Diagnóstico molecular de doenças infecciosas. Jorge L M Sampaio

Transcrição

1 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas Jorge L M Sampaio

2 Panorama atual As possibilidades e oportunidades são inúmeras Novas tecnologias com custo elevado Pressão dos pagadores para redução dos custos em saúde Redução da atuação humana com automação da extração, amplificação e interfaceamento com sistema de apoio àdecisão Nível de automação depende do número de exames consolidação de laboratórios de análises clínicas O grande desafio éreduzir custos mantendo ou aumentando a qualidade do resultado

3 Perguntas Quais as doenças (excetuando as virais) nas quais os métodos moleculares são essenciais? Que tipos de alvos devem ser prioritariamente selecionados e quais as principais estratégias? Quais as principais metodologias aplicáveis ao laboratório clínico?

4 Problema O uso de antimicrobianos que alteram a microbiota entérica estárelacionado àocorrência de diarréia causada por Clostridium difficile. Em vários casos nos quais háevidências clínicas e epidemiológicas sugerindo essa etiologia, a pesquisa das toxinas A e B nas fezes énegativa. Algumas cepas são mais virulentas em função de maior produção e toxinas

5 Analisando Qual o padrão ouro? Cultura em meio seletivo seguido de teste de toxigenicidade Prazo de 5 a 7 dias Como é possível detectar

6 Fonte: Voth, 2005 C. difficile

7 Fonte: Sloan, 2008

8

9 Sloan et al., 2009 Performance do teste Clostridium difficile

10 Outra estratégia Fonte: Espy, 2006 Animação

11 Reanalisando Preparo de reagentes de amplificação (área 1) Extração manual (área 2) Montagem da reação (área 2) Amplificação e análise (área 3) É possível simplificar?

12 Realmente simplificando: GeneXpert

13 Realmente simplificando Pesquisa do DNA de C. difficile PCR em tempo real GeneXpert

14 Neisseria gonorrhoeae Paciente de 25 anos, sem parceiro sexual fixo, apresenta cervicite e uretrite. Foram coletadas amostras endocervical e uretral: Bacterioscópico com raros diplococos Gram-negativos intracelulares Cultura em meio seletivo para Neisseria: NEGATIVA O médico contesta os resultados O que pode ter ocorrido e o que pode ser feito?

15 Viabilidade bacteriana em meio de transporte Fonte: Rishmawi, 2007

16 Neisseria gonorrhoeae Hjelmevoll, amostras (185 homens e 57 mulheres) 37 positivas por cultura e Rt-PCR para gene pora 15 positivas apenas por RT-PCR, confirmadas por sequenciamento de rrna 16S Alerta: podem ocorrer resultados falsamente positivos em função da similaridade dom espécies não patogênicas.

17 Chlamydia trachomatis Sem parede celular Patógeno de multiplicação intracelular obrigatória Uretrite Cervicite Salpingite infertilidade/esterilidade

18 Métodos disponíveis Isolamento em cultura de células McCoy padrão ouro Imunofluorescência sensibilidade 88% RT-PCR/Amplicor sensibilidade 97%

19 SeptiFast Detecção de DNA bacteriano ou fúngico em sangue total Escherichia coli Klebsiella sp. Enterobacter sp. Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas maltophilia Staphylococcus aureus SCN Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp. Enterococcus faecalis Enterococcus faecium

20 SeptiFast Detecção de DNA bacteriano ou fúngico em sangue total Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida krusei * Candida glabrata * Aspergillus fumigatus

21 Tempo de Análise Hemocultura Transporte/abertura de ficha 1 hora Incubação em equipamento com leitura a cada 10 min Detecção em 6 a 72 horas Bacterioscópico e semeadura ou inoculação e sistema de automação 8 a 24 horas identificação Total 15 a 96 horas para possível intervenção SeptiFast 3 ml de sangue total Transporte/abertura de ficha Extração do DNA = 2 h Amplificação do DNA, análise e identificação da espécie = 3 h Total 6 horas para possível intervenção

22 Bases Moleculares Bactérias de crescimento rápido e fungos têm múltiplos operons de rrna Alvo com múltiplas cópias no cromossomo maior sensibilidade

23 rrna E. coli -GenBank

24 Como Funciona Várias reações de PCR Análise de curva de melting

25 Estudos Recentes -ICAAC 2008 Tsalik et al. Duke University Adultos febris atendidos no setor de emergências (TA > 38,3⁰C) Septifast e 1 par de hemoculturas 142 pacientes recrutados, 20% com hemocultura positiva Definição de casos: Confirmado Provável Possível

26 Schaub et al., Suíça ICAAC 2008

27 Testes positivos

28 Comparando os Métodos Padrão Ouro a Clínica

29 Considerações Hánecessidade de estudos para a avaliação do impacto na mortalidade e tempo de internação Sensibilidade semelhante à hemocultura Menor tempo de resposta Redirecionamento do tratamento na sepse por P. aeruginosa, A. baumannii, S. maltophilia ou Candida krusei/c. glabrata?

