificados e registro na CNEN (Comissão Nacional a possibilidade de automação. Contudo dentre as de Energia Nuclear) (Figura 2) desvantagens estão as reações cruzadas, possiveis Devido a estes fatores operacionais muitos laboratórios optam interferentes das amostras salivares (mucinas que por técnicas que empregam métodos não isotópicos, como o podem interferer na cor co da reação) a instabilidade de Enzimaimunoensaio (ELISA). alguns reagentes e mais passivel a erros operacionais As análises hormonaiss salivares realizadas por ELISA (Enzyme- (Figura 3). linked Immunosorbent Assay) baseiam-se na imobilização de Atualmente outros médodos analíticos estão sendo um dos componentes, em fase sólida, e na utilização de um testados conjugado ligado a uma enzima. Como o substrato forma um Imunofluorescencia e a Espectrometria de Massa. produto colorido, a alteração de cor é mon monitorada visualmente ou por meio de espectrofotômetro para este tipo de análise como a MAPHERSON, R.A., que relaciona a quantidade de substância dosada à intensidade de cor. Devido as caracteristicas do ensaio enzimático para as análises de hormônios saliva, o método de ELISA traz Figura 3 Ensaio ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) Figura 2 Radioimunoensaio (RIE) (Laboratório e Kit Analitico)

3 Análises Hormonais na Saliva Página 3 A técnica de Radioimunoensaio apresenta precisão, alta sensibilidade e especificidade para determinação de hormônios de baixo peso molecular, na ordem de nanograma (109) e picogramas (10-12). Figura 4. Estrutura química de estrógenos naturais e sintéticos. das células vermelhas e desta forma os hormonios são Diferenças Analíticas removidos antes mesmo da análise. Este fenómeno foi descrito por Frank Z. Stanczyk. Isto ocorre principalmente Sangue x Urina x Saliva com a progesterona e em menor grau com os outros hormônios. Nos testes sorológicos de progesterona nos Hormônios no Sangue pacientes em terapia hormonal transdérmica, não são observados o aumento nos níveis de progesterona mesmo Exames de sangue são comumente usados para determinar os níveis de hormônios pela maioria dos médicos. Os exames hormonais no sangue determinam a quantidade total de hormônios (livres e conjugados). Este tipo de teste é atualmente considerado como o menos preciso de todos os métodos disponíveis. Os testes sorológicos são incapazes de distinguir os hormônios na forma ligada às proteínas carreadoras (forma inativa do hormônio) da sua forma livre e biologicamente ativa. Os testes sorológicos representam apenas uma estimativa aproximada dos níveis hormonais, o pode levar o clinico ao diagnóstico inadequado, uma vez que os níveis hormonais séricos, na maioria das vezes estão dentro dos limites de normalidade, porém quando os níveis depois de semanas de aplicação, já nos testes de saliva saliva, niveis aumentados de progesterona podem ser detectados após duas horas do seu uso. Estudos clínicos realizados pela Academia Americana de Anti-Envelhecimento em mais de 300 pacientes demonstrou que todos os pacientes cujos níveis hormonais foram considerados em níveis ótimos por testes sangüíneos, apresentavam em níveis excessivamente altos de progesterona com base nos testes de saliva. As doses utilizadas para alcançar ótimos níveis séricos foram muito maiores do que as doses fisiológicas para atingir os níveis ótimos nos testes de saliva. Em todos os casos as doses dos pacientes foram reduzidas até que fossem atingidos os niveis ótimos pelo testes de saliva. de hormônios livres e ativos são testados e que as deficiências são identificadas. Além disso, os resultados das análises no soro refletem apenas a quantidade de hormônios fora das células e não refletem os níveis de hormonios disponíveis para as células e tecidos alvos cumprir sua função fisiologica. Outro fator importante, é que ao monitorar os níveis hormonais quando o paciente está em terapia hormonal com transdérmicos (creme/gel) as análises séricas não menos precisas ainda, isto porque o hormônio exógeno é absorvido através da pele para corrente sanguinea. Já no sangue estes se ligam às membranas dos glóbulos vermelhos, a fim de minimizar as interações desfavoráveis com o meio aquoso ligando assim a camada lipoproteica uma vez que a maioria dos hormônios tem afinidades pelas gorduras. Assim, quando coletada a amostra de sangue e o material é centrifugado centrifugado, para liberação do soro ou plasma, ocorre a precipitação dos Figura 6. Amostras da coleta de sangue sangu e separação do soro

