UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

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1 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICA HISTOQUÍMICA DE MENSURAÇÃO DE LIPÍDIOS DA EPIDERME DE CÃES E MENSURAÇÃO DE LIPÍDIOS DA EPIDERME DE CÃES ATÓPICOS ANTES E APÓS REPOSIÇÃO TÓPICA DE LIPÍDIOS E CERAMIDAS MARCELA CAZAGRANDE SALVADOR BOTUCATU - SP Outubro/2014

2 iii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Padronização de técnica histoquímica de mensuração de lipídios da epiderme de cães e mensuração de lipídios da epiderme de cães atópicos antes e após reposição tópica de lipídios e ceramidas MARCELA CAZAGRANDE SALVADOR Dissertação de mestrado apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista UNESP, campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Ass. Dr. Luiz Henrique de Araújo Machado. Botucatu - SP Outubro/2014

3 ii Autor: Marcela Cazagrande Salvador Título: Padronização de técnica histoquímica de mensuração de lipídios da epiderme de cães e mensuração de lipídios da epiderme de cães atópicos antes e após reposição tópica de lipídios e ceramidas. COMPOSIÇÃO DA BANCA EXAMINADORA Prof. Ass. Dr. Luiz Henrique de Araújo Machado Orientador Departamento de Clínica Veterinária FMVZ UNESP Botucatu Prof. Ass. Dr. Viciany Erique Fabris Membro Departamento de Patologia Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Botucatu Prof. Adj. Marconi Rodrigues Farias Membro Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR) Curitiba Data da defesa: 01 de outubro de 2014

4 iii Dedico essa dissertação aos meus pais, Marli e João, meus grandes mestres e conselheiros, fonte de força, segurança e amor. Meus grandes exemplos. Dedico também a todos os meus animais, com os quais muito aprendi, por todo o amor puro e companheirismo incondicionais, especialmente ao Bob.

5 iv Agradecimentos À Deus, por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e me suprir em todas as minhas necessidades. À toda minha família e amigos, pelo carinho, incentivo, apoio e por sempre acreditarem em mim, por não me deixarem desistir. Sem vocês isso não seria possível. Sou muito honrada por tê-los em minha vida. Ao meu orientador, Prof. Ass. Dr. Luiz Henrique de Araújo Machado, pela confiança, paciência, ensinamentos e amizade, desde os tempos da graduação. Terei sempre muita admiração por esse grande mestre. À mestranda Tatiany Silveira, por toda sua dedicação e enorme contribuição a esse trabalho, pelas boas risadas, companheirismo e pela grande amizade, que apenas se iniciou. Ao Prof. Dr. Hélio Amante Miot, por toda a atenção e paciência dispensadas, pelos ensinamentos e pela participação indispensável neste trabalho. Às alunas e agora residentes Bianca Mariani e Beatriz Berbel, por toda a dedicação, competência e bom humor com que ajudaram a conduzir todo o trabalho. Ao doutorando Fabrízio Grandi e Profª Dra. Noeme Sousa Rocha, pelas ideias para a realização desse trabaho e pelas orientações e sugestões no decorrer do desenvolvimento do mesmo. Aos meus colegas de trabalho e toda a equipe do Hospital Veterinário Piracicaba, pelo apoio, compreensão e possibilidade de adaptação dos meus horários de trabalho às necessidades do curso de mestrado. Aos amigos Marcela Manzi, Veridiana von Zuben e Luis Henrique Gomes por me receberem de portas abertas em sua casa durante as viagens e pela amizade. À FAPESP pelo apoio fornecido em forma de auxílio.

6 v LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS DAC G Kg Mg dermatite atópica canina gramas quilogramas miligramas % porcentagem Th2 linfócitos T helper tipo 2 IgE H1 Α Γ Imunoglobulina E receptor de histamina alfa gama marca registrada nº número IV X via intravenosa vezes C graus Celsius µm micrometro > maior < menor = igual H&E SRD maior ou igual menor ou igual Hematoxilina e Eosina sem raça definida

7 vi SUMÁRIO RESUMO... 1 ABSTRACT... 3 CAPÍTULO I REVISÃO DE LITERATURA REVISÃO DE LITERATURA Dermatite Atópica Canina Técnicas de mensuração de lipídios da epiderme Reposição tópica de lipídios e ceramidas Referências CAPÍTULO II - OBJETIVOS CAPÍTULO III CEUA E SELEÇÃO DOS ANIMAIS CAPÍTULO IV PRIMEIRO MANUSCRITO CAPÍTULO V SEGUNDO MANUSCRITO CAPÍTULO VI CONCLUSÕES FINAIS CAPÍTULO VII NORMAS DAS REVISTAS APÊNDICES ANEXOS... 90

8 1 SALVADOR, M.C. Padronização de técnica histoquímica de mensuração de lipídios da epiderme de cães e mensuração de lipídios da epiderme de cães atópicos antes e após reposição tópica de lipídios e ceramidas. Botucatu, 2014, 92p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO A dermatite atópica canina é uma dermatopatia de origem genética, cujo principal sintoma é o prurido. Uma de suas principais características é o comprometimento da barreira epidérmica cutânea, causado por deficiência na quantidade de lipídios na epiderme destes cães. Não obstante, na literatura consultada não há uma padronização de técnica de coloração histoquímica para avaliação destes lipídios epidérmicos em cães. Este trabalho objetivou padronizar uma técnica digital de mensuração de lipídios da epiderme de cães normais utilizando-se colorações histoquímicas específicas e, por meio da coloração padronizada, mensurar a quantidade de lipídios epidérmicos de cães atópicos antes e após o tratamento com reposição tópica de lipídios, além de comparar a quantidade de lipídios da epiderme de cães atópicos com a de cães saudáveis. Para a padronização da técnica de coloração histoquímica foram utilizados vinte e cinco animais saudáveis, sendo as amostras submetidas a três colorações: hematoxilina & eosina, Sudan Red e Oil Red O. Em seguida, as amostras passaram por avaliação entre patologistas e pelo programa de análise de imagem digital, confrontando as duas técnicas. Após padronização, comparou-se a quantidade de lipídios da barreira epidérmica entre 15 cães atópicos e 30 cães saudáveis, comparando a quantidade de lipídios da epiderme da região cervical com a região axilar. Os resultados mostraram concordância entre a avaliação dos patologistas e o programa de análise digital, que ambas as colorações se prestam a este fim, mas que Sudan Red é a coloração que melhor permite a mensuração dos lipídios da barreira epidérmica e, quando comparada a camada lipídica da epiderme de cães saudáveis e cães atópicos, nota-se que estes possuem uma quantidade lipídica reduzida e, após o tratamento com reposição tópica de lipídios, os cães atópicos apresentam aumento significativo da quantidade de lipídios da barreira epidérmica, com melhora significativa dos sinais clínicos avaliados. Também se