30 Caso clínico Paciente de 34 anos, sexo masculino, HIV soropositivo apresenta, háduas semanas, febre, diarréia e dor em membro inferior direito em topografia de cicatriz cirúrgica. Hácerca de três meses havia sido submetido a cirurgia ortopédica com colocação de haste de fixação em função de fratura traumática de fêmur. A tomografia computadorizada de MI evidenciou abscesso no sítio cirúrgico e sinais de osteomielite.

31 Caso clínico O paciente foi submetido àdrenagem cirúrgica da lesão e o material enviado para cultura geral, fungos e micobactérias Foram iniciados ceftazidima e vancomicina Após duas semanas não houve crescimento bacteriano ou fúngico Em função da persistência da febre foi solicitada a coleta de três hemoculturas

32 Giemsa

33

34 Identificação

35 Identificação Realizada extração do DNA do crescimento em Karmali. Amplificação e sequenciamento parcial do gene que codifica a subunidade 16S do RNA ribossômico (rrna 16S).

36 Resultado do alinhamento da seqüência parcial do rrna 16S com os depósitos do GenBank 100% de similaridade com Helicobacter fenneliae

37 Outras aplicações Identificação do Complexo M. tuberculosis e diferenciação de M. bovis e M. bovis BCG.

38 Culturas para micobactérias escarro ou lavado bronco-alveolar Isolados Identificados na Rotina - Jan a Dez Fleury N % Complexo M. tuberculosis 55 55,0 Mycobacterium avium/intracellulare 22 22,0 Mycobacterium abscessus 8 8,0 Mycobacterium kansasii 7 7,0 Mycobacterium gordonae 2 2,0 Mycobacterium spp. 6 6,0

39 Barnes PF, Cave MD. Molecular epidemiology of tuberculosis. N Engl J Med. 2003;349(12):

40 Por que PCR Multiplex? 50% dos casos identificados em uma única reação redução de custo redução da carga de trabalho agilidade Diferenciação de M. bovise M. bovisbcg (pirazinamida R)

41 Sequências alvo no multiplex IS6110 complexo MTB hsp65 todas as micobactérias Espaçadores 33 e 34 região DR diferenciação de M. bovis e M. bovis BCG Yeboah-Manu D, Yates MD, Wilson SM. Application of a simple multiplex PCR to aid in routine work of the mycobacterium reference laboratory. J Clin Microbiol. 2001;39(11):

42 Região DR DR 30 DR 31 DR 32 DR 37 DR 38 DR 39 DR 40 DR 41 DR 42 M.tuberculosis DR 30 DR 31 DR 25 DR 32 DR 33 DR 34 DR 35 DR 36 DR 37 M.bovis selvagem 99 bp DR 30 DR 31 DR 25 DR 32 DR 33 DR 33 DR 34 DR 35 DR 36 M.bovis BCG 172 bp 99 bp

43 PCR Multiplexo

44 O que fazer para identificar as demais espécies rrna 16S (rrs) hsp65 ITS 16S-23S soda gyrb rpob

45 Alvos mais Utilizados rrna 16S (rrs) Aproximadamente bp Regiões hipervariáveis A ( ) e B ( ) Na prática Não permite diferenciação: espécies do complexo MTB M. abscessus em. chelonae M. zulgai em. malmoense M. kansasii em. gastri M. ulcerans em. marinum M. shimoidei em. triviale

46 Alvos mais Utilizados hsp bp Na prática = 441bp Permite diferenciação M. abscessus em. chelonae M. zulgai em. malmoense M. kansasii em. gastri Não permite diferenciação Espécies do Complexo MTB

47 Seqüenciamento de DNA Fundamentos

48 Estrutura dos Ácidos Nucleicos

49 Nucleotídeos Estrutura dos Ácidos Nucleicos

50 DNA RNA

51 Ligação Fosfodiéster

52 Ligação Fosfodiester

53 Dideoxinucleotídio Frederick Sanger Prêmio Nobel Química

54 Sequenciamento de DNA cycseqpc.exe

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59 O laboratório clínico hoje Extração automatizada

60 Estação para preparo automatizado de reações

61 Automação HIV-HCV-HBV

62 Automação

63 Automação

64 Automação