4 Análises Hormonais na Saliva Hormônios na Urina 24 horas Página 4 A determinação de hormônios em urina de 24 horas é um dos métodos mais precisos, mais difíceis e mais caros. Contudo, os testes hormonais em urina de 24 horas apresentam uma grande inconveniência que é a sua própria de coleta. Coletar urina de 24 horas, implica recolher todas as urinas de todas micções por um dia inteiro, sem que seja perdido nada de volume, sob risco de vieses nos resultados. Outro fator limitante é o armazenamento das coletas urinárias uma vez que mesmas devem ser mantidas sob refrigeração (não é pertimido uso de conservantes), durante todo periodo de coleta, o que pode trazer certo desconforto e constragimento ao paciente. Contudo, eliminando estes problemas com a coleta, o teste urinário permite monitorar a terapia hormonal bioidêntica através da obtenção de uma média diária de seus níveis hormonais ao invés de um ponto específico obtido no momento exato em que você fez a coleta de sangue ou da saliva. Ao final deste informativo há uma lista de inúmeras publicações que comprovam que o teste de saliva é superior aos exames de sangue e referências sobre a validação do mesmo. Como Solicitar os Exames de Saliva Os exames salivares podem ser solicitados pelo médico de forma isolada ou através Feminino, Masculino, Menopausa, Andropausa, Envelhecimento, Stress, Sono, entre outros, de acordo com a necessidade clinica. de Perfis Hormonais (Hormonal O kit para coleta de saliva poderá ser retirado no laboratório pelo paciente, familiar,amigo ou ainda ser enviado, para sua casa, escritório ou empresa. O kit traz as instruções de coleta impressas na sua embalagem, escritas de maneira didática e de fácil compreensão. Os testes sorológicos são incapazes de distinguir os hormônios na forma ligada às proteínas carreadoras (forma inativa do hormônio) de sua forma livre e biologicamente ativa. Hormônios na Saliva A análise hormonal na saliva mede a forma livre e, biologicamente ativa de vários hormônios. Os testes na saliva foi aprovado amplamente pela comunidade científica por refletir de forma precisa os níveis hormonais presentes no interior das células, onde a ação dos hormônios ocorrem, enquanto que os exames de sangue medemm os hormônios fora das células. A análise salivar hoje é considerada como padrão-ouro para hormônios pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e são amplamente utilizados pela NASA em suas pesquisas. Apesar da recomendação da OMS, muitas vezes o método ainda é criticado e negligenciado por muitos médicos, sendo que muitos ainda se recusam a solicitar os exames, devido a falta de informação sobre as diferenças sobre testes de sangue e saliva, levando-os geralmente a fazer criticas sobre a validação dos testes salivares. Figura 5 Kit de Coleta de Saliva

5 Página 5 Análises Hormonais na Saliva Hormônios dosados na Saliva Resultados Muitos são os hormônios que podem ser determinados na saliva tais como os hormônios esteróides, peptidicos e algumas aminas. Dentre os quais podemos destacar: Os laudos de resultados dos exames salivares são liberados de 10 a 15 dias depois da chegada do material no Laboratório ou conforme o seu grau de complexidade. Estrona (E1), Estradiol (E2), Estriol (E3), Progesterona, Testosterona, DHEA (Dehidroepiandrosterona), SDHEA (Sulfato de DHEA, Androstenediona, 17OH-Progesterona Laudos (17 OHP), DHT (Diidrotestosterona), Melatonina, Insulina, hgh, Grelina, PPY e Leptina, além de citocinas como: IL6, Os laudos para as análises salivares são elaborado elaborados com IL2 e TNF-α, entre outras. software específico que visam apresentar os resultados de forma didática e de fácil interpretação. Cada resultado é Envio das Amostras de Saliva ao Laboratório apresentado de forma descritiva e também gráfica de acordo com a faixa etária do paciente. Este modelo de As amostras de saliva deverão ser coletadas de acordo com as laudo permite ainda que o próprio paciente possa instruções do kit, salvo a necessidade de outra orientação acompanhar a sua evolução no tratamento ou na resposta à específica. Para cada horário de coleta há um tubo terapêutica, fato que muito auxilia a adesão ao tratamento. devidamente identificado em o paciente deverá anotar o horário da coleta e o nome. Após o término das coletas o material deve ser enviado diretamente para o laboratório para análise. Devem acompanhar as amostras de saliva o Formulário de Identificação do Paciente, médico solicitante e os exames ou perfil a serem realizados e o Formulários de Levantamento Indivudualizado de Sinais e Sintomas (LISS), devidamente preenchido. Para o envio das amostras não é necessário o envio das mesmas sob refrigeração, salvo Os laudos de exames salivares são apresentados de forma descritiva e também em gráficos de acordo com a faixa etária do paciente. áquelas vindas de locais em que o SEDEX pode demorar mais de 72 horas. Nestes casos, as amostras devem ser refrigeradas e enviadas acondicionadas em caixa de isopor com gelo em gel. Figura 7 Diferentes tipos de laudos salivares conforme os perfis solicitados

6 Bibliografia Frank Z. Stanczyk, PhD, Richard J. Paulson, MD, e Subir Roy, MD. Administração percutânea da progesterona: Os níveis no sangue e de protecção do endométrio. Menopausa: The Journal of The American Menopause Society North Vol. 12, No. 2, pp Kaufman E, Lamster IB. The diagnostic applications of saliva- a review. Crit Rev Oral Biol Med 2002; 13(2): Tabak LA. A revolution in biomedical assessment: the development of salivary diagnostics. J Dent Educ 2001 Dec; 65(12): Laine MA, Ojanotko AO. Progesterone metabolism in human saliva in vitro. J Steroid Biochem Mol Biol Jul-Ago; 70(1-3): Chiappin S, Antonelli G, Gatti R, De Palo EF. Saliva specimen: a new laboratory tool for diagnostic and basic investigation. Clinica Chimica Acta 2007 Aug; 383(1-2): Vesper HW, Botelho JC, Shacklady C, Smith A, Myers GL 2008 CDC project on standardizing steroid hormone measurements. Steroids 73: Stanczyk FZ, Lee JS, Santen RJ 2007 Standardization of steroid hormone assays: why, how, and when? Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16: Leonard Wartofsky and David J. Handelsman Standardization of Hormonal Assays for the 21st Century - J Clin Endocrinol Metab, 95(12): Papacosta E, Nassis GP. Saliva as a tool for monitoring steroid, peptide and immune markers in sport and exercise science.j Sci Med Sport Sep;14(5): Epub 2011 Apr 7.