9 2 observou que, comparando-se os animais do grupo dos atópicos entre si, os lipídios da região cervical apresentavam menor quantidade do que os da região axilar. Esses resultados nos mostram que a reposição tópica de lipídios em cães que apresentam dermatite atópica exerce um papel fundamental na reparação da barreira epidérmica cutânea, que a análise digital pode ser uma opção menos subjetiva de avaliação e que pode-se usar técnica histoquímica na prática clínica para diagnóstico e monitoração do tratamento de cães atópicos. Palavras chave: ceramidas; dermatite atópica canina; histoquímica; lipídios.

10 3 SALVADOR, M. C. Standardization of histochemical technique for measurement of epidermal lipids of dogs and measurement of epidermal lipids of atopic dogs before and after topical replacement of lipids and ceramides. Botucatu, p. Master s Dissertation in Veterinary Medicine School of Veterinary Medicine and Animal Science. São Paulo State University, Botucatu. ABSTRACT Canine atopic dermatitis is a multifactorial skin disease with genetic origin, that causes itching as the main symptom. One of the disease s main characteristics (and a major causative factor) is the impairment of the epidermal skin barrier. This is caused, primarily, by a deficiency in the quantity of lipids in the epidermis of atopic dogs. However, no standardized histochemical technique for the evaluation of epidermal lipids in dogs exists in the literature. The objectives of this study were firstly, to standardize the measurement of lipids of the epidermis of normal dogs using specific histochemical staining. Secondly, using this standardized staining technique, ascertain the amount of epidermal lipids in atopic patients before and after treatment with topical replacement of lipids and compare with measurements from healthy dogs. For standardization of staining, epidermal samples from 25 healthy animals were taken and subjected to hematoxylin and eosin, Sudan Red and Oil Red O staining. The samples were processed using visual semi-quantitative assessment and by the digital image analysis program. After standardization, we compared the quantity of lipids in the epidermal barrier of 15 atopic dogs and 30 healthy dogs. Samples were taken from neck and axillae in all participating animals to assess any differences in lipid content between body regions. The results showed that Sudan Red provides the most accurate measurement of skin barrier lipids when comparing the lipid layer of the epidermis of healthy dogs with atopic dogs. It was found that atopic dogs exhibit a reduced quantity of lipids in the epidermal barrier prior to treatment and show a significant increase after topical replacement of lipids. Comparisons between individuals within the atopic group of animals showed that lipids from the neck occurred in smaller quantities than the axillary region. These results show that topical replacement of lipids in dogs with atopic dermatitis plays a key role in repairing the epidermal skin barrier. The histochemical staining technique can

11 4 be used effectively and efficiently in clinical practice for diagnosis and monitoring in the treatment of atopic dogs. Key words: ceramides; canine atopic dermatitis; histochemistry; lipids.

12 5 CAPÍTULO I REVISÃO DE LITERATURA

13 6 1. REVISÃO DE LITERATURA 1.1. DERMATITE ATÓPICA CANINA Atopia é definida como a produção de anticorpos IgE específicos em reação a uma exposição prévia a alérgenos ambientais comuns, ficando o indivíduo sensibilizado ao alérgeno em questão, sem necessariamente apresentar manifestações clínicas. Já na doença atópica, o indivíduo apresenta sintomas clínicos ao entrar em contato com um ou mais alérgenos ambientais, podendo apresentar dermatite atópica, asma, rinite e rinoconjuntivite alérgicas (SCOTT et al., 1996; HILLIER, 2002; HALLIWELL, 2006). A dermatite atópica canina é a manifestação mais comum de atopia nos cães, acometendo cerca de 10% da população canina de todo o mundo (HILLIER & GRIFFIN, 2001). Ela é definida como uma doença alérgica inflamatória e pruriginosa, crônica, recorrente, geneticamente predisposta, com sintomas clínicos característicos associados a uma exacerbada produção de anticorpos IgE, que pode ser precipitada ou agravada pela exposição tegumentar à alérgenos microbianos, ambientais, trofoalérgenos e irritantes primários (HALLIWELL, 2006). Os indivíduos atópicos fabricam IgE constantemente e possuem níveis excepcionalmente altos dessa classe quando comparados a cães normais (TIZARD, 1998a). Atualmente reconhece-se que a dermatite atópica pode não ser somente mediada por IgE, ou pelo menos não seja possível comprovar isso em alguns pacientes. Outros mecanismos estão envolvidos na patogenia, tais como a diminuição da função na barreira epidérmica, redução da produção de peptídeos antimicrobianos por células epidérmicas, inflamação causada por toxinas microbianas, polimorfismos genéticos e a influência das condições ambientais no desenvolvimento da alergia em indivíduos geneticamente predispostos (HALLIWELL, 2006; DEBOER, 2010). Há relatos de predisposição racial, que varia com o local e o tempo, mas as raças Golden Retriever e Pastor Alemão são as mais relatadas segundo o estudo de Jaeger et al. (2009). Alguns autores relatam uma maior incidência de dermatite atópica em fêmeas, embora a predisposição sexual não tenha sido

14 7 comprovada (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996; JAEGER et al., 2009). A faixa etária mais frequentemente acometida pela dermatite atópica em cães varia de seis meses a sete anos de idade, com 70% dos cães apresentando os sinais clínicos entre um a três anos de idade. Existem relatos de animais que desenvolveram a dermatite atópica antes de um ano de idade, o que pode ser reflexo do ambiente onde os filhotes vivem, da carga alérgena do ambiente ou de uma grande influência genética (quando ambos os genitores apresentam dermatite atópica) (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996). O prurido geralmente se apresenta como sinal clínico primário, sendo a alopecia, presença de crostas e liquenificação os sinais secundários a uma possível automutilação e infecção bacteriana/fúngica. As áreas mais comumente afetadas são: face, extremidades dos membros, abdômen ventral, região inguinal, axilas, pavilhões auriculares e conduto auditivo externo (FARIAS, 2007; MUELLER, 2008; FAVROT, 2009; HILLIER, 2002) O epitélio funciona como a primeira linha de defesa entre o organismo e o meio ambiente. Perturbações na barreira epidérmica favorecem a penetração de microrganismos, irritantes e alérgenos, o que aumenta o risco de sensibilização, pois permitem a interação entre o alérgeno e as células apresentadoras de antígenos, provocando o aparecimento do processo inflamatório (LAU-GILLARD et al., 2009; CORK et al., 2006). Uma característica da dermatite atópica e um de seus principais fatores causadores é o comprometimento do processo de queratinização e formação do estrato córneo, o que leva a diminuição da função de barreira epidérmica, a perda de água transepidérmica e consequente redução da hidratação da pele (LEUNG et al., 2004), além de causar uma redução em sua proteção contra traumas mecânicos, radiação ultravioleta e antígenos exógenos, como os alérgenos ambientais (DEBOER, 2010). Essa disfunção da barreira é definida como anormalidades na morfologia e na quantidade de lamelas lipídicas intercelulares do estrato córneo (OLIVRY, 2011) e deficiências de ceramidas e na expressão da filagrina em alguns cães (MARSELLA, 2011).

15 8 O estrato córneo é composto por células terminalmente diferenciadas, os corneócitos, e lamelas lipídicas extracelulares que preenchem os espaços entre estes. Os lipídios extracelulares do estrato córneo se originam dos corpúsculos lamelares, também chamados queratinossomos, aparecendo inicialmente nos corneócitos da camada espinhosa superior e produzidos abundantemente nos da camada granulosa. Os corpúsculos lamelares migram para a membrana apical das células da camada granulosa, se fundem com elas e então liberam seu conteúdo para o espaço intercelular, sob a forma de lamelas lipídicas, onde atuam como cimento entre as células, ajudando a prevenir a perda de água e a penetração de material exógeno (como alérgenos), além de dar uma maior flexibilidade ao estrato queratinizado (CODERCH et al., 2003; CHOI et al., 2005; MARSELLA; SAMUELSON, 2009). Esses lipídios são compostos principalmente por ceramidas, colesterol e ácidos graxos livres, sendo a ceramida o componente em maior quantidade, correspondendo a aproximadamente 50% dos lipídios do estrato córneo da pele humana (MASUKAWA et al., 2009), o que a torna crucial na barreira protetora da pele (CODERCH et al., 2003; CHOI et al., 2005). A ceramida do estrato córneo canino apresenta um perfil muito semelhante ao relatado em humanos (POPA et al., 2010). A ceramida é o lipídio mais heterogêneo da epiderme e possui 11 moléculas diferentes (MASUKAWA et al., 2008). O estrato córneo de um indivíduo atópico é bioquimicamente caracterizado por redução da quantidade de ceramidas, especificamente das ceramidas 1 e 9, lipídios sebáceos e aminoácidos hidrossolúveis (REITER et al., 2009). Nesses indivíduos observase também a atividade diminuída da esfingomielinase, tanto na pele não lesionada quanto na pele lesionada, nesta mais significativamente, correlacionando-se com a diminuição de ceramidas e da barreira de proteção da pele. Esse fato está associado ao comprometimento da expressão das proteínas e queratinas do envelope córneo, importantes para a função de barreira da pele (JENSEN et al., 2004). Outro mecanismo que leva à redução da ceramida na pele atópica é a diminuição da biossíntese de glicosilceramida e ceramidas livres

16 9 (MACHELEIDT et al., 2002). Alguns estudos propõem que a deficiência de ceramida está ligada a uma enzima que metaboliza esfingolipídios, denominada esfingomielina/glicosilceramida deacilase, que hidrolisa a esfingomielina ou glicosilceramida, diminuindo sua capacidade de sintetizar ceramidas, em particular a ceramida 1. Esta enzima encontra-se aumentada mais de cinco vezes no estrato córneo lesionado, mais de três vezes no estrato córneo não envolvido e aproximadamente três vezes no estrato córneo de indivíduos com dermatite atópica comparados a indivíduos saudáveis (HARA et al., 2000; IMOKAWA, 2009;). Em cães atópicos, os níveis de ceramidas na pele lesada e também na pele aparentemente não comprometida são menores quando comparados à pele de animais saudáveis (FARTASCH et al., 1992). Um estudo mostrou que essa diminuição se dá especificamente pela redução de ceramida tipo 1 e tipo 9, além de observar um aumento nos valores de colesterol no espaço intercelular quando comparados animais atópicos clinicamente não afetados a animais sadios (REITER et al., 2009); porém, como não foi mensurada a quantidade total de lipídios nesse estudo, os resultados não puderam ser comprovados (MARSELLA et al., 2011). Segundo Reiter, Torres e Wertz (2009) existe, na epiderme dos cães atópicos, uma alteração nos níveis de colesterol, que se encontra significativamente aumentado nesses cães quando comparados a cães normais. Nesse estudo também observou-se que a relação colesterol/ceramidas é significativamente maior nos cães atópicos. Essas alterações ocorrem em resposta à elevada perda de água transepidérmica e aos distúrbios da função da barreira cutânea, fatores que levam ao aumento da síntese de colesterol numa tentativa de restaurar a função da barreira epidérmica. Todos esses achados reforçam a ideia de que o dano da barreira epidérmica constitui um defeito intrínseco que auxilia no processo de desenvolvimento da dermatite atópica. Contudo, não se pode deixar de salientar a importância da imunoglobulina IgE para mediar as reações de

17 10 hipersensibilidade a alérgenos ambientais (OLIVRY et al., 2010; DEBOER, 2010). As mudanças microestruturais da epiderme presentes na dermatite atópica levam a sensação de prurido, dando início a um ciclo de amplificação da resposta inflamatória. O prurido contínuo induz a injúria dos queratinócitos, os quais possuem importantes funções efetoras e determinam a direção da resposta imune tegumentar (NUTTAL et al., 2002; OLIVRY et al., 2005; HOMEY et al., 2006). Quando a barreira cutânea está comprometida, inúmeros alérgenos ambientais, antígenos microbianos e agentes irritantes são difundidos pela via transepidérmica. Estes são reconhecidos, fagocitados e apresentados pelas células de Langerhans aos linfócitos Th2, que por sua vez estimulam a proliferação dos linfócitos B e plasmócitos, responsáveis pela produção abundante de IgE alérgeno-específica. A IgE se distribui pela superfície das células de Langerhans e dos mastócitos, formam imunocomplexos antígeno-anticorpo, realça a capacitação e a apresentação antigênica e a degranulação mastocitária, o que conduz à amplificação da resposta imune, da inflamação e do prurido associado a dermatite atópica (OLIVRY et al., 2005; AKDIS et al., 2006; CORK et al., 2006; MORAR et al., 2006). No processo de desgranulação mastocitária, ocorre liberação de histamina, proteases, citocinas e quimiocinas. Há um fluxo inicial de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos Th2 alérgeno-específicos e células de Langerhans. Com a degranulação dos eosinófilos ocorre a liberação de proteínas que induzem danos epidérmicos e dérmicos. Os linfócitos Th2 também liberam citocinas que promovem a síntese de IgE e aumenta a sobrevida dos eosinófilos (TIZARD, 1998b; OLIVRY et al., 2010). Os microrganismos, o auto-traumatismo e os neuromediadores também contribuem para a inflamação persistente das lesões crônicas. Há um ciclo contínuo de liberação de quimiocinas, que levam ao influxo e ativação de leucócitos e liberação de outros mediadores pró-inflamatórios. A falta de

18 11 regulação pró-inflamatória gera mecanismo seguido por auto-perpetuação da inflamação cutânea (OLIVRY et al., 2010). Concomitantemente, o excesso de citocinas Th2 conduz a uma subexpressão de genes responsáveis pela formação de peptídeos antimicrobianos na pele, como as defensinas, fazendo com que os pacientes com dermatite atópica apresentem maior colonização e tendência a infecções induzidas por fungos e bactérias. Estas infecções contribuem para indução, exacerbação e manutenção da dermatite atópica (FARIAS, 2007), na medida que cerca de um quarto das cepas de Staphylococcus pseudintermedius são capazes de produzir superantígenos, como enterotoxinas, que conduzem à amplificação da resposta imunológica, a eritrodermia e à exacerbação do prurido (GEHRING et al., 2004; OLIVRY et al., 2005; AKDIS et al., 2006). Essa propensão em desenvolver infecções bacterianas secundárias pode ser também explicada pelo fato de os corneócitos dos cães que apresentam dermatite atópica possuírem maior aderência ao Staphylococcus pseudintermedius. Pesquisas demonstraram que a pele inflamada destes animais seria mais acessível aos antígenos estafilocócicos e, além disso, a imunidade mediada por células pode ser deprimida (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996). Supercrescimento e colonização tegumentar com a Malassesia pachydermatis é também frequentemente observada em cães com dermatite atópica. Estas, por sua vez, são capazes de produzir inúmeras enzimas como lipase, galactosidase, glucosidase, hialuronidase, lecitinase, peroxidase, fosfolipase, protease e a urease, as quais induzem a liberação de ácido araquidônico pelos queratinócitos e a ativação da cicloxigenase e lipoxigenase tegumentar, realçando a resposta inflamatória. Além disso, em cães com dermatite atópica, estas enzimas promovem a produção de IgE e agravam a resposta inflamatória e o prurido (GEHRING et al., 2004; CHEN; HILL, 2005; OLIVRY et al., 2005; AKDIS et al., 2006).

19 12 ASPECTOS CLÍNICOS O primeiro sintoma clínico da dermatite atópica é o prurido, em áreas sem lesões visíveis ou com máculas ligeiramente eritematosas. A maioria dos pacientes apresentam lesões secundárias, que ocorrem devido ao autotraumatismo, como escoriações, alopecia auto-induzida, liquenificação e hiperpigmentação (HILLIER, 2008; OLIVRY et al., 2010). O autotraumatismo, inflamação crônica e infecção estafilocócica ou por Malassezia spp secundária podem resultar em alopecia parcial ou completa, pigmentação salivar, pápulas, pústulas, colarinhos epidérmicos e liquenificação. O aparecimento das lesões generalizadas pode ocorrer em 40% dos casos e isso acontece quando há infecção crônica ou infecção secundária, portanto sua manifestação é variável e provavelmente depende da cronicidade da doença, da recorrência das infecções e dos alérgenos envolvidos (HILLIER, 2008; OLIVRY et al., 2010). Na dermatite atópica crônica observa-se a presença de xerose, hiperqueratose, hiperpigmentação e liquenificação tegumentar, geralmente associada à seborréia seca laminar e furfurácea (HILLIER, 2002). A topografia lesional observada é independente da via de exposição ao alérgeno. As áreas do corpo apontadas como as mais acometidas em cães são a face, parte côncava do pavilhão auricular, região cervical ventral, axilas, região inguinal, abdômen, períneo, parte ventral da cauda e extremidades distais dos membros. As regiões periocular e nasal podem refletir a coexistência do prurido atópico com a conjuntivite e rinite, respectivamente. A otite externa também é um achado comumente visto, sendo uma das complicações mais comuns associadas à dermatite atópica em cães. No início é notado apenas eritema na região do pavilhão auricular e, com a progressão da doença, pode ocorrer hiperplasia do epitélio, estenose dos condutos e exsudação ceruminosa (HILLIER, 2008; OLIVRY et al., 2010).

20 13 DIAGNÓSTICO O diagnóstico diferencial da dermatite atópica é bem amplo e dentre as principais exclusões a serem feitas estão a dermatite alérgica a saliva de pulgas, a hipersensibilidade alimentar, as dermatoses parasitárias (acaríases), a dermatite de contato, a foliculite bacteriana e a dermatite por Malassezia. Para diferenciar a dermatite atópica dessas outras afecções dermatológicas são necessários exames complementares (como exame parasitológico por raspado cutâneo, cultura e antibiograma e cultura fúngica) e/ou tratamento (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996; MUELLER, 2008). Segundo Olivry et al. (2010), aproximadamente 75% dos cães atópicos podem apresentar, concomitantemente com a dermatite atópica, dermatite alérgica a saliva de pulgas e hipersensibilidade alimentar. Os componentes alimentares podem desencadear crises atópicas em animais predispostos a tais alérgenos, porém nem todos os cães com dermatite atópica terão a doença exacerbada pela dieta recebida. Os cães diagnosticados com dermatite atópica que apresentam prurido crônico e perene devem ser submetidos a dietas de eliminação para, em seguida, determinar e eliminar alérgenos alimentares que possam dar origem às suas crises. Os testes intradérmicos e sorologia específica para alérgenos IgE não devem ser usados como diagnóstico inicial na dermatite atópica em cães, pois muitos animais normais e atópicos apresentam reações positivas para os testes, diminuindo assim a especificidade de ambos (HILLIER, 2008; OLIVRY et al., 2010). No teste alérgico intradérmico uma reação positiva significa apenas que o animal possui anticorpos sensibilizados na pele, mastócitos que degranulam à exposição antigênica e tecido alvo que responde aos mediadores liberados e não necessariamente que este apresenta alergia aos antígenos injetados. Sendo assim, é fundamental que um resultado positivo seja interpretado de acordo com o histórico do animal. O mesmo é válido para as reações negativas, pois cerca de 10-30% dos cães atópicos são negativos ao teste (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996; HILLIER, 2002).

21 14 Assim como nos testes intradérmicos, os testes alérgicos sorológicos também devem ser interpretados em conjunto com a história clínica do animal, uma vez que um resultado positivo só indica que o animal já sofreu exposição prévia a determinado alérgeno, e não que este é o causador da reação alérgica. Os testes mais utilizados são radioalergossorvente (RAST), ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) e o ensaio imunoenzimático de fase líquida (VARL). Teste sorológico por ELISA para identificação da fração FcE do IgE é o mais utilizado atualmente, por ser mais específico (não ocorre reação cruzada com IgG). (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996; TIZARD, 1998a). Os testes alérgicos intradérmicos e sorológicos são indicados após a doença ser confirmada, com o intuito de determinar os alérgenos ambientais envolvidos, visando formular protocolos de exclusão e o estabelecimento de quais alérgenos podem ser utilizados para imunoterapia alérgeno-específica (MARSELLA, 2006; MUELLER, 2008; OLIVRY et al., 2010). A citologia é uma ferramenta importante para identificar infecções bacterianas e fúngicas associadas à dermatite atópica, além de permitir o controle da evolução da doença e a eficácia terapêutica (FARIAS, 2007; MUELLER, 2008). O exame histopatológico em cães com dermatite atópica revela graus variáveis de dermatite perivascular superficial, espongiótica ou hiperplásica, com predominância de linfócitos e plasmócitos. A eosinofilia pode ser observada, mormente em quadros crônicos, ou quando houver outras comorbidades alérgicas. A presença de neutrófilos e macrófagos sugere infecções secundárias, geralmente piodermite ou malasseziose. Portanto, o exame histopatológico é útil em sugerir que mais diagnósticos estão envolvidos do que fazer um diagnóstico claro de dermatite atópica. Nesse caso em particular a biopsia cutânea revela-se totalmente inespecífica, pois são observadas imagens de inflamação não patognomônicas (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996; DETHIOUX, 2006). Em 1986, Willemse propôs alguns critérios para o diagnóstico da DAC, que foram revisados por Prélaud et al. (1998). Em ambos o animal deve

22 15 apresentar, no mínimo, três sinais de cada categoria (DETHIOUX, 2006; FAVROT, 2010), conforme descrito nos quadros 1 e 2. Mais recentemente, Favrot et al. (2010) descreveram um estudo em larga escala com cães com dermatite atópica, no qual foram comparadas populações de cães com dermatite atópica induzida por alimentos e cães com dermatite atópica não induzida por alimentos. A conclusão é que ambas as condições são clinicamente indistinguíveis e, desse modo, criaram um novo conjunto de critérios para o diagnóstico da DAC (quadro 3), com maior especificidade e sensibilidade que os de Willemse e Prélaud et al. Segundo este estudo, se o paciente apresentar cinco ou mais critérios, pode-se dar um diagnóstico presuntivo de DAC. Esses critérios devem sempre ser somados ao histórico do animal, ao desenvolvimento da doença e às características das lesões para que se possa melhorar sua especificidade (FAVROT, 2010). Quadro 1. Critérios de Willemse. Adaptado de FAVROT et al., Características Principais Características Secundárias Prurido Aparecimento dos sintomas antes de 3 anos de vida Envolvimento facial e/ou digital Eritema facial e queilite Liquenificação da superfície flexora do Conjuntivite bilateral tarso ou superfície extensora do carpo Dermatite crônica ou cronicamente Piodermite estafilocócica superficial recidivante Uma história individual ou familiar de Hiperidrose atopia Predileção racial Reações cutâneas positivas em testes a alérgenos ambientais IgG alérgeno específica elevada IgE alérgeno específica elevada

23 16 Quadro 2. Critérios de Prélaud. Adaptado de FAVROT et al., CRITÉRIOS ATUALIZADOS (PRÉLAUD) Aparecimento dos sintomas entre 6 meses e 3 anos de idade Prurido responsivo a glicocorticóides Pododermatite anterior interdigital bilateral eritematosa Eritema de face interna de pavilhão auricular Queilite Quadro 3. Critérios de Favrot. Adaptado de Olivry et al. (2010). CRITÉRIOS DE FAVROT Início dos sinais clínicos antes dos 3 anos de idade Cães habitam normalmente ambientes internos Prurido responsivo a corticosteróides Prurido como sinal inicial (prurido sem lesão) Patas dianteiras afetadas Pavilhões auriculares afetados Margens de orelhas não afetadas Área dorso-lombar não afetada TRATAMENTO O tratamento da DAC, por se tratar de uma doença multifatorial, baseiase em uma associação de terapias, de modo que o sucesso e controle terapêutico exigem basicamente a restauração da barreira epidérmica e manutenção da hidratação cutânea, o reconhecimento e a minimização da exposição e/ou eliminação dos fatores exacerbadores da inflamação e do prurido atópico, tais como: agentes infecciosos, ectoparasitas, irritantes primários, alérgenos ambientais, trofoalérgenos e fatores emocionais, além da modulação da resposta imunológica e tratamento de possíveis complicações (FARIAS, 2007; OLIVRY et al., 2010).

24 17 Uma importante etapa do tratamento é a minimização dos fatores desencadeantes, tomando-se medidas de controle na tentativa de diminuir a exposição do animal aos alérgenos ambientais. Isso é possível através de medidas de higiene introduzidas no ambiente do animal, como colchões antiácaros, aspiradores de pó com filtros e uso regular de acaricidas (HILLIER, 2002; OLIVRY et al., 2010). Outro passo fundamental é o controle rigoroso de ectoparasitas. Há evidências de que o estado atópico predispõe os cães a desenvolverem hipersensibilidade a antígenos salivares da pulga quando expostos repetidamente a estes. O controle deve ser feito através de adulticidas durante todo o ano, combinado com manejo ambiental correto (SOUSA; HALLIWELL, 2001; OLIVRY et al., 2010). Quando o animal apresenta infecções bacterianas ou fúngicas secundárias, deve-se instituir uma terapia anti-infecciosa, que pode ser sistêmica, tópica ou ambas. As infecções estafilocócicas secundárias são frequentes e podem causar piodermites superficiais ou profundas. A piodermite, dermatite piotraumática ou dermatite por lambedura pode ser encontrada em 68% dos cães atópicos (SIMOU et al., 2005; DETHIOUX, 2006). Infecções causadas por leveduras do gênero Malassezia sp. são frequentemente implicadas na piora do prurido atópico, principalmente em regiões intertriginosas (axila, virilha e interdigital), perilabiais, perianais e nos condutos auditivos (HILLIER, 2002; DETHIOUX, 2006). Na presença de lesões de pele localizadas causadas por infecções bacterianas ou fúngicas é indicado o uso de pomadas, cremes, géis com antisépticos (clorexidina), antibióticos (mupirocina e ácido fusídico) ou medicamentos antifúngicos tópicos (miconazol, clotrimazol, cetoconazol, terbinafina) (OLIVRY et al., 2010). Porém, apesar de a epiderme ser relativamente avascular, estudos sobre infecções cutâneas demonstraram que a via sistêmica de tratamento tem uma resposta melhor que a tópica para todas as infecções, exceto para as infecções de superfície (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996).

25 18 Associações de antibióticos geralmente são desnecessárias. Em casos de infecções superficiais os antibióticos devem ser administrados por 14 a 21 dias e, em infecções mais complexas, por 30 a 60 dias. Dentre os principais antibióticos usados na DAC podemos citar a cefalexina e cefadroxil, enrofloxacina, amoxicilina com clavulanato de potássio, azitromicina, clindamicina, marbofloxacina, azitromicina e cefpodoxima (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996; FARIAS, 2007). Em relação às infecções fúngicas, recomentase o uso de cetoconazol ou o itraconazol (DETHIOUX, 2006). Como a recolonização bacteriana e fúngica após o tratamento sistêmico é comum em cães com DAC, o uso contínuo de produtos tópicos antissépticos ou pulsoterapia são necessários. A pulsoterapia deve ser instituída apenas em casos de infecções recorrentes que não podem ser geridos por outros meios, devido ao alto risco de resistência microbiana (FARIAS, 2007; OLIVRY et al., 2010). A hidratação da pele do animal atópico é essencial, visto que uma das principais características da DAC é a perda de função da barreira epidérmica, o que favorece a penetração de alérgenos ambientais e microrganismos, desencadeando todo o processo inflamatório e sinais clínicos da doença. Para a hidratação utiliza-se produtos hidratantes (como uréia, glicerina, óleo de amêndoas, silicone volátil, hidroviton e extrato glicólico de germe de trigo), emolientes (como extrato glicólico de Aloe vera, óleo de abacate, óleo de girassol, óleo de macadâmia e manteiga de karité) e umectantes (como uréia, propilenoglicol e ácido lático) (FARIAS, 2007; OLIVRY et al., 2010). Banhos semanais com produtos que promovem a hidratação cutânea são provavelmente benéficos, pois além de aumentar a hidratação, causam um efeito calmante direto na pele e ajudam na eliminação física dos alérgenos superficiais e microrganismos (OLIVRY et al., 2010). Quando há presença de infecções secundárias na pele do animal tornase necessário associar aos hidratantes um produto antisséptico, como xampus ou soluções contendo clorexidine, lactato de etila, triclosan e/ou medicamentos

26 19 antifúngicos, como o cetoconazol e miconazol (AKDIS et al., 2006; OLIVRY et al., 2010). Formulações tópicas de lipídios também têm se mostrado bastante eficientes no tratamento da DAC, pois atuam na restauração das anomalias lipídicas dos cães acometidos, reestruturando a barreira epidérmica cutânea (OLIVRY et al., 2010; JUNG et al., 2013; PIEKUTOWSKA et al., 2008). Outros alérgenos que merecem atenção são os alimentares, pois podem ser a causa em cães que apresentem dermatite atópica com sintomas clínicos perenes. Mesmo que tenha sido feita uma dieta de restrição no início do tratamento, ela deve ser reconsiderada em casos de crise, principalmente quando a terapia com glicocorticóides não esteja sendo eficaz. É importante salientar que cães com dermatite atópica frequentemente se sensibilizam e desenvolvem novas alergias, e por esse motivo, devem ser feitos um ou mais ensaios de restrições-provocações alimentares nesses cães (OLIVRY et al., 2007; OLIVRY et al. 2010). Tratamento medicamentoso de manutenção deve sempre ser indicado quando o controle das infecções e ectoparasitos, a minimização contato com irritantes primários, a restauração da função de barreira epidérmica, e o uso de dietas exclusivas com proteínas originais não resultaram em controle da doença. O uso crônico de anti-histamínicos, apesar de amplo, é controverso, e poucos estudos mostraram sua eficácia para o controle do prurido e inflamação em cães (DETHIOUX, 2006; FARIAS, 2007). Clinicamente, os anti-histamínicos tem eficácia limitada, embora se possa argumentar que a resposta limitada possa ser causada, pelo menos em parte, por doses inadequadas(marsella, 2006). Há poucas informações disponíveis sobre a farmacocinética desses fármacos em cães e gatos e, portanto, a maioria das doses foi extrapolada da medicina. É interessante notar que a resposta limitada à terapia antihistamínica tem sido relatada tanto com os anti-histamínicos de primeira quanto com os de segunda geração (MARSELLA, 2006). Esta baixa eficácia dos anti-

27 20 histamínicos anti-h1 pode ser devido à falta de relevância da histamina e/ou falta de receptores H1 na persistência de lesões crônicas de pele. Os antihistamínicos anti-h1 podem ser mais adequados para cães com manifestações leves de lesões cutâneas ou prurido (OLIVRY et al., 2010). Estudos para avaliar a ação dos anti-histamínicos fornecem evidências conflitantes sobre os benefícios da clorfeniramina, clemastina, difenidramina, hidroxizina, prometazina e trimeprazina para o tratamento da DAC. No entanto, efeitos negativos são raros e consistem mais comumente em sonolência. O efeito da combinação de hidroxizina com clorfeniramina foi considerado satisfatório em 24% dos cães (MUELLER, 2008). É essencial lembrar que a resposta aos anti-histamínicos é muito individualizada, e pode ser necessário experimentar diversos antes que um deles seja eleito o melhor para determinado paciente. Além disso, são mais eficientes quando usados como drogas anti-pruriginosas preventivas, pois desta forma, mantêm os receptores H1 em estado inativo, antes de a histamina ser liberada durante uma reação alérgica imediata (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996; OLIVRY et al., 2010). Efeito sinérgicos entre os anti-histamínicos e os ácidos graxos ômega 3 e 6 ou com glicocorticóides tem sido observado em cães; essa associação é indicada com o intuito de diminuir a dose e espaçar o tempo de uso dos glicocorticóides (FARIAS, 2007). Outra terapia que faz parte do tratamento da DAC é o uso de glicocorticoides sistêmicos ou tópicos. Os tópicos são indicados para lesões de pele localizadas e devem ter a frequência e duração adequadas de acordo com a gravidade dos sinais clínicos. Há fortes evidências da alta eficácia dos sprays de triancinolona a 0,015% e do aceponato de hidrocortisona a 0,0584% utilizado, respectivamente, duas vezes ao dia e uma vez ao dia no local das lesões (OLIVRY et al., 2010). O spray de aceponato de hidrocortisona a 0,0584% é conhecido por sua alta potência, boa penetração, rápida inativação na derme e pouca ação sistêmica (BIZIKOVA et al., 2009). Estes tratamentos são destinados apenas

28 21 durante um período limitado, recomenda-se cautela com uso a longo prazo, devido aos efeitos adversos possíveis de ocorrer, que geralmente incluem atrofia tegumentar, comedões, cistos foliculares superficiais, alopecia, piodermite localizada ou demodicidose. Devido seu efeito atrofogênico, os glicocorticóides tópicos podem ser temporariamente indicados para induzir a diminuição das liquinificações das lesões cutâneas crônicas (DETHIOUX, 2006; OLIVRY et al., 2010). No caso de lesões mais extensas ou mais graves é indicado o uso de glicocorticoides sistêmicos, que possuem efeitos satisfatórios no controle do prurido e dos sintomas clínicos (OLIVRY; MUELLER, 2003; OLIVRY et al., 2010). Deve-se optar por moléculas menos tóxicas, ou seja, de menor potência, como a prednisona e prednisolona, cujo efeito mineralocorticoide é quase que inexistente (DETHIOUX, 2006). Após o animal sair da crise da DAC, a frequência do uso de corticoides deve ser reduzida e espaçada até que se encontre um equilíbrio entre minimização dos sintomas clínicos e efeitos colaterais indesejáveis dos glicocorticoides (FARIAS, 2007). Uma alternativa ao uso de glicocorticoides é a utilização tópica ou sistêmica de outros imunomoduladores/supressores, como a ciclosporina, que age inibindo a calcineurina e, consequentemente, a liberação de citocinas, modulando a proliferação de células T e ativação e apresentação de antígenos. A ciclosporina também inibe a função e sobrevida dos eosinófilos, diminui o número de células de Langerhans na epiderme e inibe as funções de ativação de linfócitos pelas células apresentadoras de antígeno. Seus efeitos satisfatórios podem ser observados após 30 dias de uso contínuo, devendo ser inicialmente associadas a anti-histamínicos ou a glicocorticóides orais (GUAGUÈRE; STEFFAN; OLIVRY et al., 2005). Efeitos colaterais da ciclosporina são observados frequentemente, porém são intermitentes e de gravidade leve a moderada (OLIVRY; MUELLER, 2003). Dentre os efeitos colaterais podemos citar: êmese e diarréia, hiperplasia e papilomatose gengivais, bacteriúria, infecções cutâneas bacterianas, anorexia, nefropatia, supressão da medula óssea e dermatose linfoplasmocitóide (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996).

29 22 Com o objetivo de auxiliar na reposição da barreira cutânea e minimizar a hiperreatividade tegumentar, são utilizados suplementos com ácidos graxos essenciais que competem com o ácido araquidônico que, por sua vez, serve como substrato para a lipoxigenase e cicloxigenase, convertendo esses ácidos em prostaglandinas e os leucotrienos não inflamatórios. Os ácidos graxos mais utilizados são o ômega 3, que inclui o α-ácido linolênico, ácido eicosapentaenóico e ácido docosahexaenóico; e o ômega 6, que inclui o γ- ácido linoléico e o ácido linoléico (DETHIOUX, 2006; STEHLE et al., 2009). Os efeitos da suplementação com ácidos graxos só aparecem após três a seis meses de uso, mas estes pouco tem efeito como terapia isolada, de modo que seu uso deve ser concomitante ao usos de anti histamínicos, glicocorticóides e/ou ciclosporina. (DETHIOUX, 2006). Outro tratamento que pode ser instituído para a DAC é a imunoterapia alérgeno-específica (dessensibilização), que consiste em um tratamento biológico que envolve a administração por via parenteral de crescentes doses múltiplas de antígenos (alérgenos) aos quais o animal é sensível. A dessensibilização é indicada aos animais que apresentam prurido moderado a intenso e não sazonal, que não respondem adequadamente a terapia sintomática e à exclusão ambiental, ou que manifestam efeitos colaterais inaceitáveis ao tratamento convencional (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 1996; HILLIER, 2002). Em cães a verdadeira eficácia da imunoterapia alérgeno-específica é desconhecida. Como se trata de terapia a longo prazo muitos pacientes necessitam de medicação adicional, e como cada paciente tem seu conjunto único de alérgenos, bem como eventualmente um protocolo único de administração, maximizar a taxa de sucesso, em uma avaliação científica é difícil. Espera-se que cerca de 50% a 80% dos animais com duração do tratamento de seis a doze meses apresentem uma melhora nos sintomas e/ou diminuição no uso de antiinflamatórios ou antipruriginosos (FARIAS, 2007; MUELLER, 2008; OLIVRY et al., 2010). Os principais efeitos colaterais relacionados à dessensibilização são edema, eritema, dor e prurido no local da aplicação, aumento de prurido,

30 23 vômito, ansiedade, diarréia, urticária e angioedema, devendo o animal ser monitorado no mínimo uma hora após a aplicação (HILLIER, 2002). Em pacientes cuja DAC é agravada por fatores psicossomáticos e doenças psicogênicas indica-se o uso de antidepressivos e ansiolíticos. Os fármacos mais usadas são hidroclorado de doxepina e a amitriptilina (FARIAS, 2007). A pentoxifilina pertence à classe dos inibidores da fosfodiesterase e pode ser usada para reduzir a dose dos glicocorticoides, pois age em sinergismo com estes na inibição da produção de citocinas, porém possuem eficácia moderada (FARIAS, 2007; OLIVRY et al., 2010) TÉCNICAS DE MENSURAÇÃO DE LIPÍDIOS DA EPIDERME As técnicas histoquímicas que permitem a detecção de lipídios em amostras histológicas são limitadas, visto não poderem ser aplicadas em material submetido ao processamento habitual e a inclusão em parafina, pois as gorduras são extraídas pelo xilol e outras soluções utilizadas, o que limita sua aplicação aos cortes por congelação (ALVES, 2002). As principais deficiências apontadas nos corantes gerais de evidenciação de lipídios estão relacionadas com o fácil descoramento das preparações histológicas e a cristalização. A cristalização ocorre devido à ação desidratante dos preparados utilizados na montagem das lâminas e também das soluções saturadas do corante. A heterogeneidade da coloração das amostras pode ter utilidade prática, visto que gorduras normais e patológicas podem apresentar diferença tintorial pela composição química variada, facilitando o diagnóstico (NEVES, 1976). Na coloração com hematoxilina e eosina os lipídios são perdidos durante o processamento histológico e os vacúolos são identificados por um espaço em branco no interior da célula (ROBBINS & COTRAN, 2005).

31 24 Os corantes do tipo Sudan são substâncias que detectam lipídios celulares incluindo gorduras neutras, fosfolipídios e esteróis, pois são corantes provenientes de pigmentos lipossolúveis. Eles são capazes de corar e identificar lipídios presentes em inúmeras células, devido à sua capacidade de dissociação de seu corante e penetração no complexo lipoprotéico. Esses corantes são importantes na mensuração de lipídios em células hematopoiéticas, bem como no auxílio da determinação da origem de células neoplásicas. Também tem sido utilizado na citologia diagnóstica, de lipídios intercelulares epidérmicos, para detecção de problemas relacionados à dermatite atópica (SONNENWIRTH et al., 1980). O Sudan Red (benzeno-azobenzenoazobetanaftol) foi introduzido na histotécnica em 1896 (DADDI, 1953). Na técnica original o corante é dissolvido, em partes iguais, de álcool a 70% e acetona até a saturação da mistura (LILLIE, 1954). O corante é solúvel ao mesmo tempo no álcool e nos lipídios. O álcool dissolve o corante em boa proporção, mas solubiliza parte do lipídio, e a água não dissolve o corante e nem o lipídio, mas mistura-se bem ao álcool (CASTRO, 1955). O Sudan IV cora os lipídios em vermelho-alaranjado e é predominantemente utilizado para demonstrar triglicerídeos em secções congeladas (ROBBINS & COTRAN, 2005). O Oil Red O é usado com a mesma função dos corantes de Sudam. Sua solução consiste basicamente em 0,7g de Oil Red O com solução de propilenoglicol 85%. Os cortes devem ser fixados em formalina 10%, passados em um minuto pela hematoxilina e posteriormente fixado em glicerina. O Oil Red O é um corante para lipídios análogo ao Sudan Red e ao Escarlate R, que se dissolvem no lipídio neutro presente nas secções histológicas. As secções histológicas devem ser feitas em micrótomo de congelação ou criostato, a partir de material fresco ou fixado em formol, mas não processado para inclusão em parafina (pois os solventes orgânicos tais como o álcool e o xilol removem os lipídios) (CROCKHAM & DAPSON, 1991).

32 REPOSIÇÃO TÓPICA DE LIPÍDIOS E CERAMIDAS Baseados no fato de que a principal causa do comprometimento da barreira epidérmica nos cães com dermatite atópica é a reduzida quantidade de lipídios no espaço intercelular no estrato córneo, estudos têm testado a eficácia da reposição de lipídios com tratamento tópico a base de produtos hidratantes. Em 2008, Piekutowska et al. avaliaram a eficácia de um produto para aplicação tópica contendo ceramidas, ácidos graxos livres e colesterol em animais com dermatite atópica, no qual puderam observar, por meio da microscopia eletrônica, uma significativa melhora na epiderme dos cães com dermatite atópica após o tratamento. Onde antes da aplicação havia um espaço amplo e vazio entre os corneócitos, que se apresentavam estruturalmente danificados, as lamelas lipídicas se encontravam esparsas, mal organizadas e fragilizadas, após o tratamento havia abundância de corpos lamelares, os corneócitos estavam mais organizados e a quantidade de lamelas lipídicas no espaço intercelular se aproximava muito a dos animais saudáveis analisados. Além disso, Piekutowska et al. (2008) também relataram que mesmo a pele não lesionada dos animais atópicos apresenta lamelas lipídicas desorganizadas e em quantidade reduzida. Em outro estudo semelhante (JUNG et al., 2013) que utilizou uma mistura semelhante a acima descrita, com apenas duas semanas de aplicação já foi possível observar, pela microscopia eletrônica, um aumento na quantidade de lipídios na epiderme e grande melhora na integridade dos corneócitos, além de melhora clínica nas lesões, na hidratação da pele e no grau de prurido dos animais com dermatite atópica. Esses resultados se deveram ao aumento na produção de lipídios endógenos causado pelo uso tópico do complexo lipídico, o que leva a uma melhora da barreira epidérmica e consequente melhora dos sintomas clínicos, como relatado por Fujimura et al. (2011), que após o tratamento tópico com o complexo lipídico observaram redução do eritema, da liquenificação, da alopecia e da escoriação.